乙型肝炎病毒促進(jìn)肝細(xì)胞PD-L1蛋白表達(dá)機(jī)理

朱海珍 荀圳 鄧日林 田仁云 郭萌萌 陳生穩(wěn) 劉倩 郭艷霞

摘 ? 要：為了研究乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）能否借助腫瘤細(xì)胞的抗免疫機(jī)制來(lái)逃逸機(jī)體免疫，利用HBV感染去肝細(xì)胞，研究受感染后的肝細(xì)胞對(duì)宿主免疫應(yīng)答的變化. 通過(guò)實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法分析HBV感染后的肝細(xì)胞內(nèi)Axin和PD-L1的轉(zhuǎn)錄水平，發(fā)現(xiàn)HBV不影響Axin和PD-L1的轉(zhuǎn)錄水平，采用蛋白免疫印跡技術(shù)發(fā)現(xiàn)HBV能下調(diào)肝細(xì)胞內(nèi)Axin蛋白水平，同時(shí)上調(diào)PD-L1蛋白水平. 進(jìn)一步在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)染表達(dá)HBV的組成蛋白的質(zhì)粒，通過(guò)蛋白免疫印跡技術(shù)發(fā)現(xiàn)HBV的組成蛋白HBx能下調(diào)細(xì)胞內(nèi)Axin蛋白的表達(dá). 通過(guò)數(shù)據(jù)相關(guān)性分析以及泛素化實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，Axin能通過(guò)增加PD-L1的E3泛素連接酶SPOP的表達(dá)，促進(jìn)PD-L1泛素蛋白酶體降解. 進(jìn)一步對(duì)PD-L1的泛素化方式進(jìn)行探討，發(fā)現(xiàn)Axin促進(jìn)PD-L1的K48依賴(lài)的泛素化降解作用. 結(jié)果表明，HBV可能通過(guò)HBx下調(diào)Axin和SPOP蛋白水平，抑制PD-L1泛素化降解，進(jìn)而逃逸宿主免疫應(yīng)答. 本研究揭示了HBV免疫逃逸新機(jī)制，為治療HBV奠定了新的基礎(chǔ)，在一定程度上推動(dòng)了抗HBV藥物開(kāi)發(fā).

關(guān)鍵詞：酶;PD-L1;乙型肝炎病毒;Axin;免疫逃逸;泛素化;HLCZ01細(xì)胞

中圖分類(lèi)號(hào)：Q71 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

Mechanism of Induction of PD-L1

by Hepatitis B Virus in Human Hepatocytes

ZHU Haizhen1，2，3?，XUN Zhen1，2，3，DENG Rilin1，2，3，TIAN Renyun1，2，3，

GUO Mengmeng1，2，3，CHEN Shengwen1，2，3，LIU Qian1，2，3，GUO Yanxia1，2，3

（1. College of Biology，Hunan University，Changsha ?410082，China;

2. Institute of Pathogen Biology and Immunology，Hunan University，Changsha ?410082，China;

3. State Key Laboratory of Chemo/Biosensing and Chemometrics，Hunan University，Changsha 410082，China）

Abstract：In order to explore whether Hepatitis B virus （HBV） can escape the body’s immunity by means of the anti-immune mechanism of tumor cells， this study used HBV to infect hepatocytes， and then explored the changes of the immune response of infected hepatocytes to the host. The transcriptional levels of Axin and PD-L1 in hepatocytes after HBV infection were analyzed by real-time fluorescence quantitative PCR， and it was found that HBV did not affect the transcriptional levels of Axin and PD-L1. Then， western blot was used to find that HBV could down-regulate Axin protein levels in hepatocytes and up-regulate PD-L1 protein levels. Further transfection of plasmid expressing HBV component protein in cells showed that HBx could down-regulate Axin protein expression in cells by western blot. Data correlation analysis and ubiquitin assay showed that Axin promoted pD-L1 ubiquitin proteasome degradation by increasing the expression of E3 ubiquitin ligase SPOP of PD-L1. Further studies on the ubiquitination of PD-L1 showed that Axin promoted the K48-dependent ubiquitination of PD-L1. Based on the above results， we believe that HBV may down-regulate Axin and SPOP protein levels through HBx， inhibit PD-L1 ubiquitination and degradation， and then escape the host immune response. This study reveals a new mechanism of HBV immune escape， lays a new foundation for the treatment of HBV， and promotes the development of anti-HBV drugs to a certain extent.

