微小RNA-9-5p 調(diào)控脂多糖誘導(dǎo)小鼠樹突狀細(xì)胞免疫功能的機(jī)制研究

段曉星，常永麗，張麗英，米建強(qiáng)

腎炎是一種多種因素引起的腎功能減退的腎臟疾病，嚴(yán)重者會在終末期發(fā)生腎功能不全或尿毒癥，還可并發(fā)一系列免疫系統(tǒng)疾?。ㄌ悄虿　⒓t斑狼瘡、過敏性紫癜），嚴(yán)重影響病人的健康和安全。因此，尋找高效的治療藥物對病人的預(yù)后具有重要意義。微小RNA（miRNA）是一種18-25個(gè)核苷酸組成的內(nèi)源性短鏈非編碼的微小RNA分子，其通過抑制靶基因的轉(zhuǎn)錄或翻譯過程，參與基因的功能調(diào)控，進(jìn)而在人類的各種疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮作用。微小RNA-9-5p（miR-9-5p）在人類的癌癥、神經(jīng)退行性疾病和免疫系統(tǒng)疾病中均具有調(diào)控作用，甚至也有研究報(bào)道，其可調(diào)控人類樹突狀細(xì)胞的功能。樹突狀細(xì)胞（DCs）是一種功能最強(qiáng)的專職抗原提呈細(xì)胞（APC），其對抗原進(jìn)行捕獲、加工，處理后提呈給主要組織相容性復(fù)合體（MHC）Ⅰ、Ⅱ類分子，誘導(dǎo)活性T、B淋巴細(xì)胞的增殖，在調(diào)節(jié)特異性免疫反應(yīng)中起決定性作用。信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子6（STAT6）為信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子（STAT）家族的成員之一，有研究報(bào)道，其在樹突狀細(xì)胞的功能中具有重要作用。但是，miR-9-5p 對腎炎樹突狀細(xì)胞免疫功能的影響是否與STAT6 存在相關(guān)性尚且未知。2019 年1—9 月筆者以脂多糖（LPS）誘導(dǎo)的小鼠樹突狀細(xì)胞DC2.4 為研究對象，檢測其中miR-9-5p、STAT6 的表達(dá)，觀察過表達(dá)miR-9-5p、敲減STAT6對LPS誘導(dǎo)的DC2.4細(xì)胞的免疫功能的影響，揭示其機(jī)制與miR-9-5p 靶向STAT6 具有相關(guān)性，為腎炎的治療提供新方向。

1 材料與方法

1.1 材料

小鼠樹突狀細(xì)胞DC2.4購自ATCC；RPMI1640 培養(yǎng)基購自Gibco；MTT 購自上海威奧生物科技有限公司；白細(xì)胞介素-6（IL-6）檢測試劑盒、腫瘤壞死因子α（TNF-α）檢測試劑盒均購自碧云天；胎牛血清購自杭州四季青；RNA 抽提試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、qRT-PCR試劑盒均購自大連Takara；兔抗人STAT6 多克隆抗體購自LSBio；辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG 抗體購自美國Santa；雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒購自美國Promega；Lipofectamine2000購自美國Invitrogen。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞的分離培養(yǎng) 用含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠樹突狀細(xì)胞DC2.4，將其置于37 ℃，5% 二氧化碳的培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)、傳代。用 含 有5 μg∕mL 的LPS 的 完 全 培 養(yǎng) 基 處 理DC2.4 細(xì)胞48 h，標(biāo)記為腎炎樹突狀細(xì)胞（Nephritis DCs）組。

