微小218-5p 調(diào)控Wnt 家族成員2B 抑制骨肉瘤細(xì)胞143B 的增殖、遷移和侵襲

韋杰合，韋仁杰，周業(yè)修

骨肉瘤是一種原發(fā)性骨惡性腫瘤，主要發(fā)生于兒童和青少年，占骨腫瘤的60%。近十年來(lái)骨肉瘤的治療策略有了很大的進(jìn)展，包括手術(shù)切除、化療或放療，但骨肉瘤病人由于轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)程度高，療效仍不理想。

MicroRNA（miRNA）是一類(lèi)非編碼RNA，具有抑制靶基因表達(dá)的潛力，并在增殖、分化、轉(zhuǎn)移等一系列細(xì)胞生物學(xué)過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵作用。各種研究表明，miRNA 的失調(diào)是骨肉瘤發(fā)生的主要因素之一。Wang 等發(fā)現(xiàn)微小RNA-193a（miR-193a）參與了骨肉瘤細(xì)胞的耐藥性，增加miR-193a的表達(dá)可以促進(jìn)化療敏感性。Liu等證明微小RNA-377（miR-377）可能在骨肉瘤中作為抑癌miRNA發(fā)揮作用，誘導(dǎo)骨肉瘤細(xì)胞凋亡。此外，Wang 等發(fā)現(xiàn)，微小RNA-628-5p（miR-628-5p）通過(guò)降低干擾素誘導(dǎo)蛋白44 樣蛋白（IFI44L）的表達(dá)來(lái)增加骨肉瘤細(xì)胞的增殖和轉(zhuǎn)移。然而，miRNA在骨肉瘤進(jìn)展中的作用尚不清楚。因此，明確miRNAs 的作用及相關(guān)分子機(jī)制有助于識(shí)別骨肉瘤診斷的新型生物標(biāo)志物，并找到治療的潛在靶點(diǎn)顯得至關(guān)重要。

2016 年1 月至2019 年1 月，本研究分析了微小RNA-218-5p（miR-218-5p）在骨肉瘤中的生物學(xué)功能及其潛在機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)試劑

Matrigel基質(zhì)膠購(gòu)自美國(guó)BD公司，胎牛血清購(gòu)于美國(guó)Gibco公司，RT試劑盒、PCR相關(guān)SYBRP、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒均購(gòu)自于日本Takara 生物技術(shù)有限公司。兔抗人Wnt家族成員2B（WNT2B）單克隆抗體和鼠抗人三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）單克隆抗體均購(gòu)自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司，實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-q PCR）相關(guān)的miR-218-5p 和GAPDH上游、下游引物設(shè)計(jì)及合成均由武漢天一輝遠(yuǎn)生物技術(shù)有限公司完成。

1.2 骨肉瘤組織倫理

骨肉瘤組織26 例，鄰近正常成骨細(xì)胞組織21 例均選取于2016 年1 月至2019年1 月于河池市人民醫(yī)院住院手術(shù)治療，標(biāo)本均保存于液氮罐中，全部標(biāo)本均經(jīng)組織學(xué)鑒定。實(shí)驗(yàn)標(biāo)本的獲取均獲得病人本人或其近親屬同意，本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

4 個(gè)骨肉瘤細(xì)胞系（U2OS、SAOS2、MG63和143B）和正常成骨細(xì)胞（hFOB）購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院細(xì)胞庫(kù)（上海）。細(xì)胞培養(yǎng)均采用含10%胎牛血清的高糖DMEM 培養(yǎng)基。在5.0%二氧化碳、37 ℃的條件下培養(yǎng)，每48 小時(shí)換液一次，細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%后進(jìn)行傳代。狀態(tài)良好的細(xì)胞用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

