基于響應(yīng)面分析法優(yōu)化蠶蛹總黃酮的提取工藝研究

劉開(kāi)莉 梁貴秋 許忠裕 周曉玲 肖 瀟 陸春霞*

(1.廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術(shù)推廣總站，南寧市 530007；2.廣西壯族自治區(qū)農(nóng)業(yè)科學(xué)院，南寧市 530007)

隨著蠶桑業(yè)的發(fā)展，蠶蛹也不斷被人研究，其食用價(jià)值、醫(yī)藥價(jià)值以及其他領(lǐng)域的利用率相當(dāng)高[1]。兩廣二號(hào)是廣西當(dāng)前主要的家蠶品種，是由廣東省農(nóng)科院蠶業(yè)所與廣西壯族自治區(qū)蠶業(yè)技術(shù)推廣總站(原廣西蠶業(yè)指導(dǎo)所)合作共同選育的品種，1996年通過(guò)全國(guó)農(nóng)作物品種審定委員會(huì)審定[2]。兩廣二號(hào)家蠶品種適合多個(gè)地區(qū)推廣飼養(yǎng)，具有體質(zhì)強(qiáng)健、抗病性強(qiáng)、好飼養(yǎng)等優(yōu)點(diǎn)[3]。其蠶蛹更是具有很高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，含有豐富的蛋白質(zhì)、不飽和脂肪酸、黃酮類化合物、多酚等營(yíng)養(yǎng)和活性成分[4]。生物總黃酮是指黃酮類化合物，是一類天然的產(chǎn)物，在植物界廣泛存在，是一類極具開(kāi)發(fā)價(jià)值的化合物[5]。方洪帥等[6]通過(guò)提取葛根總黃酮對(duì)患有糖尿病的小鼠進(jìn)行灌胃測(cè)定空腹血糖含量，表明總黃酮具有降血糖作用。黃酮類化合物還具有抗衰老、抗腫瘤、抗氧化以及保護(hù)心血管和肝臟等生理作用[7]。

總黃酮的提取方法有溶劑提取法[8]、超聲提取法[9]、酶制取法[10]等，本研究以兩廣二號(hào)品種家蠶為研究對(duì)象，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，利用響應(yīng)面分析法[11]優(yōu)化蠶蛹總黃酮提取工藝，并選出最佳工藝測(cè)定蠶蛹總黃酮含量。通過(guò)研究，為蠶蛹的食藥功能和工藝研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蠶蛹：廣西市售兩廣二號(hào)鮮蛹；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、無(wú)水乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉：國(guó)產(chǎn)分析純；實(shí)驗(yàn)用水純水，實(shí)驗(yàn)室自制。

1.2 儀器與設(shè)備

分析天平(JA3003，上海舜宇恒平科學(xué)儀器有限公司)，數(shù)控超聲波清洗器(JK-450DB，合肥金尼克機(jī)械制造有限公司)，紫外-可見(jiàn)分光光度計(jì)(TU-1810PC,上海光譜儀器有限公司)，數(shù)顯恒溫水浴鍋(HH-S2，金壇市易晨?jī)x器制造有限公司)

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 樣品處理

鮮蛹經(jīng)過(guò)60 ℃恒溫干燥至恒重后，粉碎成粉，用索氏抽提法進(jìn)行脫脂，直至磨砂玻璃棒上無(wú)油斑表明抽提完畢[12]。準(zhǔn)確稱取0.1 g(精確到0.001 g)脫脂蠶蛹粉，加入一定體積的乙醇溶液，在100 w功率下超聲波處理一定的時(shí)間后，放于恒溫水浴鍋中抽提3 h，放置冷卻過(guò)濾得到的澄清液即為試樣液。

1.3.2 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取20 mg蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品于50 mL的75%乙醇溶液中溶解，定容至100 mL，即蘆丁濃度為0.2 mg/mL。準(zhǔn)確吸取0 mL、0.5 mL、1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL標(biāo)準(zhǔn)溶液，用75%乙醇溶液定容至5 mL，加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻靜置6 min，加入0.3 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻靜置6 min，加入4 mL 1 mol/L的氫氧化鈉溶液，搖勻充分反應(yīng)15 min。蘆丁質(zhì)量分別為：0 mg、0.1 mg、0.2 mg、0.3 mg、0.4 mg、0.5 mg。以質(zhì)量為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見(jiàn)圖1)，計(jì)算得回歸方程：A=0.5389x+0.0423，R2=0.9979。

