基因檢測技術(shù)應(yīng)用于溺死診斷的研究進(jìn)展

劉泉，柯技，王樹法

（湖北警官學(xué)院，湖北 武漢）

0 引言

判斷水中尸體是生前溺死還是死后拋尸是法醫(yī)學(xué)實踐中是常見的工作之一。目前，診斷溺死的常用方法是在觀察尸體征象的基礎(chǔ)上，結(jié)合光鏡下檢驗硅藻。傳統(tǒng)光鏡下檢驗硅藻存在檢材消耗量大、實驗過程安全性不高、實驗過程損耗高、污染系數(shù)高等問題，常被法醫(yī)工作者詬病。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，基因檢測技術(shù)相較于光鏡下檢驗硅藻有取材用量少、一次性檢驗樣本多、易于浮游生物種屬分類、實驗過程安全等優(yōu)勢，為輔助溺死診斷提供了新的研究方向。本文將對相關(guān)研究現(xiàn)狀作綜述，以供同行參考。

1 基因檢測技術(shù)用于藻類檢驗

使用基因檢測技術(shù)檢驗藻類的某些特有基因片段，不僅可用于硅藻檢驗，還可用于其他傳統(tǒng)方法不易辨認(rèn)的藻類的檢驗，甚至可進(jìn)行溺死地點(diǎn)的推斷[1]，從而為輔助溺死診斷提供更多證據(jù)。

1.1 檢測藻類核基因

目前，藻類核基因中研究最多的是核糖體基因，即編碼rRNA 相對應(yīng)的染色體上的DNA 序列，簡稱rRNA 基因或rDNA。根據(jù)rRNA 的沉降系數(shù)，原核生物的rRNA 分為5SrRNA、16SrRNA 和23SrRNA；真核生物的rRNA 分為5SrRNA、5.8SrRNA、18SrRNA 和28SrRNA，它們之間被轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)（ITS）間隔開。

其中，16S rDNA（真核為18S rDNA）片段長度在1500 bp 左右，廣泛存在于浮游生物的染色體中，也是通常所說的小核糖體亞基（SSU）[2]，其序列相對保守，有9 個可變區(qū)域，可為種屬鑒別提供豐富的信息，因此是應(yīng)用非常廣泛的理想檢測標(biāo)記之一。Tie 等人[3]對溺死者組織進(jìn)行PCR后檢測，發(fā)現(xiàn)藍(lán)藻的16S rDNA 片段用于溺死診斷的靈敏度明顯優(yōu)于傳統(tǒng)的硅藻檢驗法，為除硅藻外的其他藻類輔助診斷溺死提供了依據(jù)。何方剛等人[4-5]研究表明使用PCR 技術(shù)擴(kuò)增浮游生物16SrDNA 第三、第四可變區(qū)可用于溺死的定性診斷，使用PCR-DGGE 法擴(kuò)增檢測相應(yīng)基因片段還可用于溺死地點(diǎn)的推斷。為克服不能同時擴(kuò)增多種與溺死相關(guān)藻類，李鵬等人[6]設(shè)計出針對多種藻類16S rDNA 片段的特異性引物，發(fā)現(xiàn)該方法有較好的應(yīng)用前景。

由于應(yīng)用硅藻診斷溺死較為成熟，有許多研究僅關(guān)注基因檢驗技術(shù)用于硅藻的檢測。周玉倩[7]以硅藻特異的18S rRNA 基因片段為對象，比較了PCR 和PCR-DGGE，發(fā)現(xiàn)用PCR 技術(shù)擴(kuò)增硅藻18S rDNA 基因片段診斷溺死的靈敏度和特異性優(yōu)于傳統(tǒng)的硅藻強(qiáng)酸消化法，但PCR-DGGE 得到的條帶卻不明顯，分析可能是因為前期擴(kuò)增產(chǎn)物量較低的原因。胡蝶等人[8]使用PCR 技術(shù)構(gòu)建了硅藻18S rDNA 克隆文庫，為使用硅藻18S rDNA 推斷溺死地點(diǎn)提供了更多信息。余政梁等人[9]采用PCR-DHPLC 法檢測硅藻的SSU 片段，結(jié)果顯示該方法檢出的硅藻種類明顯多于微波消解掃描電鏡法，可為溺死診斷和溺死地點(diǎn)的推斷提供更多的信息。使用硅藻進(jìn)行溺死地點(diǎn)的推斷還可選用5.8S+ITS2 片段，該片段長度在300～400 bp，有高度的特異性，被認(rèn)為是區(qū)分不同硅藻物種的最可靠的標(biāo)記[10]。袁文勇等人[11]針對硅藻的5.8S+ITS2 分子標(biāo)記，使用PCR-CE 法對2 個案例進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)該遺傳標(biāo)記也可用于溺水及溺水地點(diǎn)的診斷。

