納豆發(fā)酵原料篩選及其功能產(chǎn)品的開(kāi)發(fā)

龍繼艷，戴明，鐘瑤，李夢(mèng)鑫，蔣詠梅

（福建師范大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，福建福州 350007）

納豆風(fēng)味獨(dú)特，是以大豆為原料經(jīng)蒸煮后接入枯草芽孢桿菌發(fā)酵而成的傳統(tǒng)食品，至今已有上千年的歷史。1987年，Sumi等人[1]首次從納豆中提取到納豆激酶，并對(duì)其進(jìn)行系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)其屬于絲氨酸蛋白酶，具有顯著的溶栓活性，可切開(kāi)血栓上的纖維蛋白凝塊。除此之外，納豆激酶還可以誘導(dǎo)纖溶酶原激活劑的產(chǎn)生，從而激活自身的纖溶系統(tǒng)[2]。納豆激酶安全無(wú)毒，在人體內(nèi)溫度和pH條件下，性能穩(wěn)定，半衰期長(zhǎng)，能夠溫和持續(xù)地預(yù)防血栓的形成。除含有納豆激酶外，納豆中的糖肽活性物質(zhì)、胰蛋白酶抑制劑、異黃酮和多胺等抗癌物質(zhì)的含量也遠(yuǎn)高于原料大豆，食用納豆及相關(guān)產(chǎn)品不僅可以防治心血管疾病，還有助于人體健康。

20世紀(jì)90年代以來(lái)，納豆的發(fā)酵工藝已成為研究熱點(diǎn)，除對(duì)傳統(tǒng)的大豆固體發(fā)酵納豆工藝進(jìn)行優(yōu)化之外，人們嘗試了豆粕、豆渣等多種原料[3]，并通過(guò)液體發(fā)酵方式提高納豆激酶的產(chǎn)量[4]，均取得一定進(jìn)展。盡管納豆的保健功能已為眾人熟知，但納豆相關(guān)產(chǎn)品在我國(guó)市場(chǎng)占有率很低，其原因是在納豆發(fā)酵過(guò)程中，大豆蛋白質(zhì)降解為氨基酸時(shí)產(chǎn)生一種特殊的氨臭味。因此，降低納豆中氨臭味成為其市場(chǎng)化的關(guān)鍵所在。本實(shí)驗(yàn)選擇黃豆、綠豆和紅豆作為原料發(fā)酵納豆，綜合感官評(píng)價(jià)、酶活測(cè)定和體外溶栓實(shí)驗(yàn)結(jié)果，選擇最適原料進(jìn)行納豆產(chǎn)品的研制，以期為納豆食品的開(kāi)發(fā)提供有益的參考。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

1.1.1 原料

納豆芽孢桿菌，本實(shí)驗(yàn)室分離保藏。

1.1.2 儀器與試劑

HWS-250恒溫恒濕培養(yǎng)箱，寧波新藝超聲儀器設(shè)備有限公司；HWS24電熱恒溫水浴鍋，上海一恒科技有限公司；GI54DWS高壓蒸汽滅菌鍋，廈門精藝興業(yè)科技有限公司；TG16-WSD臺(tái)式高速離心機(jī)，湖南湘儀儀器有限公司；SW-CJ-2D凈化工作臺(tái)，蘇州智凈凈化設(shè)備有限公司。

牛纖維蛋白原、牛凝血酶，上海源葉生物科技有限公司；尿激酶，中國(guó)食品藥品檢定研究院。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌種活化及種子液制備

斜面保藏菌株接入30 mL液體種子培養(yǎng)基，37 ℃、180 r/min恒溫振蕩培養(yǎng)24 h。

1.2.2 納豆發(fā)酵工藝

分別選取黃豆、綠豆和紅豆，清洗浸泡16 h使之充分吸水膨脹，瀝水后于121 ℃滅菌20 min，冷卻至50 ℃左右，2 %接種量接入種子液，30 ℃恒溫培養(yǎng)24 h，置4 ℃冰箱后熟。