Key words：enzymes;PD-L1;Hepatitis B virus（HBV）;Axin;immune evasion;ubiquitin;HLCZ01 cell line

乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）是一種小的嗜肝DNA病毒，是導(dǎo)致慢性肝病的主要原因，可導(dǎo)致病毒性肝炎、肝硬化和肝細(xì)胞癌（Hepatic cell carcinoma，HCC）. 據(jù)統(tǒng)計(jì)，全世界約有2.5億人長(zhǎng)期感染HBV，并有發(fā)展為肝硬化甚至肝癌的風(fēng)險(xiǎn)[1]. 病毒和宿主因素都對(duì)慢性HBV感染的結(jié)果有影響，與其他病原體一樣，HBV形成了逃避宿主的免疫防御策略，例如高比率的基因突變率和免疫調(diào)節(jié)蛋白的表達(dá).

軸抑制蛋白Axin是Wnt/β-catenin信號(hào)的負(fù)調(diào)節(jié)因子，通過(guò)蛋白酶體降解途徑調(diào)節(jié)β-catenin蛋白水平，進(jìn)而抑制Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)[2-4]. 然而，Axin在HBV感染過(guò)程中的作用尚不清楚.

PD-L1是一種免疫檢查點(diǎn)分子，調(diào)節(jié)Ⅰ型T輔助細(xì)胞（Th1）免疫反應(yīng)，介導(dǎo)癌癥免疫逃避. 它可以在腫瘤細(xì)胞（TC）和腫瘤浸潤(rùn)性的免疫細(xì)胞（IC）上進(jìn)行表達(dá)[5]. 近幾年，抗PD-L1治療手段在人類(lèi)癌癥的免疫治療中占據(jù)了中心地位[6-8]. 然而，PD-L1在HBV感染中的作用及其機(jī)理仍有待闡明.

泛素蛋白酶體降解途徑是目前已知的所有真核生物體內(nèi)具有高度選擇性且最為重要的蛋白質(zhì)降解途徑. 真核細(xì)胞內(nèi)泛素化修飾后的靶蛋白能被降解或者被轉(zhuǎn)移到細(xì)胞內(nèi)或細(xì)胞外的特定部位. 靶蛋白的泛素化修飾需要E3泛素連接酶的參與，E3泛素連接酶通過(guò)調(diào)控調(diào)節(jié)蛋白的泛素化過(guò)程參與細(xì)胞內(nèi)的多種生理過(guò)程[9]. 經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，HBV感染可對(duì)細(xì)胞內(nèi)多種生命活動(dòng)產(chǎn)生影響，如影響轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)，促使Caspase剪切從而促使細(xì)胞凋亡等. 然而，HBV是否能調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)一些E3連接酶的表達(dá)，進(jìn)而調(diào)節(jié)泛素蛋白酶體途徑尚不清楚.

本文從轉(zhuǎn)錄水平、翻譯水平以及翻譯后的修飾水平對(duì)Axin 和PD-L1的關(guān)系進(jìn)行了探討，發(fā)現(xiàn)Axin可能通過(guò)調(diào)節(jié)PD-L1的E3連接酶的表達(dá)，調(diào)控PD-L1的翻譯后修飾;同時(shí)，還發(fā)現(xiàn)Axin能夠逆轉(zhuǎn)HBV引起的PD-L1上調(diào)現(xiàn)象. 本研究為HBV免疫逃逸機(jī)理提供參考和依據(jù).

