雙調(diào)控腫瘤特異性溶瘤腺病毒對卵巢癌靶向治療的研究

趙婷，石琴

卵巢惡性腫瘤是全世界女性生殖器官最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率僅次于子宮頸癌和子宮內(nèi)膜癌，但是死亡率居三大婦科惡性腫瘤之首。卵巢癌治療主要采取腫瘤細(xì)胞減滅術(shù)聯(lián)合以鉑類為基礎(chǔ)的化療。其中，化療耐藥是卵巢癌高死亡率的重要原因之一。切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1（Excision repair cross complementing group1，ERCC1）是鉑類耐藥最為關(guān)鍵的因子，也是目前研究較多的DNA修復(fù)基因之一。2018年1—12月，本研究構(gòu)建了一種雙重調(diào)控的新型腫瘤特異性增殖溶瘤腺病毒并以此為載體轉(zhuǎn)染ERCC1小干擾RNA，來靶向殺滅卵巢癌細(xì)胞，進(jìn)一步研究其滅瘤分子機(jī)制，并初步探討其卵巢癌化療增敏效果，以期研究出卵巢癌治療及化療輔助新方案。

1 資料與方法

1.1 主要試劑和設(shè)備

實驗用質(zhì)粒載體由上海吉凱基因公司實驗構(gòu)建并保存。正常的卵巢癌細(xì)胞系SKOV3 購自美國ATCC 公司，人胚胎腎細(xì)胞293t細(xì)胞株購自加拿大Microbix Biosystem 公司，DEME培養(yǎng)基、胎牛血清購自GIBCO BRL 公司，噻唑藍(lán)（MTT）購自美國Genview 公司，RIPA 裂解液購自碧云天生物公司，磷酸酶抑制劑購自美國Sigma公司，二甲基亞砜（DMSO）購自上海試一化學(xué)試劑廠，DHanks 由上海吉凱基因技術(shù)有限公司配制，酶標(biāo)儀購自Tecan infinite公司細(xì)胞凋亡試劑盒購自南京凱基生物科技發(fā)展有限公司，ERCC1、β-actin、JAK2、STAT、PI3K、Akt 抗體皆購買于美國Abcam 公司，二抗為山羊抗兔IgG（H+L）、山羊抗小鼠IgG（H+L），均購自Thermo Pierce公司，ERCC1干擾序列（siRNA-ERCC1）、陰性對照序列均由上海吉凱基因有限公司設(shè)計合成。

1.2 方法

1.2.1 雙調(diào)控腺病毒構(gòu)建及鑒定 使用吉凱基因有限公司提供的pXC-1 載體進(jìn)行改造，其E1a 基因上游插入了人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動子（hTERT），E1b 基因上游插入了缺氧調(diào)控元件序列（HRE），于E1a 表達(dá)盒上游預(yù)留了酶切位點（具體結(jié)構(gòu)模式圖如圖1）。根據(jù)Genbank 的ERCC1 基因序列涉及特異siRNA。ERCC1-siRNA 序列為5’-ccAAGCCCTTATTCCGATCTA-3’。同時設(shè)計陰性對照序列5’-TTCTCCGAACGTGTCACGT-3’。編 碼siRNA 的DNA（由吉凱基因有限公司合成）結(jié)構(gòu)為：AgeI+U6啟動子+Sense DNA+Loop（TTCAAGAGA）+Antisense DNA+TTTTT+NotI，將雙酶切線性化的載體和退火雙鏈DNA 進(jìn)行連接反應(yīng)，連接后的產(chǎn)物進(jìn)行轉(zhuǎn)化、PCR 鑒定及測序、質(zhì)粒提取后與腺病毒包裝質(zhì)粒（PBHGE3）一起轉(zhuǎn)染293 細(xì)胞，重組出攜帶ERCC1-siRNA 的雙調(diào)控腺病毒（AD-ERCC1-siRNA）及未攜帶ERCC1-siRNA的對照腺病毒（AD-NC-siRNA）。

1.2.2 鑒定 各腺病毒經(jīng)PCR 擴(kuò)增鑒定E1a 序列后，于293細(xì)胞中反復(fù)擴(kuò)增，氯化氬密度梯度離心純化，TCID50法檢測病毒滴度：挑取病毒克隆噬斑，提取腺病毒DNA，鑒定腺病毒E1a和hTERT序列。