1.2.2 細(xì)胞轉(zhuǎn)染與分組 為了揭示腎炎小鼠樹突狀細(xì)胞中miR-9-5p、STAT6的表達(dá)存在差異，將正常培養(yǎng)的小鼠樹突狀細(xì)胞DC2.4、LPS誘導(dǎo)的DC2.4細(xì)胞分別標(biāo)記為Normal DCs組、Nephritis DCs組；為探究miR-9-5p、STAT6 對腎炎小鼠樹突狀細(xì)胞免疫功能的影響，將Blank組（未做任何處理）、miRNA模擬物陰性對照（miR-NC）、miR-9-5p 模擬物（mimics）、miRNA抑制物陰性對照（anti-miR-NC）、miR-9-5p抑制劑（anti-miR-9-5p）、小干擾RNA無序?qū)φ眨╯i-NC）組、STAT6 小干擾RNA（si-STAT6）、miR-9-5p mimics+空載體質(zhì)粒（pcDNA）、miR-9-5p mimics+STAT6過表達(dá)質(zhì)粒（pcDNA-STAT6），按照脂質(zhì)體Lipofectamine2000 的說明書操作步驟轉(zhuǎn)染至Nephritis DCs 細(xì)胞，依次記為miR-NC 組、miR-9-5p 組、antimiR-NC組、anti-miR-9-5p組、si-NC組、si-STAT6組、miR-9-5p+pcDNA 組、miR-9-5p+pcDNA-STAT6 組，轉(zhuǎn)染8 h后，更換新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48 h，用qRTPCR 法檢測轉(zhuǎn)染效率，轉(zhuǎn)染成功后，用于后續(xù)的實(shí)驗(yàn)研究。

1.2.3 MTT 法檢測細(xì)胞的增殖 將Normal DCs 組、Nephritis DCs 組細(xì)胞分別培養(yǎng)24、48、72 h，將其調(diào)整為10個(gè)∕毫升，取100 μL 細(xì)胞至96 孔板，再加入20 μL 5 g∕L 的MTT 溶液培養(yǎng)3 h，然后再加入50 μL二甲基亞砜（DMSO）進(jìn)行震蕩，以完全溶解結(jié)晶紫。在490 nm波長下檢測細(xì)胞吸光度（A）。

1.2.4 ELISA 實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞中IL-6、TNF-α 的含量收集対數(shù)増殖期細(xì)胞，用12 000 r∕min 離心，取上清進(jìn)行樣本中炎性因子IL-6、TNF-α 的檢測。檢測步驟按照IL-6 檢測試劑盒、TNF-α 檢測試劑盒的操作步驟要求進(jìn)行，最后再450 nm 波長下讀取數(shù)據(jù)，按照試劑盒評判標(biāo)準(zhǔn)和結(jié)果計(jì)算方法計(jì)算樣本中IL-6、TNF-α的含量。

1.2.5 qRT-PCR 法檢測細(xì)胞中miR-9-5p、STAT6、CD80、CD86、IL-12的mRNA表達(dá) 取適量對數(shù)生長期“1.2.2”各組細(xì)胞，按RNA抽提試劑盒說明書要求操作提取RNA，進(jìn)行定量，然后按反轉(zhuǎn)錄試劑盒按照說明書操作合成cDNA。最后按qRT-PCR試劑盒說明書操作進(jìn)行miR-29c檢測。以U6、GAPDH作為內(nèi)參，用2法計(jì)算miR-9-5p、STAT6、白細(xì)胞分化抗原80（CD80）、白細(xì)胞分化抗原86（CD86）、白細(xì)胞介素-12（IL-12）的相對表達(dá)。