1.4 轉(zhuǎn)染

miR-218-5p mimics（轉(zhuǎn)染miR-218-5p 模擬物），mimics NC（轉(zhuǎn)染miR-218-5p模擬物陰性對(duì)照miR-NC）質(zhì)粒由上海GenePharma（China）合成。對(duì)數(shù)期143B 細(xì)胞經(jīng)消化后復(fù)蘇，培養(yǎng)至6 孔板，細(xì)胞密度為1×10個(gè)∕孔。培養(yǎng)18～24 h后，細(xì)胞融合率達(dá)到80%～90%，加入不含血清和抗生素的培養(yǎng)基。細(xì)胞轉(zhuǎn)染采用Lipofectamine 2000（Life Technologies），連續(xù)孵育48 h。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR

組織或細(xì)胞加入1 mL Trizol，裂解10 min。先后加入氯仿、異丙醇，12 000 rpm 離心15 min 后，棄去上清。沉淀經(jīng)70%乙醇洗滌后，加入30 mL 無(wú)酶水，測(cè)量RNA 濃度。根據(jù)Takara 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄。采用二步法PCR 擴(kuò)增程序上機(jī)操作，實(shí)驗(yàn)結(jié)果以GAPDH 為內(nèi)參，采用法進(jìn)行分析。miR-218-5：正向引物TTGCGGATGGTTCCGTCAAGCA；反向引物GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT。GAPDH：正向引物ATCCAGTGCAGGGTCCGAGG；反向引物 GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG。

1.6 CCK8

骨肉瘤細(xì)胞以每孔1 000個(gè)鋪入96孔板中，每組設(shè)置5 個(gè)復(fù)孔。分別于6、24、48、72 h 加入10 μL CCK8 檢測(cè)試劑液。培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2 h，在酶標(biāo)儀450 nm 處檢測(cè)各孔的吸光度（OD）值，根據(jù)OD值描繪生存曲線。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 小室實(shí)驗(yàn)

1×10個(gè)不同處理組的骨肉瘤細(xì)胞用無(wú)血清培養(yǎng)基稀釋成200 μL，接種于鋪有magtrigel 的上室中。下室加入10%胎牛血清DMEM 培養(yǎng)基700 μL，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后用多聚甲醛固定細(xì)胞30 min，結(jié)晶紫染色30 min。PBS 洗凈結(jié)晶紫染色后，顯微鏡下選取6個(gè)視野拍照并記數(shù)。

1.8 劃痕

取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期各組的骨肉瘤細(xì)胞，接種于6 孔板繼續(xù)培養(yǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)至90%以上。200 μL tip槍頭進(jìn)行劃痕，用PBS洗后換無(wú)血清培養(yǎng)基。于細(xì)胞劃痕后0 h及48 h這2個(gè)時(shí)間點(diǎn)分別拍照，對(duì)比兩時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞遷移的距離。

1.9 雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定

為了驗(yàn)證miR-218-5p 是否與WNT2B 結(jié)合并調(diào)控其表達(dá)，進(jìn)行了雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)。WNT2B 的野生型（Wt）和突變型（Mut）3’-UTR 被合成并亞克隆到psiCHECK-2熒光素酶報(bào)告載體（美國(guó)Promega Corporation），這兩種突變體包含了miR-218-5p 的可能結(jié)合位點(diǎn)。培養(yǎng)24 h 后，143B 細(xì)胞與Wt∕Mut 型WNT2B 熒光素酶報(bào)告載體和miR-218-5p模擬物共轉(zhuǎn)染及陰性對(duì)照。最后，使用雙熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定系統(tǒng)（美國(guó)Promega）測(cè)定熒光素酶活性。Lipo2000（美國(guó)Invitrogen）用于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的全過(guò)程。

1.10 蛋白印記檢測(cè)

