共刺激因子B7 同源體4 蛋白在膽囊腺瘤和膽囊腺癌中的表達

郭偉，陳小爽，王曉磊，展鵬遠

膽囊腺瘤癌變率約1.5%，是公認的膽囊腺癌癌前病變。B7-H4 蛋白于多種惡性腫瘤中表達，許多研究揭示B7-H4 在多種人類實體腫瘤中過表達，表達水平與病人預后不良和臨床轉(zhuǎn)歸差密切相關，推測其參與了腫瘤的免疫逃避。本研究運用免疫組織化學法（免疫組化），分別檢測膽囊腺瘤和膽囊腺癌中B7-H4 蛋白的表達，對其在膽囊腺瘤惡變過程中有無意義進行探討。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取河南大學第一附屬醫(yī)院2005年6 月至2015 年6 月符合條件膽囊腺癌病例共58例；其中女性36 例、男性22 例；年齡范圍為32～81歲，中位年齡為61歲；WHO 2010年版膽囊癌病理分型：腺癌（乳頭狀型）33例，腺癌（硬化型）13例，腺癌（管狀型）7 例，腺癌（黏液型）5 例；高分化（Ⅰ級）12例，中分化（Ⅱ級）29 例，低分化（Ⅲ級）17 例；AJCC（美國癌癥聯(lián)合委員會）和UICC（國際抗癌聯(lián)盟）聯(lián)合制定的膽囊癌TNM 分期（2015 年）：其中Ⅰ期10例，Ⅱ期5 例，Ⅲ（A+B）期16 例，Ⅳ（A+B）期27 例。對照組選取同期膽囊腺瘤40 例。58 例膽囊癌病人的1 年生存率41.86%，2 年生存率25.58%，3 年生存率5.7%，中位生存時間6.5 個月。本研究中病例均得到病人或其近親屬知情同意，研究符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》相關要求。

1.2 納入標準

①膽囊腺瘤病理明確；②膽囊腺癌病理明確；③臨床資料及隨訪資料完整；④膽囊腺癌術前無抗癌措施。

1.3 主要試劑和實驗方法

主要試劑：mouseB7-H4 MAb（克隆號297219），Rat IgG2B，美國R&D 公司（蘇州瑞諾德生物科技有限公司分包）；通用型超敏S-P免疫組化染色試劑盒。

實驗方法：采集標本玻片，同等條件免疫組化染色。玻片制作流程：10%甲醛溶液固定；石蠟固定后包埋；4 μm切片；乙醇脫水；二甲苯透明。

1.4 結(jié)果判定標準

陽性細胞為胞膜和（或）胞質(zhì)中出現(xiàn)定位良好的黃棕色顆粒，且染色高于背景者。以磷酸鹽緩沖鹽水代替一抗作陰性對照。依據(jù)陽性細胞占比和染色強度判讀結(jié)果：a 按染色細胞占比計算分數(shù)（1分＝陽性細胞數(shù)＜1∕3；陽性細胞數(shù)1∕3＜2分＜陽性細胞數(shù)2∕3；3分＝陽性細胞數(shù)≥2∕3）。b 按染色深淺記算分數(shù)（0 分＝無染色：淺黃染色記1分；棕黃染色記2分；棕褐染色記3分）。積分數(shù)＝a×b。陰性：積分數(shù)＝0。陽性：積分數(shù)＝0＜（+）≤積分數(shù)＝2；積分數(shù)＝2＜（++）≤積分數(shù)＝4；積分數(shù)＝4（+++）≤積分數(shù)＝9。

1.5 統(tǒng)計學方法

應用SPSS 17.0進行本研究數(shù)據(jù)分析。兩指標間關聯(lián)分析：采用四格表χ檢驗。多組資料間的兩兩比較：采用行×列χ檢驗。生存率統(tǒng)計分析：采用Kaplan-Mier，Log rank 檢驗。結(jié)果判讀以α＝0.05（雙側(cè)）檢驗水準，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 B7-H4分別在癌旁正常組織、膽囊腺瘤和膽囊腺癌中的表達

免疫組化顯示：B7-H4 蛋白主要染色于組織細胞的胞膜、胞漿和（或）胞核中。B7-H4蛋白在慢性膽囊炎、癌旁正常組織、腺瘤、腺癌組織中表達率分別為0.00%、0.00%、15.00%、67.24%。慢性膽囊炎（圖1A）和癌旁正常組織（圖1B）無表達；在腺瘤階段以胞膜為主，同時也存在胞質(zhì)表達（圖1C）；在腺癌階段同時存在核表達、胞質(zhì)及胞膜表達（圖1D）。

2.2 B7-H4 蛋白在膽囊腺瘤和膽囊腺癌中的表達

B7-H4 蛋白在膽囊腺瘤的陽性表達率15.00%（6∕40），在膽囊腺癌陽性率為67.24%（39∕58），差異有統(tǒng)計學意義（χ＝26.017，P＜0.05）。

圖1 膽囊切除標本的共刺激因子B7同源體4蛋白的檢測結(jié)果：A為慢性膽囊炎（SP×40）；B為癌旁正常組織（SP×40）；C為膽囊腺瘤（SP×200）；D為膽囊腺癌（SP×200）

2.3 B7-H4蛋白在膽囊腺癌分級中的表達

B7-H4蛋白在膽囊腺癌低-中分化組的陽性表達率69.44%（25∕36），高分化組的陽性表達率33.33%（4∕12），差異有統(tǒng)計學意義（χ＝4.907，P＝0.027）。