引物信息（5’-3’）：miR-9-5p正向引物GGGTCTTTGGTTATCTAGC，反向引物TGCGTGTCGTGGAGTC；U6 正向引物GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT，反向引物CGCTTCACGAATTTGCGTGTCAT3；CD80正向引物AATTGTTGGCTTTCACTTT，反向引物AGCGTCTTTTTCATACTTCA；CD86 正向引物GGACAAGGGCTTGTATCAA，反向引物ATTGCTCGTAACATCAGGGA；IL-12正向引物GTTCCCATGCCTTCACCACT，反向引物CCGGTTCTTCAAGGGAGGAT；GAPDH 正向引物GTCAGCCGCATCTTCTTTTG，反向引物GCGCCCAATACGACCAAATC。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測細(xì)胞中STAT6 的蛋白表達(dá) 收集細(xì)胞，并用RIPA 裂解液裂解，提取細(xì)胞總蛋白，用BCA 蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量。各組蛋白進(jìn)行上樣、SDS-PAGE 后，經(jīng)電轉(zhuǎn)將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上。用2.5%脫脂牛奶室溫封閉90 min，加入一抗（兔抗人STAT6多克隆抗體1∶1 000），4 ℃孵育過夜，PBS 洗滌3 次，每次5 min；再加入相對應(yīng)的二抗（辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG 抗體1∶500）室溫孵育2 h，PBS 洗滌3 次，每次10 min，后在暗室中曝光、顯影、定影，最后用Quantity One凝膠分析軟件測定各組蛋白條帶的吸光度，以目的條帶和GAPDH條帶的比值作為蛋白表達(dá)水平。

1.2.7 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測細(xì)胞的熒光活性將STAT6 3’UTR-WT（含STAT6 3’UTR 片段）和STAT6 3’UTR-MUT（含STAT6 3’UTR 突變體片段）的熒光素酶報(bào)告載體，采用Lipofectamine2000 分別與miR-9-5p、miR-NC、anti-miR-9-5p、anti-miR-NC共轉(zhuǎn)染，24 h后，按雙熒光素酶報(bào)告基因檢測試劑盒技術(shù)手冊操作，記錄螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性，以兩者的比值評價(jià)細(xì)胞的熒光活性。

2 結(jié)果

2.1 腎炎小鼠樹突狀細(xì)胞模型的建立

結(jié)果如表1所示，與Normal DCs組相比，Nephritis DCs組細(xì)胞在48、72 h時(shí)，細(xì)胞活力降低，炎性因子IL-6、TNF-α的含量均升高（P＜0.05）。

表1 腎炎小鼠樹突狀細(xì)胞的增殖和炎性因子IL-6、TNF-α的分泌∕

2.2 腎炎小鼠樹突狀細(xì)胞的免疫功能

結(jié)果如表2所示，與Normal DCs組相比，Nephritis DCs組細(xì)胞中CD80、CD86、IL-12 的mRNA 的表達(dá)均降低（P＜0.05）。

表2 腎炎小鼠樹突狀細(xì)胞的免疫功能∕

2.3 miR-9-5p、STAT6 在腎炎小鼠樹突狀細(xì)胞中的表達(dá)

結(jié)果如圖1 和表3 所示，與Normal DCs 組相比，Nephritis DCs 組細(xì)胞中miR-9-5p 的mRNA 表達(dá)降低，STAT6 的mRNA 和蛋白表達(dá)均升高（P＜0.05）。

圖1 STAT6在腎炎小鼠樹突狀細(xì)胞中的蛋白表達(dá)

表3 miR-9-5p、STAT6在腎炎小鼠樹突狀細(xì)胞中的表達(dá)∕

2.4 過表達(dá)miR-9-5p抑制腎炎小鼠樹突狀細(xì)胞的免疫功能

結(jié)果如表4所示，與miR-NC組相比，miR-9-5p 組細(xì)胞中CD80、CD86、IL-12 的mRNA 的表達(dá)均降低（P＜0.05）。

表4 過表達(dá)miR-9-5p抑制腎炎小鼠樹突狀細(xì)胞的免疫功能∕

2.5 miR-9-5p靶向STAT6

通過生物信息學(xué)在線預(yù)測網(wǎng)站Target Scan（http：∕∕www.targetscan.org∕）預(yù)測到miR-9-5p 與STAT6 的3’端存在6 個(gè)互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)（圖2A）。雙熒光素酶報(bào)告基因檢測實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與miR-NC 組相比，miR-9-5p 組WT-STAT6細(xì)胞的熒光活性降低，MUT-STAT6細(xì)胞的熒光活性不受影響，與anti-miR-NC 組相比，anti-miR-9-5p 組WT-STAT6 細(xì)胞的熒光活性升高，MUT-STAT6 細(xì)胞的熒光活性變化不。與miR-NC 組相比，miR-9-5p組細(xì)胞中STAT6的mRNA和蛋白表達(dá)均降低，與anti-miR-NC組相比，anti-miR-9-5p組細(xì)胞中STAT6的mRNA和蛋白表達(dá)均升高（P＜0.05），見表5。