1.2.3 酶液制備

取適量納豆樣品于燒杯中，加入5倍體積NaCl溶液（0.9%），攪拌2 h，4 ℃下10 000 r/min離心5 min，取上清液備用。

1.2.4 納豆激酶活性測(cè)定

采用纖維蛋白平板法[5]。以不同濃度尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品（100 U/mL、200 U/mL、300 U/mL、400 U/mL、500 U/mL）各10 μL點(diǎn)樣于纖維蛋白平板，以溶解圈面積為橫坐標(biāo)，酶活力為縱坐標(biāo)作圖，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。以待測(cè)粗酶液代替尿激酶標(biāo)準(zhǔn)品，其余條件同上，測(cè)量溶解圈的直徑，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算納豆激酶活力。

1.2.5 納豆激酶體外溶栓實(shí)驗(yàn)

稀釋待測(cè)酶液至10倍、50倍、200倍和1 000倍，取原液和各個(gè)稀釋液6 mL置于50 mL潔凈干燥離心管中，以pH為7.2的磷酸緩沖液為空白對(duì)照。取自然凝固新鮮雞血，分割為1.5 g左右小血塊，分別稱重（W1）后加入上述離心管，37 ℃恒溫水浴，分別于0 h、4 h、8 h、12 h和16 h取出血塊后稱重（W2），根據(jù)公式（1）計(jì)算溶解率。

1.2.6 納豆糕的研制

納豆碾碎，加入一半重量的炒熟面粉及適量白砂糖，揉捏混合均勻，裝入模具，制成成品。

從氣味、口感、色澤、外型、內(nèi)部組織5個(gè)最為直觀的角度，設(shè)計(jì)納豆糕感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)如表1所示。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同原料對(duì)納豆發(fā)酵的影響

黃豆、綠豆和紅豆分別經(jīng)清洗浸泡、高壓蒸煮后，進(jìn)行納豆發(fā)酵。感官特征如表2所示，黃豆納豆的豆粒完整、口感綿軟；紅豆納豆的豆粒完整度低、硬度較大，口感較差；綠豆納豆雖完整性較弱，但口感綿軟。不同種類豆粒的內(nèi)部結(jié)構(gòu)存在差異，因此需要的浸泡時(shí)間和蒸煮條件也不相同[6]。根據(jù)納豆的菌膜厚度和拉絲長(zhǎng)度可初步判斷發(fā)酵過(guò)程中納豆菌的生長(zhǎng)情況。由表2可見(jiàn)，黃豆納豆的菌膜最厚，粘液多，拉絲長(zhǎng)約28 cm，說(shuō)明納豆菌生長(zhǎng)良好。相比黃豆，綠豆表面的菌膜較薄，拉絲較短，約15 cm。3種納豆中，紅豆的發(fā)酵度最低。黃豆納豆雖發(fā)酵完全、口感綿軟，但氨味也十分明顯，比較而言，綠豆和紅豆的氨味均較低，屬于可以接受的范圍。

表1 納豆糕感官評(píng)定標(biāo)準(zhǔn)

表2 納豆感官特征

2.2 納豆激酶活力測(cè)定結(jié)果

如圖1所示，溶解圈面積與納豆激酶活性呈線性正相關(guān)，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為Y=4.692 64X-463.707 4，R2=0.996 09。

圖1 尿激酶纖溶性擬合曲線

利用纖維蛋白平板法檢測(cè)3種納豆的激酶活性。根據(jù)平板上透明圈半徑，通過(guò)圖1的標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算納豆激酶的活性，結(jié)果如圖2所示。3種納豆中，黃豆納豆酶活最高，達(dá)5 131.65 U/g，綠豆納豆的酶活2 338.02 U/g，紅豆僅139.38 U/g。與目前市售納豆[7]相比，本實(shí)驗(yàn)中黃豆納豆的激酶活性較高，綠豆納豆的酶活性適中，紅豆納豆則明顯低于市售納豆。

