酶工程在醫(yī)藥中的應(yīng)用

王艷寶

（江蘇晶立信醫(yī)藥科技有限公司，江蘇南京 210000）

酶工程是應(yīng)用生物技術(shù)的主要研究內(nèi)容之一，其在工農(nóng)業(yè)、醫(yī)藥衛(wèi)生及環(huán)保等領(lǐng)域均有應(yīng)用。當(dāng)下，環(huán)境污染程度加重、食品安全問題屢次出現(xiàn)，人們主觀上對(duì)綠色生物工藝的渴求度顯著提高。酶工程作為生物催化的核心，歷經(jīng)數(shù)十年的發(fā)展歷程，其研究內(nèi)容日漸深入化，涉及到全細(xì)胞催化劑、核酸酶等諸多領(lǐng)域。若能在醫(yī)藥生產(chǎn)中合理應(yīng)用酶工程，則能使醫(yī)藥工業(yè)健康、持續(xù)發(fā)展獲得更強(qiáng)大的技術(shù)支撐，創(chuàng)造出更大的效益。

1 酶工程的介紹

酶工程也被叫作蛋白質(zhì)工程學(xué)，是指在某種條件下應(yīng)用酶的催化功能，并配合使用相應(yīng)的反應(yīng)器與反應(yīng)條件生成相應(yīng)的催化化學(xué)反應(yīng)。當(dāng)下，酶工程在工業(yè)、農(nóng)業(yè)及醫(yī)藥工業(yè)領(lǐng)域中均有一定應(yīng)用，發(fā)揮出很大的現(xiàn)實(shí)作用。在科學(xué)技術(shù)日新月異的背景下，重組DNA 技術(shù)有很大發(fā)展，其對(duì)批量生產(chǎn)具有一定醫(yī)療價(jià)值的酶有促進(jìn)作用，酶工程也逐漸被用于臨床醫(yī)療領(lǐng)域中[1]。

因?yàn)槊缸陨碛休^強(qiáng)的催化特性，這在很大程度上決定了其高應(yīng)用效率，以往有實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，酶的催化作用是非催化物的108～1020 倍，是非酶催化的107～1013 倍，這表明酶的催化作用在效率方面占據(jù)很大優(yōu)勢。此外，酶還具備反應(yīng)條件溫和、高度轉(zhuǎn)移性與可調(diào)控等屬性。

2 酶工程技術(shù)的主要類型

2.1 酶與細(xì)胞的固定化

主要是采用物理或者化學(xué)方法把酶或者細(xì)胞固定在膜狀、顆粒樣、管樣載體上，這些載體可以是水溶性或者非水溶性的。當(dāng)下，我國自主研發(fā)過的固定化酶大概有五十種，其主要被分為三種類型[2]：一是固定化單酶或者含有特定酶的細(xì)胞；二是固定化雙酶；三是由固定化各種激酶組建而成的ATP 再生系統(tǒng)。該項(xiàng)技術(shù)最大的特征是能顯著提高酶的耐熱性、耐酸堿性。吸附、共價(jià)整合、包埋等是常見的固定化法，近些年又陸續(xù)開發(fā)了以光照、輻射為載體的物理技術(shù)與定點(diǎn)固定化技術(shù)法。在制藥工業(yè)中，包埋法的使用率相對(duì)較高，吸附法次之。

2.2 酶的化學(xué)修飾

實(shí)質(zhì)上就是在化學(xué)方法的協(xié)助下，將一些化學(xué)物質(zhì)或基因整合到酶分子上，或者對(duì)酶分子的局部進(jìn)行刪減或置換處理，借此方式修整酶的理化性質(zhì)，最后實(shí)現(xiàn)整改酶自身催化性質(zhì)的目標(biāo)。氨基、咪哇基等是修飾酶的常見功能基團(tuán)。酶分子中或者不同分子間進(jìn)行交互聯(lián)接時(shí)，利用一些功能試劑分子兩側(cè)的功能基團(tuán)能夠?qū)崿F(xiàn)，交聯(lián)后形成的酶熱穩(wěn)定性與抗蛋白酶的性能均得到提升；結(jié)合酶和高分子化合物，不僅能提高酶的穩(wěn)定性，還能改善其生物活性。乙酸配、氮芥類等均是常用的修飾劑。

