不同產(chǎn)地佛手的香葉木苷及橙皮苷含量同時(shí)測(cè)定法

魏瑩，肖莉，楊蘭，廖思維，李艷平，張建武

佛手為臨床常用理氣藥，具有疏肝理氣，和胃止痛，燥濕化痰的作用，來源于蕓香科植物佛手的干燥果實(shí)；常用于治療肝胃氣滯、胸脅脹痛、咳嗽痰多、胃脘痞滿等癥。佛手主要含有多糖類、揮發(fā)油類、香豆素類、酚酸類和黃酮類等多種生理活性物質(zhì)。佛手中黃酮類成分除了橙皮苷外，還包括香葉木苷、胡蘿卜苷、3，5，6-三羥基-3’，4’，7-三甲氧基黃酮、3，5，6-三羥基-4’，7-二甲氧基黃酮等。文獻(xiàn)報(bào)道，香葉木苷具有良好的生物學(xué)活性，有促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)；誘導(dǎo)大鼠肝微粒體P450酶；抗凝血和抗靜脈血栓形成；抗腫瘤等作用。中國(guó)藥典以黃酮中的橙皮苷含量作為質(zhì)量控制指標(biāo)。但尚未見對(duì)佛手香葉木苷、橙皮苷同時(shí)測(cè)定方法的相關(guān)報(bào)道。本研究于2015年9月至2018年6月建立同時(shí)測(cè)定佛手藥材中香葉木苷、橙皮苷的含量測(cè)定方法，可為更好地控制佛手藥材的質(zhì)量提供方法。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

昆山市超聲儀器有限公司的超聲波清洗器（KQ-500）；賽多利斯科學(xué)儀器有限公司的十萬(wàn)分之一電子天平（BT25S）；安捷倫科技有限公司的高效液相色譜儀（Agilent-1260）。

1.2 試藥

佛手藥材，經(jīng)生藥學(xué)楊蘭老師鑒定其來源于蕓香科植物佛手的干燥果實(shí)；對(duì)照品：香葉木苷（購(gòu)于成都瑞芬思生物科技有限公司，批號(hào)D-005-161010），純度≥98.5%，橙皮苷（自制，采用核磁共振碳譜，氫譜和電噴霧電離質(zhì)譜鑒定，含量采用HPLC峰面積歸一化法測(cè)定≥98%）；水為純水（自制，pinchengPCJ-10 純化儀）；乙腈HPLC 級(jí)；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 混合對(duì)照品溶液的制備

取香葉木苷、橙皮苷對(duì)照品適量，精密稱定，分別置10 mL 容量瓶中，香葉木苷先用少量的二甲基亞砜（DMSO）將對(duì)照品完全溶解再加甲醇定容，制成香葉木苷對(duì)照品母液；橙皮苷用甲醇溶解，定容至刻度線，即得橙皮苷對(duì)照品母液。分別各取對(duì)照品母液1 mL，置同一10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，即得混合對(duì)照品溶液（香葉木苷、橙皮苷30.80、20.32 μg∕mL）。

2.2 供試品溶液的制備

精密稱取佛手粉末（過五號(hào)篩）約1 g，于錐形瓶中，精密移取25 mL 甲醇，稱定重量，以500 W，40 kHz頻率超聲提取1.5 h，放冷，再稱定重量，甲醇補(bǔ)重，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液為供試品溶液。

2.3 色譜條件

DiamonsilC（250 mm×4.6 mm，5 μm）的色譜柱；乙腈（A）-0.1%醋酸水（B）（20∶80）的等度洗脫，1.0 mL∕min 的流速；285 nm 的檢測(cè)波長(zhǎng)；25 ℃的柱溫；10 μL的進(jìn)樣量。色譜圖見圖1。

2.4 線性關(guān)系考察

精密稱取對(duì)照品適量，加甲醇定容至刻度，搖勻，制得混合對(duì)照品母液（香葉木苷、橙皮苷分別為61.60，101.60 μg∕mL）。然后稀釋成香葉木苷、橙皮苷含量分別為46.20，50.80；30.80，20.32；15.40，10.16；1.23，0.81 μg∕mL的混合對(duì)照品。按上述色譜條件進(jìn)行測(cè)定，以進(jìn)樣量（ng）為橫坐標(biāo)（X），色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)（Y），得香葉木苷和橙皮苷的線性方程分別為Y＝0.824X+3.56（r＝0.999 7），Y＝1.537X+5.16（r＝0.999 8），線性范圍分別為12.32～616.00，8.12～1 016.00 ng。

2.5 精密度試驗(yàn)