2.3 納豆激酶體外溶栓結(jié)果

圖2 3種納豆激酶活性

如圖3所示，3種納豆激酶中，溶栓效果最好的是黃豆；3種納豆在18 h內(nèi)對(duì)血凝塊的溶解效率分別為55.8%、37.0%和24.4%，黃豆和綠豆納豆激酶溶栓速率較快，8 h內(nèi)即可完成，紅豆納豆激酶不僅溶栓效果弱，速度也相對(duì)較慢。該結(jié)果與3種納豆的激酶活性相對(duì)應(yīng)：隨著酶液稀釋倍數(shù)的增加，血塊的溶解效率顯著減弱，可見(jiàn)不同劑量的納豆激酶對(duì)血凝塊的溶解率有明顯影響。

2.4 納豆糕的研制

由上述結(jié)果可見(jiàn)，黃豆納豆的酶活最高，體外溶栓效果最好，但卻有濃重的令人難以接受的氨味。而紅豆納豆的酶活力和體外溶栓效果均較低，保健價(jià)值不高。相比較而言，綠豆納豆不僅有較高的納豆激酶活性和良好的體外溶栓效果，且氨味較淡，具有良好的開(kāi)發(fā)前景。因此，以綠豆納豆為原料進(jìn)行了綠豆糕的研制，并隨機(jī)挑選15位感官評(píng)測(cè)員，根據(jù)表1進(jìn)行品鑒打分，成品和評(píng)分結(jié)果見(jiàn)圖4。

圖3 納豆激酶對(duì)血凝塊的溶解效果

圖4 納豆糕成品及評(píng)價(jià)

由圖4A可見(jiàn)，綠豆納豆糕外型美觀、紋路清晰、顏色偏黃、外形完整。由圖4B可見(jiàn)，納豆糕的總體食用性還有待提高。單項(xiàng)指標(biāo)中，氣味與色澤得分最低，均為8.3分?？梢?jiàn)綠豆納豆雖優(yōu)于黃豆納豆，但其氨味仍不容忽視，后期可從改進(jìn)納豆發(fā)酵工藝或調(diào)整納豆糕配比兩方面入手進(jìn)行優(yōu)化?？诟?、外形、內(nèi)部組織得分較高?？诟兄笜?biāo)中，大多數(shù)評(píng)測(cè)員選擇“略粘牙”，說(shuō)明納豆糕的咀嚼感需要改進(jìn)，可通過(guò)添加少許油脂改善口感，若添加過(guò)多，反而會(huì)引發(fā)“三高”癥狀，與納豆糕的保健功能背道而馳。外形評(píng)分和內(nèi)部組織評(píng)分較高，部分評(píng)測(cè)員打分較低的原因是吃到細(xì)小的白砂糖顆粒，后續(xù)可采用綿白糖替代白砂糖。

本實(shí)驗(yàn)納豆糕是由綠豆納豆、熟面粉和白砂糖3種成分組成，未添加油脂和其他成分，因此在感官評(píng)測(cè)方面有少許欠缺，后續(xù)可針對(duì)性增添其他成分，以達(dá)到更優(yōu)的口感和保健效果。

3 結(jié)論

選擇黃豆、綠豆和紅豆進(jìn)行納豆發(fā)酵，對(duì)3種納豆激酶的活性和溶栓效果進(jìn)行檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)黃豆為原料發(fā)酵納豆的酶活最高，達(dá)5 319.30 U/g，體外溶栓效果最好。選擇氨味較弱、納豆激酶活性較高及溶栓效果較好的綠豆納豆進(jìn)行納豆糕的研制，并對(duì)成品進(jìn)行了感官評(píng)測(cè)，該結(jié)果可對(duì)納豆相關(guān)食品的開(kāi)發(fā)提供參考。