表5 miR-9-5p靶向負(fù)調(diào)控STAT6表達(dá)∕

2.6 敲減STAT6抑制腎炎小鼠樹突狀細(xì)胞的免疫功能

結(jié)果如表6 所示，與si-NC 組相比，si-STAT6組細(xì)胞中CD80、CD86、IL-12 的mRNA 的表達(dá)均降低（P＜0.05）。

2.7 過表達(dá)STAT6逆轉(zhuǎn)了miR-9-5p對LPS誘導(dǎo)的小鼠樹突狀細(xì)胞免疫功能的抑制作用

結(jié)果如表7 所示，與miR-9-5p+pcDNA 組相比，miR-9-5p+pcDNA-STAT6組細(xì)胞中miR-9-5p表達(dá)降低，CD80、CD86、IL-12的mRNA的表達(dá)均升高（P＜0.05）。

3 討論

圖2 miR-9-5p與STAT6之間存在互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)和STAT6的蛋白表達(dá)：A為miR-9-5p與STAT6之間存在互補(bǔ)的結(jié)合位點(diǎn)；B為STAT6的蛋白表達(dá)

表6 敲減STAT6抑制腎炎小鼠樹突狀細(xì)胞的免疫功能∕

表7 過表達(dá)STAT6逆轉(zhuǎn)了miR-9-5p對腎炎小鼠樹突狀細(xì)胞免疫功能的抑制作用∕

不同的細(xì)胞類型構(gòu)成了一個(gè)稱為樹突狀細(xì)胞（DCs）的群體，它調(diào)節(jié)先天免疫和適應(yīng)性免疫之間的平衡?；旧?，樹突狀細(xì)胞調(diào)節(jié)T 淋巴細(xì)胞激活或抑制體內(nèi)的特定免疫反應(yīng)。新的醫(yī)學(xué)治療策略旨在利用DCs功能來恢復(fù)機(jī)體的穩(wěn)態(tài)。耐受性樹突狀細(xì)胞（tDCs）在不激活T細(xì)胞的情況下保持抗原呈遞的穩(wěn)定狀態(tài)。在細(xì)胞與細(xì)胞的相互作用中，tDCs將幼稚T 細(xì)胞轉(zhuǎn)化為調(diào)節(jié)性T 淋巴細(xì)胞，誘導(dǎo)自身反應(yīng)性T細(xì)胞失去功能，自然發(fā)生的T調(diào)節(jié)性T淋巴細(xì)胞和T 細(xì)胞抑制性淋巴細(xì)胞的擴(kuò)增。因此，tDCs 可用于自身免疫性疾病或移植排斥治療。微小RNA（miRNA）在轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)調(diào)控中的作用得到越來越多的認(rèn)可。Zuzana 等在樹突狀細(xì)胞的研究中報(bào)道，在人類未成熟樹突狀細(xì)胞（iDC）、活化樹突狀細(xì)胞（aDCs）和耐受tDC中，miR-9在活化成熟的DCs 細(xì)胞中的表達(dá)異常升高，但是其在耐受的DCs 細(xì)胞中的表達(dá)異常降低，提示了miR-9 在樹突狀細(xì)胞的功能發(fā)揮張具有潛在的調(diào)控作用。于是，我們猜測miR-9-5p可能在腎炎小鼠樹突狀細(xì)胞的免疫功能中具有一定的調(diào)控作用。本研究首先用LPS 誘導(dǎo)DC2.4細(xì)胞損傷建立小鼠樹突狀細(xì)胞炎性損傷模型，發(fā)現(xiàn)模型細(xì)胞中CD80、CD86、IL-12表達(dá)明顯下調(diào)，再通過qRT-PCR法檢測其中miR-9-5p的表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)，miR-9-5p 在受損的DC2.4 細(xì)胞中的表達(dá)異常降低；進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，過表達(dá)miR-9-5p可抑制DC2.4 細(xì)胞中CD80、CD86、IL-12 的表達(dá)水平，抑制DC2.4細(xì)胞的免疫功能；深入研究，通過生物信息學(xué)預(yù)測、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測實(shí)驗(yàn)、qRT-PCR實(shí)驗(yàn)和蛋白質(zhì)印跡法驗(yàn)證了miR-9-5p靶向STAT6，并且負(fù)向調(diào)控STAT6 的表達(dá)水平。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果揭示了miR-9-5p可抑制受損的DC2.4細(xì)胞的免疫功能，提示，miR-9-5p對炎性損傷的DC2.4細(xì)胞的免疫功能的調(diào)控可能與STAT6具有一定的相關(guān)性。