1 ? 材料與方法

1.1 ? 細(xì)胞系

Huh7細(xì)胞為美國(guó)耶魯大學(xué)醫(yī)學(xué)院劉晨教授實(shí)驗(yàn)室惠贈(zèng);BGC-823購(gòu)自Boster公司;HEK293T購(gòu)自美國(guó)ATCC;HLCZ01細(xì)胞系由本實(shí)驗(yàn)室從臨床病人肝組織中分離培養(yǎng)得到[10].

1.2 ? 試 ? 劑

高糖（DMEM）培養(yǎng)基和DMEM/F-12 培養(yǎng)基（Invitrogen 公司），1×PBS（Hyclone 公司），0.25%胰蛋白酶（Invitrogen公司），細(xì)胞RNA收取Trizol 試劑（Invitrogen 公司），逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（Accurate Biology公司），SYBR Green 定量試劑盒（Accurate Biology 公司），蛋白酶抑制劑片劑（Merck 公司），細(xì)胞蛋白收取RIPA 裂解液（Thermo 公司），Axin抗體（CST公司），PD-L1抗體（Proteintech公司），F(xiàn)lag抗體（Sigma-Aldrich公司），V5抗體（Invitrogen公司），β-actin 抗體（Sigma-Aldrich公司）.

60 mm的細(xì)胞培養(yǎng)皿（Biologix公司），十二孔細(xì)胞培養(yǎng)板（Biologix公司），10 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿（Biologix公司），1.5 mL的離心管（Axygen公司），200 μL PCR八聯(lián)管（Axygen公司），0.22 μm和0.45 μm的PVDF 膜（Merck Millipore公司）.

1.3 ? 儀器設(shè)備

4 ℃冰箱（中科美菱公司），-20 ℃冰箱（Haier公司），-80 ℃超低溫冰箱（Thermo公司），CO2恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱（Thermo公司），生物安全柜（Airtech公司），凝膠核酸成像（上海天能公司），蛋白核酸曝光成像儀器（Bio-rad公司），細(xì)胞計(jì)數(shù)儀（Beckman公司），光學(xué)顯微鏡（Olympus公司），細(xì)胞液氮凍存罐（Thermo公司），分析天平（上海天平儀器廠），Nanodrop2000（Thermo公司），實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（湖南達(dá)爾儀器有限公司），普通PCR儀（Eppendorf公司），制冷高速離心機(jī)（Eppendorf公司）.

1.4 ? 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 ? HBV感染方法

用于實(shí)驗(yàn)感染細(xì)胞的HBV來(lái)自HepG2.2.15細(xì)胞上清（D型）. 在培養(yǎng)HepG2.2.15細(xì)胞時(shí)，在培養(yǎng)基中加入終質(zhì)量濃度為500 μg/mL的新霉素（G418）來(lái)維持HBV基因組的復(fù)制水平. 當(dāng)HepG2.2.15細(xì)胞開(kāi)始產(chǎn)生病毒時(shí)，用不加G418的培養(yǎng)基培養(yǎng)HepG2.2.15細(xì)胞，一邊擴(kuò)大培養(yǎng)細(xì)胞一邊收集細(xì)胞上清，收集的細(xì)胞上清用0.45 μm微孔過(guò)濾器過(guò)濾，使病毒得以富集，最后測(cè)定病毒滴度. HBV按照MOI為20接種于HLCZ01細(xì)胞，病毒與細(xì)胞孵育過(guò)夜后，去除培養(yǎng)上清，用磷酸鹽緩沖鹽水（Phosphate Buffered Saline，PBS）洗滌3次，加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)至對(duì)應(yīng)的時(shí)間點(diǎn).