蛋白裂解液經(jīng)牛血清白蛋白（BSA）定量后制樣。樣品經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜后，用含5%的脫脂奶粉封閉2 h，分別加入一抗（鼠抗人WNT2B 單克隆抗體和鼠抗人GAPDH 單克隆抗體）4 ℃過(guò)夜。TBST 洗滌3 次后，再加羊抗鼠IgG后室溫孵育2 h，曝光。以目的條帶與內(nèi)參GAPDH的灰度值的比值為目的蛋白的表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 miR-218-5p 在骨肉瘤臨床樣本及細(xì)胞系中的表達(dá)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-218-5p 在26例骨肉瘤組織與21例正常骨組織中的表達(dá)，結(jié)果顯示miR-218-5p 在骨肉瘤組織低表達(dá)（t＝33.15，P＜0.001）。與正常的成骨細(xì)胞hFOB 相比，U2OS、SAOS2、MG63 和143B 在這4 株骨肉瘤細(xì)胞中miR-218-5p的表達(dá)水平分別為（0.712±0.015）%、（0.685±0.016）%、（0.542±0.021）%、（0.524±0.011）%，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。骨肉瘤細(xì)胞143B 中miR-218-5p 表達(dá)水平最低，因此，選取143B 細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)研究。

2.2 miR-218-5 在體外抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖

CCK-8實(shí)驗(yàn)測(cè)定miR-218-5p對(duì)骨肉瘤細(xì)胞增殖的影響，分別于6、24、48、72 h 時(shí)間點(diǎn)下測(cè)得吸光度值繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。miR-NC 組細(xì)胞培養(yǎng)6、24、48、72 h后的OD值分別為t（0.271±0.01），t（0.604±0.03），t（1.228±0.12），t（1.825±0.17），miR-218-5p 組細(xì)胞培養(yǎng)6、24、48、72 h 后的OD 值分別為t（0.274±0.011），t（0.514±0.04），t（0.828±0.16），t（1.212±0.013），結(jié)果表明，過(guò)表達(dá)miR-1218-5p 抑制了骨肉瘤細(xì)胞143B的增殖（P＜0.05）。

2.3 miR-218-5p 抑制骨肉瘤細(xì)胞143B 的遷移能力

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)miR-218-5p 對(duì)肉瘤細(xì)胞143B 的遷移能力的影響，骨肉瘤細(xì)胞143B 轉(zhuǎn)染miR-218-5p 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后，與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)miR-1218-5p骨肉瘤細(xì)胞143B的遷移距離明顯變短（t＝5.516，P＝0.005），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖1。

2.4 miR-1218-5p 抑制骨肉瘤細(xì)胞143B 細(xì)胞的侵襲能力

侵襲實(shí)驗(yàn)顯示：NC mimic 組（376±14）個(gè)，過(guò)表達(dá)miR-1218-5p 后（164±12）個(gè)。與對(duì)照組相比，過(guò)表達(dá)miR-1218-5p 的骨肉瘤細(xì)胞143B 侵襲數(shù)目明顯減少（t＝6.702，P＝0.001），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，見(jiàn)圖2。

2.5 WNT2B 直接調(diào)控miR-218-5p

首先，使用Targetscan 在線工具，發(fā) 現(xiàn)WNT2B 在49-56 的AAGCACAA 能與miR-218-5p 的3’UTR 端的UUCGUGU核酸序列互補(bǔ)，WNT2B被預(yù)測(cè)為miR-218-5p的下游。進(jìn)一步熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定法驗(yàn)證這一假設(shè)。熒光素酶報(bào)告基因測(cè)定結(jié)果表明，在143B細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染miR-218-5p模擬物可以抑制包含WT WNT2B 3′-UTR 序列的報(bào)告基因的熒光素酶活性（t＝21.174，P＜0.001）；但是，未能抑制含有MUT WNT2B 3′-UTR的細(xì)胞（t＝0.621，P＝0.542）。

2.6 miR-218-5p 抑制WNT2B 蛋白的表達(dá)水平

蛋白質(zhì)印跡法對(duì)預(yù)測(cè)結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證，檢測(cè)結(jié)果顯示，過(guò)表達(dá)miR-218-5p 細(xì)胞中WNT2B 蛋白的表達(dá)水平較對(duì)照組明顯下調(diào)（t＝18.04，P＜0.001），結(jié)果表明WNT2B 可能為miR-218-5p 的靶基因，提示，miR-218-5p可能通過(guò)抑制WNT2B的表達(dá)，影響骨肉瘤細(xì)胞143B的增殖、遷移和侵襲。見(jiàn)圖3。