1.2 檢測藻類葉綠體基因

一般來說，任意兩種植物的葉綠體基因同源性不少于30%，因此檢測葉綠體基因也可以對藻類進(jìn)行分類。目前，有用于溺死研究的藻類葉綠體基因有核酮糖-1,5-二磷酸羧化/ 加氧酶人亞基基因（rbcL）、葉綠體23SrDNA 基因的V結(jié)構(gòu)域（UPA）、葉綠素a 脫輔基蛋白基因（EG）和藻黃素-葉綠素a/c 蛋白基因（SK）等。

EG 片段長度在200 bp 左右，SK 片段長度在250 bp 左右，均是廣泛分布在各個水域中藻類的葉綠素相關(guān)基因。Abe 等人[12]使用PCR 方法擴(kuò)增EG（EG1、EG2）和SK（SK1 和SK2），發(fā)現(xiàn)EG 相較于SK 能檢測更多種硅藻，用來溺死診斷的實用價值更大。李小廷等人[13]的研究也證實了該方法的陽性檢出率高于硝酸消化法，但也發(fā)現(xiàn)常規(guī)PCR 技術(shù)檢測EG 和SK，目前無法進(jìn)一步進(jìn)行種屬分類用于溺死地點(diǎn)的推斷。UPA 片段約長370bp，主要集中在紅藻的研究中，研究表明其具有較高的通用性和分辨力，能在種的水平上，把大多數(shù)的紅藻物種區(qū)分開來[14]，具有用于溺死地點(diǎn)推斷的潛力。劉向東等人[15]建立了針對硅藻UPA 條形碼基因的qPCR 檢測方法，對28例溺死和4例非溺死者的肺、肝、腎以及尸體發(fā)現(xiàn)地水樣進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)其不僅適用于溺死案件的輔助診斷，而且靈敏度顯著高于傳統(tǒng)的PCR 技術(shù)。rbcL 基因長度約為1400bp，其rbcL-3′端擴(kuò)增測序效率極高，出現(xiàn)內(nèi)含子的概率較小，適于硅藻的分類。彭帆等人[16]建立了溺死尸體組織內(nèi)硅藻rbcL 基因的PCR-CE 檢測方法，發(fā)現(xiàn)當(dāng)溺死尸體組織樣本中硅藻含量＞10 個/10 g 時，該方法的檢出率與微波消解-真空抽濾-自動掃描電鏡法（MD-VFAuto SEM）相比無統(tǒng)計學(xué)差異；當(dāng)硅藻含量＜10 個/10 g 時，該方法的檢出率顯著小于MD-VF-Auto SEM 法。

1.3 檢測藻類線粒體基因

藻類線粒體基因一般分為兩類：一是與呼吸作用有關(guān)的基因，如細(xì)胞色素基因、細(xì)胞色素氧化酶基因、ATP 合成酶基因及琥珀酸脫氫酶基因等；二是與轉(zhuǎn)錄和翻譯有關(guān)的基因，如包括tRNA、rRNA 等。

目前，藻類中研究較多的是細(xì)胞色素C 氧化酶基因（COX-Ⅰ），COX-Ⅰ上有長度為500bp 左右的片段，能進(jìn)行多種藻類的區(qū)分[17-18]。Evans 等人[19]研究發(fā)現(xiàn)，該基因可用于硅藻門下22 多個屬進(jìn)行再分類，說明其具有成為硅藻條形碼標(biāo)記的潛力。鄧建強(qiáng)等人[20]使用硅藻COX-Ⅰ基因中具有高效特異性的引物KEint2F 和KEintR 進(jìn)行PCR 檢測，發(fā)現(xiàn)該法比傳統(tǒng)消化鏡檢具有更高的硅藻檢出率，可用于法醫(yī)學(xué)溺死的診斷，但尚無法進(jìn)行落水地點(diǎn)的推斷。