1.4.2 ? 過(guò)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定

為了構(gòu)建Axin、PD-L1、SPOP、Cbl和HBX的過(guò)表達(dá)質(zhì)粒，首先利用Primer Primer5設(shè)計(jì)PCR引物，然后從Huh7細(xì)胞中提取總RNA，利用其逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板來(lái)擴(kuò)增Axin、PD-L1、SPOP、Cbl基因;同時(shí)從HBV感染的HLCZ01細(xì)胞內(nèi)提取細(xì)胞總RNA來(lái)擴(kuò)增HBX基因. 通過(guò)膠回收純化PCR產(chǎn)物，最后利用TA克隆方法將擴(kuò)增得到的DNA片段連入p3×Flag-CMV和pCDNA3.1a載體中，從而得到重組質(zhì)粒p3×Flag-CMV-Axin、p3×Flag-CMV-PD-L1、p3×Flag-CMV-HBx、pCDNA3.1a-PD-L1、pCDNA3.1a-SPOP、pCDNA3.1a-Cbl，通過(guò)測(cè)序鑒定目的基因序列是否完全正確. PCR引物序列如表1所示.

1.4.3 ? Western blot實(shí)驗(yàn)

用含有蛋白酶抑制劑的RIPA Buffer裂解液裂解細(xì)胞，冰浴30 min，13 200 r/min離心15 min后收集蛋白. 根據(jù)試劑說(shuō)明書(shū)的使用方法，用BCA（Bicinchoninic Acid）試劑法測(cè)定蛋白濃度. 取20 μg蛋白樣品與2×Load ?Buffer等體積混合，在100 ℃金屬浴中煮沸5 min之后上樣，采用80 V恒壓跑膠，待蛋白Mark分層后調(diào)至120 V恒壓跑膠，根據(jù)Mark顯示的位置，待目的蛋白到達(dá)合適位置后進(jìn)行轉(zhuǎn)膜. 100 V恒壓轉(zhuǎn)膜2 h，轉(zhuǎn)膜成功后，以5%的脫脂牛奶封閉1 h，之后加入對(duì)應(yīng)一抗4 ℃過(guò)夜孵育，二抗選用anti-mouse或anti-rabbit抗體室溫孵育2～4 h. 將PVDF膜置于化學(xué)發(fā)光信號(hào)檢測(cè)儀上，加入預(yù)先配制好的顯影液曝光1～5 min，并保存蛋白印跡圖片.

1.4.4 ? Real-time PCR 實(shí)驗(yàn)

使用Trizol試劑裂解細(xì)胞，采用氯仿抽提的方法提取細(xì)胞內(nèi)總RNA，通過(guò)逆轉(zhuǎn)錄獲得cDNA，用相對(duì)應(yīng)的定量引物進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，探究目的基因在RNA水平的表達(dá)情況，所用方法參照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作. Real-time PCR 反應(yīng)所用引物序列如表2所示.

1.4.5 ? 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均錄入Excel文檔中保存，對(duì)照組數(shù)據(jù)和處理組數(shù)據(jù)之間顯著性差異分析采用學(xué)生雙尾t值分析方法. 用*P<0.05、 **P<0.01和***P<0.001來(lái)表示顯著性差異程度，其中P<0.05被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義. 數(shù)據(jù)以means ± SD形式在圖表中顯示.

2 ? 結(jié)果與結(jié)論

2.1 ? HBV感染抑制Axin的表達(dá)和促進(jìn)PD-L1的

表達(dá)