1.2.3 MTT 法檢測細(xì)胞增殖能力 將對數(shù)期生長細(xì)胞離心后，重懸細(xì)胞，于96 孔板接種（密度5×10個∕孔），繼續(xù)培養(yǎng)，用無血清培養(yǎng)液稀釋病毒ADERCC1-siRNA、AD-NC-siRNA，按照MOL＝5.00、10.00、20.00、40.00、60.00加入100 μL稀釋好的病毒液分別感染細(xì)胞，對應(yīng)于每個病毒感染復(fù)數(shù)（MOI）值設(shè)3 個復(fù)孔，于24 h 后向各孔加入MTT 液（5 mg∕mL）20 μL，孵育4 h，終止培養(yǎng)，小心的將孔內(nèi)上清液吸棄，將100 μL 二甲基亞砜加入各孔，振蕩15 min，待結(jié)晶物完全溶解后，利用酶標(biāo)儀檢測各孔在492 nm波長處的吸光度A值。

根據(jù)DDP 作用于SKOV3 預(yù)實驗結(jié)果，得出DDP IC10（2.26 mg∕L），并設(shè)置五個組別DDP IC10（2.26 mg∕L）、AD-ERCC1-siRNA（MOI 30）、AD-NCsiRNA（MOI＝30）、DDP IC10+AD-NC-siRNA（MOI 30）、DDP IC10+AD-ERCC1-siRNA（MOI＝30），MTT法比較各組的吸光度（A）值及細(xì)胞增殖抑制率。

1.2.4

AnnexinV-FITC 雙染結(jié)合流式細(xì)胞術(shù)檢測SKOV 3 細(xì)胞的凋亡

收集不同作用組的細(xì)胞及細(xì)胞培養(yǎng)液，按照AnnexinV-FITC試劑盒說明，1 000 r∕min 離心5 min（TGL-16B 臺式離心機(jī)上海安亭科學(xué)儀器廠），棄上清，用PBS輕輕重懸細(xì)胞并計數(shù)。取1×10個重懸的細(xì)胞，1 000 r∕min 離心5 min，棄上清，加入195 μL AnnexinV-FITC 結(jié)合液重懸細(xì)胞。加入5 μL AnnexinV-FITC，輕輕混勻，室溫避光孵育10 min。1 000 r∕min 離心5 min，棄上清，加入190 μL Annexin V-FITC 結(jié)合液輕輕重懸細(xì)胞。加入10 μL 碘化丙啶染色液，輕輕混勻，冰浴避光放置。隨即進(jìn)行流式細(xì)胞儀檢測。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法（Western Blot） 檢測細(xì)胞中JAK2、STAT、PI3K、Akt蛋白表達(dá)各組細(xì)胞轉(zhuǎn)染后培養(yǎng)24 h，用預(yù)冷的RIPA裂解液和磷酸酶抑制劑分別提取總蛋白并檢測純度。取總蛋白30 μL，進(jìn)行10%聚丙烯胺凝膠電泳，電至聚偏二氟乙烯膜（PVDF）膜上，用3%牛血清白蛋白室溫下封閉60min，TBST沖洗3次，加入一抗JAK2、STAT、PI3K、Akt，4 ℃過夜孵育，TBST 沖洗3 次，將二抗加入，37 ℃孵育60 min，用TBST 沖洗3 次，暗室下用ECL反應(yīng)15 min，用Image J 軟件分析，計算細(xì)胞中JAK2、STAT、PI3K、Akt蛋白表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 RSOAds-hTERT/HIF-ERCC1 雙調(diào)控腺病毒成功構(gòu)建并可以高效轉(zhuǎn)染卵巢癌細(xì)胞

我們將攜帶ERCC1-siRNA基因的工具載體質(zhì)粒（載體順序為pU6-MCS-phTERT-E1A-pHREE1B55K-pIX-E2B，克隆位點：Age I、Not I），與腺病毒包裝質(zhì)粒-PBHGE3一起轉(zhuǎn)染293 細(xì)胞，成功構(gòu)建雙調(diào)控溶瘤腺病ADERCC1-siRNA，見圖1。我們將構(gòu)建成功的AD-ERCC1-siRNA 病毒增加熒光載體，置于熒光顯微鏡下進(jìn)行觀察，病毒轉(zhuǎn)染效率較高，見圖2。