1.3.3 蠶蛹總黃酮含量的測(cè)定

準(zhǔn)確移取1 mL待測(cè)樣品液，按照標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定待測(cè)液的吸光度值，由回歸方程計(jì)算出蠶蛹總黃酮的含量。

1.4 單因素試驗(yàn)與響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

1.4.1 單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用單因素試驗(yàn)，分別考察料液比(1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80，g/mL)、水浴提取溫度(40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃)、超聲提取時(shí)間(20 min、30 min、45 min、60 min、75 min)、乙醇濃度(30%、45%、55%、65%、75%)等因素對(duì)蠶蛹總黃酮含量的影響，每個(gè)單因素試驗(yàn)做3次重復(fù)。

1.4.2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)

參考單因素試驗(yàn)的結(jié)果分析，選取料液比A(1∶60、1∶70、1∶80，g/mL)、水浴提取溫度B(60 ℃、70 ℃、80 ℃)、超聲提取時(shí)間C(20 min、30 min、45 min)、乙醇濃度D(30%、45%、55%)等(如表1)，運(yùn)用Design-Expert8.06軟件設(shè)計(jì)進(jìn)行響應(yīng)面試驗(yàn)并分析，確定蠶蛹總黃酮提取的最佳工藝。

表1 響應(yīng)面試驗(yàn)因素與水平

1.5 響應(yīng)面試驗(yàn)驗(yàn)證

重復(fù)3次試驗(yàn)驗(yàn)證正交試驗(yàn)得到的最佳工藝，分析計(jì)算蠶蛹總黃酮的提取含量，并求出相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，以確保最佳條件的科學(xué)性和穩(wěn)定性。

1.6 數(shù)據(jù)分析

單因素試驗(yàn)數(shù)據(jù)采取直觀分析法分析，確定各因素對(duì)蠶蛹總黃酮含量影響的參數(shù)區(qū)間。在單因素的基礎(chǔ)上，采用Design-Expert8.06軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果分析

2.1.1 料液比對(duì)蠶蛹總黃酮含量的影響

按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在料液比分別為1∶40、1∶50、1∶60、1∶70、1∶80(g/mL)時(shí)，考察料液比對(duì)蠶蛹總黃酮含量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖2可知：當(dāng)溶劑從1∶40(g/mL)增加到1∶80(g/mL)時(shí)，總黃酮含量逐漸增加，在1∶70(g/mL)時(shí)，蠶蛹總黃酮含量達(dá)到最大5.28 mg/g，溶劑增大至料液比1∶80(g/mL)以后，蠶蛹總黃酮的含量趨于下降趨勢(shì)且不再上升。一般來(lái)說(shuō)，溶劑增加有利于蠶蛹總黃酮的提取，含量也增加，到達(dá)一定的量時(shí)，總黃酮已充分提取，過(guò)多溶劑只會(huì)造成溶劑和能源的浪費(fèi)。故選擇料液比為1∶70(g/mL)。

2.1.2 水浴提取溫度對(duì)蠶蛹總黃酮含量的影響

按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)，分別在提取溫度分別為40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃時(shí)，考察水浴提取溫度對(duì)蠶蛹總黃酮含量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖3可知：隨溫度的升高，總黃酮含量先增加再下降，在溫度為70 ℃時(shí)，總黃酮含量達(dá)到最大8.27 mg/g。其原因可能是溫度過(guò)高，使總黃酮成分發(fā)生變化，導(dǎo)致含量降低。故選擇提取溫度為70 ℃。

2.1.3 超聲提取時(shí)間對(duì)蠶蛹總黃酮含量的影響

按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在提取時(shí)間分別為20 min、30 min、45 min、60 min、75 min時(shí)，考察超聲提取時(shí)間對(duì)蠶蛹總黃酮含量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4可知：隨提取時(shí)間的增加，總黃酮含量呈現(xiàn)先增加后下降的趨勢(shì)，在提取30 min時(shí)達(dá)到最大值9.14 mg/g。提取時(shí)間增加，總黃酮含量趨于平緩且有下降趨勢(shì)，其原因可能是時(shí)間過(guò)長(zhǎng)，使總黃酮成分發(fā)生變化而導(dǎo)致含量降低。綜合考慮，選擇提取時(shí)間為30 min。

2.1.4 乙醇濃度對(duì)蠶蛹總黃酮含量的影響

按照試驗(yàn)設(shè)計(jì)，在乙醇濃度分別為30%、45%、55%、65%、75%時(shí)，考察乙醇濃度對(duì)兩廣二號(hào)家蠶蠶蛹總黃酮含量的影響，結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖5可知，隨著乙醇濃度的升高，總黃酮含量呈先上升后平穩(wěn)下滑的趨勢(shì)，在45%時(shí)達(dá)到最大5.73 mg/g。乙醇濃度繼續(xù)升高，總黃酮含量下降，其原因可能是乙醇含量的增加使總黃酮提取率下降。故選擇乙醇濃度為45%。