Axin在WNT信號(hào)通路中起重要的調(diào)控作用[11]，為了檢測(cè)Axin在HBV調(diào)節(jié)抗病毒免疫過(guò)程中的作用，本文檢測(cè)了HLCZ01細(xì)胞和HBV感染的HLCZ01細(xì)胞內(nèi)Axin和PD-L1的表達(dá)，以探討Axin在HBV感染過(guò)程中的潛在作用. 利用實(shí)時(shí)熒光定量（Real-time PCR）方法，以MOI為20的HBV感染HLCZ01細(xì)胞45 d，提取細(xì)胞總RNA和細(xì)胞總蛋白. 利用Real-time PCR方法，以未被HBV感染的HLCZ01細(xì)胞為對(duì)照，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Axin和PD-L1的mRNA水平，發(fā)現(xiàn)HBV感染后不影響Axin和PD-L1的轉(zhuǎn)錄水平（圖1（a））. 利用Western Blot方法，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Axin和PD-L1的蛋白水平，發(fā)現(xiàn)HBV感染后抑制Axin蛋白的表達(dá)但促進(jìn)PD-L1蛋白的表達(dá)（圖1（b））. 為進(jìn)一步驗(yàn)證這一實(shí)驗(yàn)結(jié)果，在Huh7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染表達(dá)HBV的1.3倍復(fù)制子的質(zhì)粒，24 h以后提取細(xì)胞總RNA和細(xì)胞總蛋白. 利用Real-time PCR方法，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Axin和PD-L1的mRNA水平，發(fā)現(xiàn)HBV的1.3倍復(fù)制子抑制Axin的轉(zhuǎn)錄但不影響PD-L1的轉(zhuǎn)錄（圖1（c））. 借助Western Blot方法，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了HBV的1.3倍復(fù)制子質(zhì)粒的Huh7細(xì)胞內(nèi)的Axin蛋白水平明顯下調(diào)，而PD-L1的蛋白水平明顯上調(diào)（圖1（d））. 在Huh7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染質(zhì)粒p3×Flag-CMV-vector或p3×Flag-CMV-HBx，48 h后收取細(xì)胞總蛋白，利用Western Blot方法，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Axin和PD-L1的蛋白水平，發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染了HBx質(zhì)粒的Huh7細(xì)胞內(nèi)Axin的蛋白水平下降，而PD-L1的蛋白水平升高（圖1（e））. 基于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，推測(cè)HBV導(dǎo)致Axin和PD-L1蛋白水平發(fā)生變化可能是通過(guò)HBx實(shí)現(xiàn)的. 此外，以MOI為20的HBV感染HLCZ01細(xì)胞45 d，然后轉(zhuǎn)染質(zhì)粒p3×Flag-CMV-vector或p3×Flag-CMV-Axin（1 μg或2 μg），48 h后收取細(xì)胞總蛋白，利用Western Blot方法，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Axin過(guò)表達(dá)情況和PD-L1蛋白水平，研究發(fā)現(xiàn)在

HBV感染的HLCZ01細(xì)胞內(nèi)過(guò)表達(dá)Axin質(zhì)粒，能夠逆轉(zhuǎn)HBV感染引起的PD-L1蛋白水平降低現(xiàn)象（圖1（f））. 由圖1可知，在HBV感染肝細(xì)胞內(nèi)，Axin蛋白水平與PDL1蛋白水平呈負(fù)相關(guān)性.