圖1 miRNA-218-5p mimic處理后對(duì)骨肉瘤細(xì)胞143B遷移的影響（×40）

圖2 miRNA-218-5p mimic處理后對(duì)骨肉瘤細(xì)胞143B侵襲的影響（結(jié)晶紫染色×100）

圖3 miRNA-218-5p mimic處理后對(duì)骨肉瘤細(xì)胞143B中WNT2B表達(dá)水平的影響

3 討論

miRNA長(zhǎng)度為20～25個(gè)核苷酸，為一類(lèi)內(nèi)源性的非編碼單鏈RNA，在真核細(xì)胞生物中廣泛存在。越來(lái)越多的研究表明，miRNA 與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展等過(guò)程有著密切的關(guān)系。其中miR-218-5p 在多種腫瘤組織中均發(fā)揮著癌基因或抑癌基因的作用，包括肺腺癌、非小細(xì)胞肺癌、肝癌、膽囊癌和乳腺癌。Li等研究表明，miR-218-5p直接靶向脂肪瘤高遷移率融合蛋白樣蛋白3（LHFPL3），抑制膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的增殖和轉(zhuǎn)移。Deng 等研究表明，miR-218-5p 在胃癌中表達(dá)顯著降低，且與胃癌病人的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良有關(guān)。此外，Li等證明，抑制miR-218-5p 可以增加口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖和侵襲性。而在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)miR-145-5p 在骨肉瘤組織和細(xì)胞系中低表達(dá)。增加miR-218-5p 的表達(dá)，骨肉瘤細(xì)胞的增殖受到抑制，骨肉瘤細(xì)胞143B 的遷移和侵襲能力也明顯降低。這是miR-218-5p 作為骨肉瘤腫瘤抑制miRNA的第一個(gè)證據(jù)。

WNT2B，也叫WNT13，是已克隆的第13個(gè)WNT基因。Deng 等研究表明，WNT2B 可以激活WNT信號(hào)通路，細(xì)胞核中的β-連環(huán)蛋白（β-catenin）表達(dá)增加從而促進(jìn)腫瘤的增殖和轉(zhuǎn)移。Wang 等研究發(fā)現(xiàn)，miR-577通過(guò)調(diào)控WNT2B介導(dǎo)的非小細(xì)胞肺癌Wnt∕β-catenin 通路，抑制細(xì)胞增殖和上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。Li等研究表明，WNT2B在口腔癌的發(fā)生和化療耐藥中發(fā)揮作用，為HNSCC病人的治療提供了潛在的治療靶點(diǎn)。在人胰腺癌組織中，Jiang等發(fā)現(xiàn)Wnt2B 的表達(dá)均顯著高于正常胰腺組織，與神經(jīng)浸潤(rùn)有顯著相關(guān)性。而在本研究中，我們發(fā)現(xiàn)WNT2B直接與miR-218-5p 結(jié)合。miR-218-5p 表達(dá)的增加抑制骨肉瘤細(xì)胞143B 中WNT2B 的蛋白表達(dá)水平。miR-218-5p 在骨肉瘤中的異常表達(dá)可能預(yù)示病人的不良預(yù)后、發(fā)生和發(fā)展具有密切的關(guān)系。

綜上所述，本研究首次證實(shí)miR-218-5p可能在骨肉瘤中作為腫瘤抑制miRNA。結(jié)果顯示，miR-218-5p通過(guò)靶向WNT2B抑制骨肉瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。miR-218-5p 和WNT2B 可能是診斷骨肉瘤的新的生物標(biāo)志物，也是治療骨肉瘤的有效靶點(diǎn)。