2.2 RSOAds-hTERT/HIF-ERCC1 雙調(diào)控腺病毒對卵巢癌細(xì)胞有增殖抑制作用

MTT 方法檢測雙調(diào)控腺病毒對卵巢癌細(xì)胞SKOV3 細(xì)胞的增殖抑制作用，結(jié)果提示，當(dāng)病毒接觸卵巢癌細(xì)胞24 h 后發(fā)揮出對卵巢癌細(xì)胞較明顯的增殖抑制作用，且ADERCC1-siRNA組與AD-NC-siRNA組無明顯差異，在感染強(qiáng)度（MOI）＝30時，卵巢癌SKOV3細(xì)胞增殖率下降到50%以下，見圖3和表1。

表1 雙調(diào)控腺病毒對SKOV3細(xì)胞的半數(shù)抑制率病毒濃度

2.3 RSOAds-hTERT/HIF-ERCC1 雙調(diào)控腺病毒對卵巢癌細(xì)胞促凋亡作用

將AD-ERCC1-siRNA病毒對卵巢癌細(xì)胞作用效果進(jìn)行了圖像觀察及細(xì)胞凋亡實驗，與空白細(xì)胞對照組相比，細(xì)胞培養(yǎng)24 h后，可見大量SKOV3 細(xì)胞形態(tài)不規(guī)則，細(xì)胞體老化分解或者萎縮聚集，胞核深染（顯微鏡放大倍數(shù)40倍）。流式細(xì)胞實驗顯示AD-ERCC1-siRNA 組細(xì)胞凋亡率（5.5±0.75）%較對照組（0.5±0.24）%明顯升高（P＜0.01）。見圖4。

2.4 RSOAds-hTERT/HIF-ERCC1 雙調(diào)控腺病毒高效屏蔽ERCC1 耐藥基因，并可能通過JAK/STAT通路介導(dǎo)殺傷上皮性卵巢癌細(xì)胞

我們采用傳統(tǒng)WB 方法對病毒作用后的SKOV3 細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞收集以及蛋白提取后檢測。結(jié)果顯示AD-ERCC1-siRNA 組作用后細(xì)胞ERCC1 蛋白（0.553±0.036）表達(dá)較對照組（1.607±0.102）明顯減少（P＜0.01）。JAK2，STAT3 表達(dá)量較對照組表達(dá)明顯增加（P＜0.01）。同時我們也進(jìn)行了PI3K∕Akt 通路的相關(guān)蛋白檢測，其表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見圖5、表2。

表2 AD-ERCC1-siRNA病毒作用后對ERCC1蛋白及細(xì)胞凋亡蛋白影響∕

2.5 攜帶ERCC1-siRNA的雙調(diào)控病毒較AD-NCsiRNA 更能增強(qiáng)順鉑的用藥效果，其機(jī)制可能與ERCC1耐藥基因成功屏蔽有關(guān)

我們采用MTT方法檢測單藥順鉑組、病毒組、聯(lián)合組等組別對卵巢癌細(xì)胞SKOV3 細(xì)胞的殺滅作用，結(jié)果提示，五組卵巢癌細(xì)胞SKOV3 增殖率均被明顯抑制（P＜0.01），其中攜帶ERCC1-siRNA 的雙調(diào)控病毒聯(lián)合順鉑組較其余各組抑瘤作用更強(qiáng)，較AD-NC-siRNA+DDP組更能增強(qiáng)順鉑的用藥效果（P＜0.01），而AD-NCsiRNA組與AD-ERCC1-siRNA組對腫瘤細(xì)胞作用差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。見表3。