2.2 ? Axin通過(guò)泛素化蛋白酶體途徑降解PD-L1

蛋白

為了進(jìn)一步明確Axin與PD-L1之間的關(guān)系，在Huh7細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒p3×Flag-CMV-vector或p3×Flag-CMV-Axin，48 h后收取細(xì)胞總蛋白，利用Western Blot方法，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Axin和PD-L1蛋白水平，發(fā)現(xiàn)Axin可降低細(xì)胞內(nèi)PD-L1蛋白水平（圖2（a））. 在Huh7和HEK293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒p3×Flag-CMV-vector或p3×Flag-CMV-Axin，48 h后收取細(xì)胞總RNA，利用Real-time PCR方法，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Axin和PD-L1的mRNA水平，發(fā)現(xiàn)在Huh7和293T細(xì)胞中過(guò)表達(dá)Axin對(duì)PD-L1的轉(zhuǎn)錄水平并無(wú)明顯影響（圖2（b））. 利用從湖南省腫瘤醫(yī)院收集48例肝癌病人癌旁組織樣本，提取組織總RNA，利用Real-time PCR方法，檢測(cè)組織內(nèi)Axin和PD-L1的mRNA水平，并通過(guò)SPSS軟件分析Axin與PD-L1之間的相關(guān)性，發(fā)現(xiàn)它們的mRNA并無(wú)相關(guān)性（圖2（c））. 在Huh7細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒p3×Flag-CMV-vector或p3×Flag-CMV-Axin，48 h后加入放線菌酮素（100 μg/mL CHX終濃度），15 min和30 min后分別收取細(xì)胞總蛋白，利用Western Blot方法，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Axin過(guò)表達(dá)情況和PD-L1蛋白水平，發(fā)現(xiàn)Axin對(duì)PD-L1的翻譯水平?jīng)]有影響（圖2（d））. 最后，對(duì)其翻譯后修飾水平進(jìn)行探究. 在Huh7細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒p3×Flag-CMV-vector或p3×Flag-CMV-Axin，48 h后分別加溶酶體降解途徑抑制劑（NH4Cl）[12]和蛋白酶降解途徑抑制劑（MG132），處理6 h后收取細(xì)胞總蛋白，利用Western Blot方法，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)Axin過(guò)表達(dá)情況和PD-L1的蛋白水平，發(fā)現(xiàn)Axin可能通過(guò)影響PD-L1的蛋白酶體降解發(fā)揮作用（圖2（e））. 另外，在HEK293T細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒p3×Flag-CMV-vector或p3×Flag-CMV-Axin和pCDNA3.1a-PD-L1，48 h后加蛋白酶降解途徑抑制劑（MG132），處理6 h后收取細(xì)胞總蛋白，以V5抗體進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)PD-L1的泛素化水平，發(fā)現(xiàn)Axin能促進(jìn)PD-L1的泛素化（圖2（f）（g））. 在Huh7細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染質(zhì)粒p3×Flag-CMV-vector或p3×Flag-CMV-Axin（1 μg或者2 μg）48 h后，在收取蛋白前6 h，加入蛋白酶降解途徑抑制劑（MG132）培養(yǎng)細(xì)胞，收取的細(xì)胞總蛋白以PD-L1抗體進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)PD-L1的泛素化水平，發(fā)現(xiàn)Axin對(duì)PD-L1的泛素化呈劑量依賴(lài)性. 基于上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果，認(rèn)為Axin可能通過(guò)蛋白酶體途徑降解PD-L1蛋白.

2.3 ? Axin通過(guò)影響E3連接酶SPOP的表達(dá)進(jìn)而調(diào)

控PD-L1的蛋白酶體降解

蛋白與蛋白質(zhì)之間的相互作用可能是通過(guò)直接或間接方式進(jìn)行的. 為明確Axin對(duì)PD-L1蛋白的調(diào)控方式，首先，在HEK293T細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染帶Flag標(biāo)簽的Axin和帶V5標(biāo)簽的PD-L1，通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)分析，發(fā)現(xiàn)Axin與PD-L1不存在直接相互作用（圖3（a））. 間接調(diào)節(jié)PD-L1的泛素化作用可能通過(guò)兩種方式，一種是調(diào)節(jié)其去泛素化酶的表達(dá)，另外一種是調(diào)節(jié)其泛素化酶的表達(dá). NF-kb信號(hào)通路活化后，可增強(qiáng)PD-L1去泛素化酶的表達(dá)[13]. 將質(zhì)粒p3×Flag-CMV-vector或p3×Flag-CMV-Axin轉(zhuǎn)染至Huh7細(xì)胞，48 h后分別收取細(xì)胞總蛋白，利用Western Blot和實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法，發(fā)現(xiàn)Axin對(duì)NF-kb信號(hào)通路的活化無(wú)作用（圖3（b））. 有文獻(xiàn)報(bào)道E3連接酶Cbl和SPOP可泛素化降解PD-L1[14-18]. 將質(zhì)粒p3 × Flag-CMV-vector或p3 × Flag-CMV-Axin轉(zhuǎn)染至Huh7細(xì)胞，48 h后收取細(xì)胞總RNA，利用Real-time PCR方法，檢測(cè)Axin對(duì)PD-L1的E3連接酶Cbl和SPOP的mRNA水平的影響，發(fā)現(xiàn)Axin對(duì)這兩種E3連接酶的mRNA水平并無(wú)影響（圖3（c））. 另外，將質(zhì)粒p3×Flag-CMV-vector或p3×Flag-CMV-Axin （1 μg或者2 μg）和pCDNA3.1a-Cbl或者pCDNA3.1a-SPOP轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞，48 h后收取細(xì)胞總蛋白，利用Western Blot方法，檢測(cè)Axin對(duì)Cbl和SPOP蛋白水平的影響，發(fā)現(xiàn)Axin可增強(qiáng)SPOP的蛋白表達(dá)（圖3（d））. 有文獻(xiàn)報(bào)道PD-L1主要通過(guò)K48位和K63位進(jìn)行泛素化降解[19-21]，將質(zhì)粒p3 × Flag-CMV-vector或p3 × Flag-CMV-Axin和pCDNA3.1a-PD-L1和野生型、K48或者K63的HA質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至HEK293T細(xì)胞，以V5抗體進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)，檢測(cè)其對(duì)PD-L1蛋白泛素化的影響，發(fā)現(xiàn)Axin促進(jìn)K48依賴(lài)的PD-L1泛素化降解（圖3（e））.