2.3 酶標(biāo)藥物

最近幾年中，國內(nèi)外很多學(xué)者依照藥物在生物機(jī)體中可能的作用對(duì)象去設(shè)計(jì)研發(fā)藥物，通過以上途徑制備出的藥物被叫做酶標(biāo)藥物。當(dāng)下，這種設(shè)計(jì)方法已經(jīng)成為藥物設(shè)計(jì)領(lǐng)域中的主流形式，在開發(fā)新藥品方面表現(xiàn)出良好效能。血管緊張素肽轉(zhuǎn)換酶（ACE）抑制劑便是該法應(yīng)用的典型實(shí)例，ACE 抑制劑是臨床上經(jīng)常使用的一種降壓類藥物。過往有研究發(fā)現(xiàn)，艾滋?。ˋIDS）病毒顆粒表層吸附的蛋白酶是導(dǎo)致AIDS 感染和傳播的“罪魁禍?zhǔn)住保识鳤IDS 病毒蛋白酶成為了醫(yī)藥工業(yè)領(lǐng)域中的一大熱點(diǎn)，很多學(xué)者期盼通過研發(fā)相應(yīng)的抑制劑，去探尋防治AIDS 的新方法。

2.4 核酸酶

這是一種由核糖核酸（RNA）構(gòu)成的酶，其核酸序列表現(xiàn)出高度的特異性。若能獲知某種核酸酶的核苷酸序列，則便能順利的設(shè)計(jì)出具備自我切割功能的核酸構(gòu)成，參照這些基因組的序列特征，能研制出防治一些人、禽畜與植物病毒病的核酸酶，比如流感、肝炎等。

3 酶工程在醫(yī)藥中的應(yīng)用

3.1 制備生物代謝產(chǎn)物

采用固定化細(xì)胞能夠批量化生產(chǎn)多種初級(jí)或者中間產(chǎn)物，比如糖、有機(jī)酸以及氨基酸等，D-果糖、甘油、檸檬酸、蘋果酸等均是典型產(chǎn)品。如下列舉兩個(gè)例子進(jìn)行闡述：

1）利用包埋法或者吸附法固定化（IMM30）發(fā)酵制造出甘油。也可以使用海藻酸鈣與卡拉膠包埋法制造出甘油，生產(chǎn)量依次是23.6g/L 與27.4g/L，也可以使用聚丙烯酰肼（PAAH）包埋法，甘油產(chǎn)量最高能達(dá)到32g/L。而如果燒結(jié)玻璃吸附法生產(chǎn)出的甘油，其濃度能夠達(dá)到26.2～29.5 燒結(jié)玻璃吸附，持續(xù)轉(zhuǎn)動(dòng)400h，大部分細(xì)胞依然能和載體維持結(jié)合狀態(tài)[3]。

2）采用海藻酸鈣包埋法生產(chǎn)制造檸檬酸，持續(xù)運(yùn)轉(zhuǎn)12d 后，檢測發(fā)現(xiàn)反應(yīng)液內(nèi)檸檬酸濃度能維持在14g/L 左右，和批式法相比較，連續(xù)柱反應(yīng)器能取得更好效果，主要由于伴隨反應(yīng)產(chǎn)物內(nèi)檸檬酸濃度的提高，對(duì)菌體利用葡萄糖的效率形成一定抑制作用。

3.2 生產(chǎn)抗生素

現(xiàn)代酶工程有技術(shù)先進(jìn)、廠房設(shè)備成本低、工藝構(gòu)成簡單、能耗少、產(chǎn)品回收率高、效益產(chǎn)出量大及污染輕微等優(yōu)勢特征，逐漸成為醫(yī)藥化工領(lǐng)域中的“主力軍”。過往應(yīng)用化學(xué)合成、微生物發(fā)酵等傳統(tǒng)工藝技術(shù)生產(chǎn)制備出的藥品，都可以利用酶工程制造出來，甚至能夠開發(fā)出傳統(tǒng)技術(shù)不能制造出的昂貴藥物，比如人胰島素、7-ACA、6-APA 以及7-ADAC 等[4]。既往有很多人員采用酶法制備7-ACA、7-ADAC 等中間體，而后利用半合成工藝制造出臨床醫(yī)療中廣泛應(yīng)用的多種內(nèi)酰胺抗生素，并且部分抗生素在生物轉(zhuǎn)化階段，因需要部分輔因子參與反應(yīng)過程，導(dǎo)致單純使用酶法轉(zhuǎn)化不能取得預(yù)期效果，只能利用微生物轉(zhuǎn)化過程取落實(shí)子厚的化學(xué)修飾工作。

可以采用青霉素酰化酶生產(chǎn)抗生素，選用天然芐青霉素做底物，產(chǎn)物以6-APA、7-ADAC 等為主；也可以采用頭孢菌素?；?、無色桿菌生產(chǎn)D-苯甘氨酸甲酯+7-ADAC，形成的產(chǎn)物均是頭孢氨芐。

3.3 制藥工業(yè)

金血檢中，藥物的化學(xué)結(jié)構(gòu)復(fù)雜度有很大提升，環(huán)保事業(yè)在推進(jìn)階段對(duì)綠色合成工藝技術(shù)也提出更多的新要求。在這樣的背景下，制藥產(chǎn)業(yè)也在不斷探尋成本更低、更安全穩(wěn)定、更綠色環(huán)保的生物催化工藝。在生物合成階段，合理使用生物化學(xué)工藝能顯著提升一些化學(xué)合成效率，比如手性胺合成、區(qū)域羥基化以及部分氧化還原反應(yīng)等。