2.4 B7-H4蛋白在膽囊腺癌分期中的表達

B7-H4蛋白在膽囊腺癌TNM（Ⅰ+Ⅱ）中陽性表達率86.67%（13∕15），在膽囊腺癌TNM（Ⅲ+Ⅳ）中陽性表達率60.47%（26∕43），差異無統(tǒng)計學意義（χ＝2.379，P＝0.123）。

2.5 B7-H4蛋白在膽囊腺癌中陽性表達與相關影響因素的分析

B7-H4蛋白陽性表達在年齡和性別差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。B7-H4 蛋白陽性表達在伴膽囊結(jié)石、腫瘤長徑和有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移中差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

2.6 生存分析

Kaplan-Meier生存分析，膽囊腺癌病例中B7-H4 蛋白陽性表達組中位生存期為26 月，95%CI：20.661～31.339，B7-H4蛋白陰性表達組中位生存期為22月，95%CI：6.359～37.641。Log-Rank（Mantel-Cox）顯示：B7-H4蛋白表達陽性組與表達陰性組3年生存期差異無統(tǒng)計學意義（χ＝0.187，P＝0.665）。

表1 膽囊腺癌58例B7同源物4（B7-H4）蛋白表達結(jié)果與影響因素的分析∕例

3 討論

膽囊腺瘤是公認的膽囊腺癌的癌前病變。目前認為女性、年齡≥50歲和直徑≥1 cm是其癌變的高危因素，膽囊壁增厚和合并膽囊結(jié)石是其癌變的獨立危險因素。但癌變機制尚不清楚。

B7 家族是唯一從抗原遞呈細胞單向傳遞信號到T 細胞的刺激因子，對激活或者抑制T 細胞免疫應答十分重要。其中B7-H4 的基因組DNA 定位于第1 號染色體上，由6 個外顯子和5 個內(nèi)含子組成。B7-H4 mRNA 廣泛分布于正常組織中，但通過免疫組化法檢測正常人的肝、腎、胰腺、卵巢、腸道等組織中均未見陽性結(jié)果，表明正常的外周組織可能在翻譯水平上對B7-H4的表達進行嚴密的調(diào)控，而在包括膀胱癌、乳腺癌、卵巢癌、肝癌、前列腺癌、食管癌、宮頸癌、肺腺癌、喉癌、結(jié)直腸癌等多種人類實體腫瘤中過表達，且表達水平與病人預后不良和惡性轉(zhuǎn)歸密切相關，提示B7-H4可能在惡性腫瘤中的發(fā)生中發(fā)揮作用。作為免疫調(diào)節(jié)蛋白B7 家族一員，B7-H4 與特異性受體BTLA 分子結(jié)合，能顯著抑制T 細胞增殖分裂，阻遏細胞周期連續(xù)進行，促進T細胞凋亡，從而在腫瘤免疫中起抑制作用。Choi IH 等研究顯示B7-H4 在大多數(shù)正常組織細胞中不表達或低表達，相反在85%卵巢癌和31%肺癌組織中陽性表達，其研究表明：B7-H4 在正常外周組織的翻譯水平上表達受到嚴格調(diào)控，B7-H4 可能在逃避腫瘤免疫方面發(fā)揮作用。Liu WH 等研究顯示B7-H4 的異常表達可能使本來正常的巨噬細胞擁有了抑制功能，使其可能在膀胱尿路上皮細胞癌細胞逃避免疫系統(tǒng)的攻擊中發(fā)揮一定作用。Meng Z等和廖林虹、于曉紅研究亦顯示B7-H4在多種惡性腫瘤中有很高的表達比例，而在正常組織中的低表達或缺失蛋白的表達。何濤等研究顯示過表達B7-H4可導致腫瘤細胞侵襲及轉(zhuǎn)移能力增加，并發(fā)現(xiàn)該過程可能與細胞的EMT轉(zhuǎn)化PI3K∕AKT通路激活有關，同時也發(fā)現(xiàn)，B7-H4與CXCL-12趨化因子及其受體的轉(zhuǎn)錄及蛋白表達有關，B7-H4表達被下調(diào)后，細胞侵襲能力也隨之下調(diào)。Zhang C 等發(fā)現(xiàn)B7-H4 能夠抑制B7-CD28 的共刺激作用和抑制T細胞分泌IL-10和INF-1等因子。Abadi等發(fā)現(xiàn)，剔除B7-H4基因小鼠可顯著抑制乳腺癌細胞的肺轉(zhuǎn)移。以上證據(jù)表明，B7-H4可抑制T細胞介導的抗腫瘤免疫應答，因此，B7-H4 可能作為治療某些腫瘤尤其是高表達B7-H4 的惡性腫瘤的潛在靶點。

本研究亦顯示：B7-H4 蛋白在膽囊腺瘤及膽囊腺癌中均有陽性表達，并且在膽囊腺癌中表達明顯高于膽囊腺瘤；B7-H4 的蛋白陽性表達與膽囊腺癌的分化程度有關，其表達在低、中分化組與高分化組的陽性表達差異有統(tǒng)計學意義，但本研究并未觀察到低、中分化組之間的差異，可能與本研究人數(shù)較少有關，今后增加研究人數(shù)，分析其相關性。B7-H4的蛋白陽性表達與膽囊結(jié)石、腫瘤長徑及有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關，但與膽囊病理分期、年齡、性別無相關；膽囊腺癌中有無表達在3 年生存率方面差異無統(tǒng)計學意義。

綜上分析，提示B7-H4 蛋白可能在膽囊腺瘤惡變?yōu)槟懩蚁侔┑钠鹗及l(fā)生中發(fā)揮作用，并使惡性程度升高，其機制有待我們進一步研究。