綜上所述，本文認(rèn)為HBV可能通過(guò)其HBx下調(diào)Axin蛋白水平，降低PD-L1的E3連接酶SPOP蛋白水平，進(jìn)而抑制K48依賴(lài)的PD-L1泛素化降解，導(dǎo)致HBV感染肝細(xì)胞內(nèi)PD-L1蛋白含量增加（圖3（f））.

3 ? 討 ? 論

在HBV誘導(dǎo)的肝細(xì)胞癌中，癌組織中的Axin蛋白水平明顯低于其鄰近組織，但HBV下調(diào)Axin蛋白表達(dá)的機(jī)制尚不明確. 本文對(duì)HBV抑制Axin蛋白表達(dá)的機(jī)制進(jìn)行了研究，發(fā)現(xiàn)HBx可能參與了HBV對(duì)Axin蛋白水平的下調(diào)作用. 文獻(xiàn)[22-24]研究表明，在乙型肝炎病毒相關(guān)性肝癌組織中，CD8+T細(xì)胞功能異常且耗竭，其特征是PD-1高表達(dá)，干擾素-γ和腫瘤壞死因子分泌減少，但HBV感染誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)PD-L1表達(dá)的機(jī)制仍不清楚. 本文研究發(fā)現(xiàn)在HBV感染的肝細(xì)胞內(nèi)，Axin蛋白表達(dá)明顯下調(diào)而PD-L1蛋白表達(dá)顯著增加. 通過(guò)相關(guān)細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和臨床數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)表明，Axin不能調(diào)節(jié)WNT信號(hào)通路下游轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)進(jìn)而影響PD-L1的轉(zhuǎn)錄水平. 另外，一個(gè)蛋白影響另外一個(gè)蛋白的表達(dá)，也有可能是調(diào)節(jié)它翻譯后的降解水平來(lái)實(shí)現(xiàn)的. 通過(guò)添加相關(guān)抑制劑，發(fā)現(xiàn)Axin通過(guò)影響PD-L1的蛋白酶體降解途徑，降低病毒感染細(xì)胞內(nèi)PD-L1水平. 進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)Axin可能通過(guò)影響PD-L1的E3連接酶SPOP的表達(dá)，進(jìn)而發(fā)揮其促進(jìn)PD-L1泛素化降解作用，但Axin影響SPOP表達(dá)的具體機(jī)制仍有待進(jìn)一步研究. 另外，本研究只選擇了與PD-L1相關(guān)的兩種E3連接酶進(jìn)行了研究，Axin是否對(duì)作用于PD-L1的其他E3連接酶有影響還有待進(jìn)一步探討.

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收稿日期：2020-05-03

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81730064，81571985），National Natural Science Foundation of China（81730064，81571985）;國(guó)家科技重大專(zhuān)項(xiàng) （2017ZX10202201），National Science and Technology Major Project（2017ZX10202201）

作者簡(jiǎn)介：朱海珍（1969—），男，湖北襄陽(yáng)人，湖南大學(xué)教授，博士

通信聯(lián)系人，E-mail：zhuhaizhen69@yahoo.com