STAT6 是IL-4 受體反向的主要轉(zhuǎn)錄因子，其在巨噬細(xì)胞活化、T 細(xì)胞分化、嗜酸性粒細(xì)胞、上皮細(xì)胞的功能表達(dá)中均具有調(diào)控作用。有很多研究報(bào)道，STAT6 也參與樹突狀細(xì)胞的功能表達(dá)。Szanto 等發(fā)現(xiàn)，STAT6 在過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）信號調(diào)控樹突狀細(xì)胞的脂質(zhì)代謝和炎癥反應(yīng)中具有重要的促進(jìn)作用。Quan 等報(bào)道，精氨酸酶1（Arg1）可刺激DCs 細(xì)胞的分化，其機(jī)制與Arg1 啟動(dòng)子內(nèi)的新型STAT6 結(jié)合位點(diǎn)介導(dǎo)STAT6 和組蛋白去乙?；?（HDAC4）的調(diào)節(jié)相關(guān)，揭示了HDAC4 和STAT6 之間的聯(lián)合作用是DC中Arg1轉(zhuǎn)錄的重要調(diào)節(jié)機(jī)制。由此可見，STAT6在DCs的分化、脂質(zhì)代謝、炎癥等功能中具有重要調(diào)控作用，但是其對DCs 細(xì)胞的免疫功能的影響及正向調(diào)控機(jī)制尚未十分清楚。本研究通過qRT-PCR、蛋白質(zhì)印跡法檢測了LPS 誘導(dǎo)的DC2.4 細(xì)胞中STAT6的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，STAT6 表達(dá)水平異常升高，并且敲減STAT6 可 抑 制LPS 誘 導(dǎo) 的DC2.4 細(xì) 胞 中CD80、CD86、IL-12的表達(dá)，抑制DC2.4細(xì)胞的免疫功能，這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明STAT6 有助于增強(qiáng)樹突狀細(xì)胞的免疫功能。有趣的是，我們還發(fā)現(xiàn)過表達(dá)STAT6逆轉(zhuǎn)了miR-9-5p對LPS誘導(dǎo)的小鼠樹突狀細(xì)胞免疫功能的抑制作用，這說明了STAT6 也可逆向負(fù)調(diào)控miR-9-5p在LPS誘導(dǎo)的DC2.4細(xì)胞中的表達(dá)和免疫抑制功能。這些實(shí)驗(yàn)結(jié)果為miR-9-5p、STAT6 用于包括腎炎在內(nèi)的炎性疾病的免疫治療提供了理論參考。

綜上所述，miR-9-5p可抑制脂多糖誘導(dǎo)的小鼠樹突狀細(xì)胞的免疫功能，其機(jī)制可能與靶向STAT6相關(guān)，為炎癥的基因治療提供新的理論依據(jù)。