表3 噻唑藍(lán)檢測DDP組、病毒組、聯(lián)合組等組別對卵巢癌細(xì)胞SKOV3的增殖抑制率

3 討論

卵巢癌以盆腔種植及轉(zhuǎn)移為主，因病灶位置較深，化療藥物靜脈用藥盆腔局部難以達(dá)到有效濃度，治療效果不佳，盆腔灌注的方法亦對正常組織和細(xì)胞造成很大損傷。且腫瘤細(xì)胞對鉑類藥物產(chǎn)生耐藥性更是阻礙了藥物的抗腫瘤效應(yīng)，使術(shù)后5年生存率徘徊在30%～50%之間。因此，一種腫瘤靶向性強(qiáng)且能逆轉(zhuǎn)耐藥的卵巢癌治療新方案已經(jīng)成為婦科腫瘤學(xué)重要的研究目標(biāo)之一。

腫瘤特異性增殖溶瘤腺病毒（RSOAds）載體因其高度腫瘤靶向性及殺傷力引起我們關(guān)注，它能感染腫瘤細(xì)胞，在其中復(fù)制、增殖、裂解、殺傷腫瘤細(xì)胞并釋放出更多病毒，感染其他腫瘤細(xì)胞進(jìn)行鏈?zhǔn)綒磻?yīng)，且復(fù)制、增殖僅限于腫瘤細(xì)胞，對正常宿主組織幾乎無破壞。

目前認(rèn)為，端粒酶的活化與卵巢癌的發(fā)生密切相關(guān)，其活性增加在卵巢癌的進(jìn)展中具有重要意義。在腫瘤細(xì)胞的惡性增殖過程中，細(xì)胞耗氧量劇增，腫瘤內(nèi)缺氧微環(huán)境誘導(dǎo)缺氧誘導(dǎo)因子（HIF-1）形成，HIF-l在包括卵巢癌在內(nèi)的多種腫瘤中廣泛存在，它與一系列缺氧反應(yīng)元件（HRE）結(jié)合，從而啟動目的基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展、凋亡、浸潤及轉(zhuǎn)移等方面起著十分重要的作用。有研究證明HIF-1在卵巢癌、腦癌、乳腺癌、腎癌、膀胱癌等一系列人體實體瘤中均高表達(dá)，而在相鄰的正常組織或基質(zhì)細(xì)胞中則無表達(dá)。

卵巢癌鉑類耐藥最為關(guān)鍵的因子是切除修復(fù)交叉互補(bǔ)基因1（ERCC1），也是目前研究較多的DNA 修復(fù)基因之一。ERCC1位于人類19號染色體上，參與了DNA 鏈的切割和損傷識別，ERCC1 mRNA 水平可以反映腫瘤組織修復(fù)鉑類藥物所致DNA螺旋扭轉(zhuǎn)的能力，是標(biāo)志腫瘤病人預(yù)后和鉑類化療效果的重要指標(biāo)。很多研究發(fā)現(xiàn)接受以鉑類為基礎(chǔ)的化療病人中ERCC1表達(dá)越高，化療效果及病人的預(yù)后越差。

綜上所述，我們設(shè)想依據(jù)惡性實體腫瘤無限增殖和瘤內(nèi)缺氧環(huán)境的存在這兩個主要特征，構(gòu)建一種人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶（hTERT）啟動子和HIF-1雙重調(diào)控的新型腫瘤特異性增殖溶瘤腺病毒并以此為載體轉(zhuǎn)染ERCC1 siRNA，靶向殺滅卵巢癌細(xì)胞同時初步探討其卵巢癌化療輔助效果，以期滅瘤同時增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞化療敏感性，兩者相輔相成，有效預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)，并減少化療藥物用量，加強(qiáng)化療效果并提高病人生活質(zhì)量，延長病人生存期。

本研究將hTERT和HIF-1分別插入已刪除病毒復(fù)制所必需的E1A、E1B 基因啟動子刪除的腺病毒質(zhì)粒，成功構(gòu)建僅在腫瘤細(xì)胞內(nèi)特異性增殖的雙調(diào)控溶瘤腺病毒（RSOAd-hTERT-HIF），并以此為耐藥基因ERCC1的siRNA基因載體，進(jìn)一步包裝成溶瘤腺 病 毒hTERT 啟 動∕HIF -ERCC1siRNA 質(zhì) 粒（RSOAds-hTERT∕HIF-ERCC1 siRNA），以抑制癌細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)癌細(xì)胞凋亡，達(dá)到提高腫瘤基因治療的目的。經(jīng)鑒定，本研究構(gòu)建的雙調(diào)控腺病毒能夠在卵巢癌細(xì)胞中高拷貝增殖，并能成功屏蔽卵巢癌SKOV3細(xì)胞中ERCC1耐藥基因，且實現(xiàn)了針對惡性腫瘤端粒酶陽性和缺氧環(huán)境的雙調(diào)控作用。

磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）∕蛋白激酶B（Akt）通路是一個經(jīng)典的抗凋亡、促存活的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，由PI3K 家族、Akt 蛋白及其一系列底物組成。PI3K是細(xì)胞膜上的表皮生長因子受體（EGFR）細(xì)胞內(nèi)部分的下游分子，EGFR 激活后，PI3K 隨后活化，并進(jìn)一步磷酸化激活A(yù)kt，磷酸化的Akt 直接或間接參與許多生理和病理過程。目前研究表明，PI3K∕Akt轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑是卵巢癌細(xì)胞對DDP敏感性的關(guān)鍵調(diào)控因素。

JAK-STAT 信號通路是一條由細(xì)胞因子刺激的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，參與細(xì)胞的增殖、分化、凋亡以及免疫調(diào)節(jié)等許多重要的生物學(xué)過程。JAK-STAT 信號通路功能廣泛，目前與疾病及藥物創(chuàng)新相關(guān)的研究都集中于炎癥性疾病及腫瘤性疾病。

我們選用卵巢癌SKOV3 細(xì)胞進(jìn)行該病毒的細(xì)胞學(xué)試驗，通過對細(xì)胞進(jìn)行MTT檢測發(fā)現(xiàn)此病毒對上皮性卵巢癌細(xì)胞株SKOV3具有一定的殺滅作用，且攜帶ERCC1 siRNA后并不影響病毒滅瘤效果；甚至屏蔽ERCC1 基因后還具有明顯順鉑增敏作用。同時進(jìn)行了細(xì)胞凋亡通路的檢測，JAK∕STAT通路的激活可能是該病毒誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞死亡的一條重要途徑，PI3K∕Akt 通路尚未發(fā)現(xiàn)參與其中。

圖1 成功構(gòu)建AD-ERCC1-siRNA的相關(guān)質(zhì)粒：1A為攜帶ERCC1-siRNA基因的工具載體質(zhì)粒；1B為溶瘤腺病毒包裝輔助質(zhì)粒（PBHGE3）

圖2 構(gòu)建成功的AD-ERCC1-siRNA病毒增加熒光載體，將病毒轉(zhuǎn)染后的卵巢癌細(xì)胞SKOV3放置于熒光顯微鏡下觀察：2A為正常光線下細(xì)胞圖像；2B為熒光顯像（放大倍數(shù)為100倍） 圖3 噻唑藍(lán)檢測雙調(diào)控腺病毒對SKOV3細(xì)胞的增殖抑制作用

圖4 攜帶ERCC1-siRNA的雙調(diào)控腺病毒（AD-ERCC1-siRNA）作用SKOV3人卵巢癌細(xì)胞24 h凋亡效果圖：A為AD-ERCC1-siRNA組；B為細(xì)胞對照組

圖5 WB檢測AD-ERCC1-siRNA病毒作用后ERCC1蛋白表達(dá)及相關(guān)細(xì)胞凋亡通路：A為ERCC1蛋白表達(dá)，B為細(xì)胞凋亡通路蛋白表達(dá)

我們首例將雙調(diào)控腺病毒應(yīng)用于婦產(chǎn)科腫瘤，致力構(gòu)建一種靶向性極高的溶瘤腺病毒應(yīng)用于卵巢癌的治療，探討其溶瘤機(jī)制及化療增敏效果，為卵巢癌的基因治療打下堅實的研究基礎(chǔ)。當(dāng)然，后續(xù)還有一些問題亟待我們不斷進(jìn)行完善研究，比如探討目的病毒屏蔽ERCC1 耐藥基因后化療增敏分子機(jī)制研究及完善相關(guān)動物實驗等。（本文圖1～5見插圖1-1）