甾體類藥物為繼抗生素類藥物以后的第二大類藥物。維生素轉(zhuǎn)化階段能夠完全或者局部解除甾體類藥物產(chǎn)量低、類型繁雜、醫(yī)藥市場需求量缺口較大等現(xiàn)實(shí)問題，但微生物合成階段暴露出副產(chǎn)物與目標(biāo)產(chǎn)物結(jié)構(gòu)相似度高、副產(chǎn)物分離難度大、產(chǎn)品難溶于水及轉(zhuǎn)換效率偏低等不足，對(duì)甾體制藥行業(yè)持續(xù)、健康發(fā)展形成一定制約作用。在科學(xué)分析甾醇微生物代謝過程機(jī)制與代謝路徑調(diào)整控制的基礎(chǔ)上，逼著構(gòu)建了以分枝桿菌甾醇代謝為基礎(chǔ)的靶向性基因編輯平臺(tái)，通過合理敲除或者敲進(jìn)靶基因，創(chuàng)新研發(fā)出了和目標(biāo)產(chǎn)物相配套的代謝工程類菌種，該類菌種的特點(diǎn)有選擇性高、降解率偏低等[5]。以此為基礎(chǔ)，從多個(gè)方面認(rèn)識(shí)分枝桿菌細(xì)胞膜在提獲和轉(zhuǎn)化甾醇過程中的重要作用，研發(fā)了科學(xué)修飾細(xì)胞膜重要組分的技術(shù)方法，這能同步提升微生物水相吸收與甾醇轉(zhuǎn)化率。正因如此，逼著成功創(chuàng)建了一個(gè)緊扣甾體藥物合成的“細(xì)胞工廠”，其制造出雄甾烯酮、C22 羥基孕酮等多種甾體中間體。并且還設(shè)計(jì)了新分枝桿菌內(nèi)甾醇分解代謝內(nèi)的限速流程，并由M.neoaurum 內(nèi)挖出參與以上環(huán)節(jié)的兩種膽固醇，分別是ChoM1、ChoM2，后者和其他膽固醇氧化酶基因的相似度僅有45%。為證實(shí)ChoM1、Cho M2 組合在以上步驟運(yùn)行階段發(fā)揮的作用，還研發(fā)了如下方法：強(qiáng)化新霉屬菌株內(nèi)膽固醇氧化酶的生物活性去應(yīng)對(duì)這種限速作用，借此方式去提高甾醇轉(zhuǎn)化效率。

也可以采用生物催化工藝制備西他列汀，本品藥物是當(dāng)下臨床治療2 型糖尿?。═2DM）的常用藥，在1mol/L、40℃的反應(yīng)條件下，選用50%的DMSO 作為助溶劑，能使200g/L 西他列汀前體酮轉(zhuǎn)化率達(dá)到100%，產(chǎn)物ee＞99.95%[6]。和傳統(tǒng)銠催化工藝做比較，生物催化不僅能提高底物的利用效率，解除對(duì)稀有重金屬（Rh）的需求，還能較明顯的提高總收率，最后產(chǎn)率提升了50%左右。

3.4 臨床體外檢測試劑

近些年，國內(nèi)大型綜合醫(yī)院臨床陸續(xù)使用了生物傳感器，多被用于監(jiān)測監(jiān)護(hù)環(huán)節(jié)，生物傳感器的存在具有較高的權(quán)威性，其作為酶工程技術(shù)在臨床體外檢測領(lǐng)域中的一項(xiàng)重大應(yīng)用，是由固定化酶整合形成的，比如安放在動(dòng)脈或者靜脈內(nèi)的葡萄糖傳感器，其功能主要是有效、連續(xù)的監(jiān)測機(jī)體內(nèi)血糖含量，并把有關(guān)信息快捷的反饋給植在人體內(nèi)部的胰島素泵，借此方式精準(zhǔn)的調(diào)控胰島素泵內(nèi)的胰島素釋放量，進(jìn)而提升病患的治療效果，改善預(yù)后。

總之,酶工程的重要作用已經(jīng)得到世界各國的公認(rèn)，應(yīng)進(jìn)一步發(fā)揮其自身的催化功能、拓展應(yīng)用范疇及提升應(yīng)用效率等，以上均是酶工程應(yīng)用研究的主要內(nèi)容。相關(guān)人員在實(shí)踐中應(yīng)持續(xù)探索提升固定化、分子修飾等技術(shù)應(yīng)用效果的方法，將其應(yīng)用范疇逐漸拓展至生物芯片、蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)與功能研發(fā)等領(lǐng)域中，使酶工程在醫(yī)藥領(lǐng)域中將自身價(jià)值發(fā)揮到最大化。