2 基因檢測技術(shù)用于細(xì)菌檢驗

自然界水域中，還存在各種細(xì)菌。由于水中硅藻體積形狀差異較大，大小在2～200 μm，部分硅藻不易通過氣血屏障進(jìn)入血液循環(huán)，從而降低體內(nèi)硅藻的檢出率。水中細(xì)菌大小在0.2～2 μm，普遍比硅藻體積更小，因此被認(rèn)為有潛力成為溺死診斷的另一個理想標(biāo)記物[21]。

2.1 檢測低鹽濃度水域中細(xì)菌的相關(guān)基因

低鹽濃度水域一般為江河湖等淡水水域。由于淡水與海水中的環(huán)境不一樣，因此這兩類水域中生存的細(xì)菌種類會有所差別。通過檢測溺死者體內(nèi)不同類型的細(xì)菌，可用于溺死的診斷及溺死地點(diǎn)的推斷[22-23]。低鹽濃度水域中，目前研究的較多的為氣單胞菌屬相關(guān)基因，如氣溶素基因（aerA）、促旋酶B 亞單位基因（gyrB）、溶血素基因（hlyA）和16SrRNA基因等。

areA 基因長度約1400 bp，具有種屬特異性，基因序列同源性較高[24]。hlyA 基因長度約1900bp，普遍存在于臨床和環(huán)境中嗜水氣單胞菌中，且與areA 基因同源性僅有46.70%[25-26]。16SrRNA 基因約1500bp，是細(xì)菌分類及多樣性研究的重要分子標(biāo)記。gyrB 基因長度約2400 bp，廣泛存在于各種細(xì)菌中，含有可變區(qū)和保守區(qū)，特別適用于菌株的區(qū)別和鑒定。Aoyagi 等人[22]使用巢式PCR 對32 份心血樣本中氣單胞菌的進(jìn)行PCR 檢驗，27 個案件中均擴(kuò)增出氣單胞菌基因組中氣單胞菌溶血素基因，認(rèn)為擴(kuò)增該基因可用于溺死的診斷。Guy 等人[27]使用qPCR 法擴(kuò)增20例溺水者體內(nèi)氣單胞菌的aerA、gyrB 基因，結(jié)果顯示該方法可以用來推斷死者是否為淡水中溺死。朱曉琳[28]將氣單胞菌的hly A、aer A、16SrRNA 基因與硅藻的多個基因作為共同的研究對象，構(gòu)建了浮游生物相關(guān)基因座的復(fù)合擴(kuò)增檢測體系，認(rèn)為采用該方法相較于單一基因的檢測具有特異性強(qiáng)、耗時短、通量大和操作便捷等優(yōu)點(diǎn)，具有良好地應(yīng)用前景。麥柏盛等人[29]建立了嗜水氣單胞菌gyrB 和16SrRNA 基因PCR 毛細(xì)管電泳檢測方法，發(fā)現(xiàn)該方法檢測嗜水氣單胞菌gyrB 基因用于診斷淡水溺死靈敏度較高，可作為診斷的輔助性方法；聯(lián)用16SrRNA 基因可提高該菌的檢出率。

2.2 檢測高鹽濃度水域中細(xì)菌的相關(guān)基因

高鹽濃度水域一般為海水。高鹽濃度水域中與溺死有關(guān)的基因研究較少，曾報道過有用于溺死診斷的基因有弧菌屬的過氧化氫酶基因（katA）、跨膜轉(zhuǎn)錄調(diào)控蛋白基因（toxR）和溶血素基因（vhh）；還有桿菌屬的尿素酶基因（ureC）、超氧化物歧化酶基因（sodB）和熒光素酶A 基因（luxA）等。這些基因普遍存在所述菌屬中，片段長度在不同類型的弧菌或桿菌長度有所不同，但均具有一定的保守性，可用于相關(guān)菌屬的鑒定[30-35]。Uchiyama 等人[23]選取了上述基因用qPCR 技術(shù)進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)淡水水域中死者肺部均檢測出氣單胞菌，未檢出弧菌和桿菌；海水水域中死者肺部均檢測出弧菌和桿菌，其中45%死者肺部同時還檢測出氣單胞菌，推測可能是由于該微生物存在于從河流流向海水的水域中。不僅如此，整個實驗血液和內(nèi)臟器官檢測陽性率明顯高于常規(guī)硅藻檢驗，可進(jìn)行死亡地點(diǎn)的判斷。