2.2 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果與分析

響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析結(jié)果見(jiàn)表3。響應(yīng)面試驗(yàn)共有27個(gè)試驗(yàn)點(diǎn)，其中22個(gè)析因點(diǎn)，5個(gè)中心點(diǎn)。應(yīng)用響應(yīng)面分析試驗(yàn)結(jié)果，得到以蠶蛹總黃酮含量為響應(yīng)面的回歸方程為：

總黃酮含量=4.43-0.81A+0.51B+0.25C+1.55D-0.87AB-0.24AC-2.27AD+0.052BC-0.57BD-0.65CD+0.81A2-0.240B2+0.078C2+0.91D2

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)設(shè)計(jì)與結(jié)果

表3 蠶蛹總黃酮回歸模型的方差分析結(jié)果

由表3方差分析結(jié)果可知，模型P<0.0001，說(shuō)明回歸模型極顯著；失擬項(xiàng)(P=0.2125>0.01)不顯著，說(shuō)明模型擬合效果好，可信度高；模型相關(guān)系數(shù)=0.9854與調(diào)整確定系數(shù)=0.9708相差較近，說(shuō)明該模型擬合程度好，可以用于指導(dǎo)蠶蛹總黃酮提取試驗(yàn)設(shè)計(jì)。各因素對(duì)總黃酮含量的影響由大到小順序依次為乙醇濃度、料液比、水浴提取溫度、超聲提取時(shí)間。4個(gè)因素對(duì)蠶蛹總黃酮含量的影響均達(dá)極顯著。通過(guò)圖6各因素交互作用對(duì)蠶蛹總黃酮含量影響的響應(yīng)面等高線圖和三維圖，可直觀地反應(yīng)各因素對(duì)響應(yīng)值總黃酮含量的影響，并可以分析出各因素之間相互作用。

由圖6各因素交互作用對(duì)蠶蛹總黃酮含量影響的等高線圖和三維響應(yīng)面圖可知，料液比與水浴提取溫度的交互作用、料液比與乙醇濃度的交互作用、水浴提取溫度與乙醇濃度的交互作用、超聲提取時(shí)間與乙醇濃度的交互作用對(duì)蠶蛹總黃酮含量有顯著影響；料液比與超聲提取時(shí)間的交互作用、水浴提取溫度與超聲提取時(shí)間的交互作用對(duì)總黃酮的含量影響不顯著。

經(jīng)過(guò)Design-Expert8.06軟件分析，可以得出蠶蛹總黃酮提取的最佳條件為：料液比1∶60，水浴提取溫度79 ℃，超聲提取時(shí)間20 min，乙醇濃度55%,預(yù)測(cè)蠶蛹中總黃酮含量為10.54 mg/g。

2.3 優(yōu)化檢測(cè)條件驗(yàn)證試驗(yàn)

為了驗(yàn)證優(yōu)化檢測(cè)條件的穩(wěn)定性和可靠性，按上述最佳檢測(cè)條件進(jìn)行了3次重復(fù)性試驗(yàn)，得到蠶蛹中總黃酮含量分為10.54 mg/g、10.50 mg/g、10.58 mg/g，平均值為10.54 mg/g，與預(yù)測(cè)值10.54 mg/g相比，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為0.30%。結(jié)果表明此工藝可靠、穩(wěn)定。

3 結(jié) 論

本研究采取單因素結(jié)合響應(yīng)面試驗(yàn)的方法，在考察料液比、水浴提取溫度、超聲提取時(shí)間、乙醇濃度分別對(duì)蠶蛹總黃酮含量影響的基礎(chǔ)上，采用Design-Expert8.06軟件的中心組合設(shè)計(jì)方法設(shè)計(jì)響應(yīng)面試驗(yàn)，得到各因素對(duì)蠶蛹總黃酮含量影響的大小順序依次為乙醇濃度、料液比、水浴提取溫度、超聲提取時(shí)間。優(yōu)化蠶蛹總黃酮檢測(cè)的最佳條件為料液比1∶60、提取溫度79 ℃、提取時(shí)間20 min、乙醇濃度55%。在該檢測(cè)條件下，蠶蛹中總黃酮含量為10.54 mg/g。本研究為兩廣二號(hào)蠶蛹總黃酮的檢測(cè)以及開(kāi)發(fā)利用提供了有利依據(jù)。