取香葉木苷、橙皮苷混合對(duì)照品溶液10 μL（香葉木苷、橙皮苷質(zhì)量濃度分別為32.24，21.16 μg∕mL），在上述相同色譜條件下重復(fù)進(jìn)樣6 次，測(cè)定香葉木苷、橙皮苷的峰面積，計(jì)算峰面積RSD值分別為0.68%，1.12%，表明精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

稱取川佛手（2 號(hào)）樣品共6 份，各約1 g，精密稱定，按上述方法制備供試品溶液，進(jìn)行含量測(cè)定，外標(biāo)法計(jì)算含量，結(jié)果香葉木苷的平均含量為0.07%，RSD 為2.20%；橙皮苷的平均含量為0.08%，RSD為2.60%；結(jié)果表明重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取川佛手（2號(hào)）樣品約1 g，精密稱定，按上述方法制供試品溶液，分別在0，2，4，6，8，12 h 進(jìn)樣10 μL，測(cè)定其峰面積，香葉木苷、橙皮苷的峰面積的RSD 分別為2.41%、2.88%，結(jié)果表明供試品溶液在室溫下12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

精密稱?。?號(hào)）佛手樣品共6 份（9 號(hào)藥材中香葉木苷、橙皮苷的含量分別為0.053%、0.029%），每份約0.5 g，分別精密加入含香葉木苷、橙皮苷濃度分別為0.264、0.145 mg∕mL的混合對(duì)照品溶液1 mL，參照上述方法制備樣品溶液，再按上述色譜條件進(jìn)行含量測(cè)定，結(jié)果見表1。

表1 準(zhǔn)確度試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）

2.9 樣品含量測(cè)定

取14 批佛手樣品各1 g，精密稱定，分別制備供試品溶液，測(cè)定其含量，外標(biāo)法計(jì)算含量，見表2。

圖1 HPLC法測(cè)定佛手藥材香葉木苷和橙皮苷的含量的色譜圖：A為混合對(duì)照品；B為樣品

表2 不同產(chǎn)地佛手中香葉木苷、橙皮苷含量（n＝4）

3 討論

現(xiàn)今，關(guān)于佛手質(zhì)量控制的報(bào)道很多，但未見其香葉木苷、橙皮苷同時(shí)測(cè)定的方法的文獻(xiàn)報(bào)道。橙皮苷和香葉木苷均為黃酮類成分，具有良好的生物學(xué)活性。本研究建立兩成分同時(shí)測(cè)定的方法，并用于不同產(chǎn)地佛手香葉木苷、橙皮苷的含量測(cè)定，結(jié)果表明，不同產(chǎn)地佛手中兩者含量相差較大，且其中有兩個(gè)批次廣佛手（9號(hào)，11號(hào)）中橙皮苷含量低于2020年版《中國(guó)藥典》的規(guī)定值0.03%，未達(dá)到藥典標(biāo)準(zhǔn)。文獻(xiàn)報(bào)道香葉木苷對(duì)照品用甲醇溶解，本研究參照文獻(xiàn)采用超聲和加熱都不能使其完全溶解，故先加少量DMSO 待香葉木苷溶解后慢慢加入甲醇，超聲制得香葉木苷對(duì)照品母液。在供試品溶液制備中，考察了加熱回流和超聲提取法分別在1.0、1.5、2.0 h提取時(shí)間的提取率，結(jié)果表明，水浴加熱和超聲提取1.5和2.0 h，提取回收率均在95%（提取1.0 h回收率在80%左右）。超聲提取操作簡(jiǎn)便，最終采用超聲提取的方法提取1.5 h。流動(dòng)相組成考察了甲醇-水，甲醇-0.1%醋酸水，乙腈-水，乙腈-0.1%醋酸水，發(fā)現(xiàn)采用乙腈-0.1%醋酸水（20∶80）等度洗脫，兩成分達(dá)到基線分離，且在20 min內(nèi)完成分析。波長(zhǎng)的選擇方面，采用UV-1750 紫外可見分光光度計(jì)，于200～700 nm 波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描香葉木苷、橙皮苷的對(duì)照品溶液，結(jié)果香葉木苷275 nm處有最大吸收；橙皮苷在283 nm處有最大吸收，由于兩者洗脫時(shí)間接近，故不采用波長(zhǎng)變化法進(jìn)行測(cè)定。兩者在285 nm處吸收均強(qiáng)，綜合考慮選擇285 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

綜上所述，本研究建立HPLC 法同時(shí)測(cè)定佛手藥材中香葉木苷、橙皮苷的含量，方法操作簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確可靠和重復(fù)性好，可快速準(zhǔn)確測(cè)定佛手藥材中這兩種成分的含量。