2.3 檢測人體環(huán)境中細(xì)菌的相關(guān)基因

在浴池或浴缸內(nèi)的水由于是被處理過的，各種自然水域中常見的藻類和細(xì)菌均相對稀少，從而很難通過傳統(tǒng)微生物檢驗來診斷溺死。目前報道過可用來浴池或浴缸水域中溺死診斷的為果糖基轉(zhuǎn)移酶（FTF）基因。

FTF 主要是位于口腔中唾液鏈球菌、變異鏈球菌分泌，在溺水時會隨著溺液進(jìn)入體內(nèi)。這兩種菌屬的FTF 基因長度分別約為1400 bp、4000 bp，有兩個高度保守區(qū)，可用于鏈球菌的鑒定[36-37]。Suto M 等人[38]通過對唾液鏈球菌的果糖轉(zhuǎn)移酶（FTF）基因進(jìn)行PCR 擴(kuò)增發(fā)現(xiàn)在溺死者的血液與內(nèi)臟器官中均能檢測出陽性，而溺液中卻檢測不出，這為溺死在不含浮游生物的水中的案例提供了有用的參考。

除了可通過基因檢測技術(shù)檢測人體喉部、口腔唾液中的正常菌群外，還有人嘗試使用細(xì)菌培養(yǎng)的方式檢測存在人體中的致病菌，如細(xì)菌糞大腸菌、糞鏈球菌等是否能成為溺死診斷的標(biāo)志[39]，但相關(guān)的基因檢測研究還未見。

3 基因檢測技術(shù)用于人體基因的檢測

在溺水過程中，大多數(shù)溺水者的肺部會有溺液進(jìn)入從而引起窒息，這是典型溺死。有的被證實為溺死的案件在肺部未發(fā)現(xiàn)溺液，這是非典型溺死。無論哪種過程，人體都會受到損傷，在基因轉(zhuǎn)錄或表達(dá)水平上發(fā)生一定變化，檢測某些特有基因的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平，可為輔助診斷溺死提供新的視角。信使RNA（mRNA）是由DNA 的一條鏈作為模板轉(zhuǎn)錄而來的、攜帶遺傳信息的能指導(dǎo)蛋白質(zhì)合成的一類單鏈核糖核酸，長度一般比對應(yīng)的基因片段要短，檢測相應(yīng)mRNA 的數(shù)量變化，可推斷相關(guān)人體基因的表達(dá)變化。

趙兵等人[40]用qPCR 法檢測雄性Wistar 大鼠肺組織AQP-1、AQP-4 mRNA 的表達(dá)水平，發(fā)溺死組相關(guān)基因表達(dá)水平明顯高于拋尸入水組，認(rèn)為該基因表達(dá)水平的檢測可能對生前溺死與死后拋尸的鑒別有一定意義。王莉曉等[41]采集SD 大鼠的肺組織，并使用qPCR 檢測CCL2、CCL7 和CCR2 的mRNA 的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)淡水溺死組CCL2 和CCL7的mRNA 的表達(dá)水平顯著高于淡水應(yīng)激組，但與疾病對照組比較，無統(tǒng)計學(xué)差異，認(rèn)為該方法對溺死的診斷有一定的輔助作用。姜美玲等人[42]用qPCR 法檢測大鼠肺組織及右心室血清的IL-1α、IL-1β 和IL-13 的mRNA 的表達(dá)情況，發(fā)現(xiàn)與空白對照組及心肌梗死組比較，溺死組大鼠右心室血清中的IL-1β、IL-13 的 mRNA 表達(dá)顯著升高，說明細(xì)胞因子IL-1β 及IL-13 的mRNA 的表達(dá)與溺死密切相關(guān)。

特異性應(yīng)激基因或損傷修復(fù)的轉(zhuǎn)錄或表達(dá)水平的檢測，不僅可輔助診斷溺死，還可為非典型溺死與典型溺死的鑒別診斷提供依據(jù)。如尹長玉[43]使用qPCR 技術(shù)檢測溺死大鼠肺組織內(nèi)88 種應(yīng)激相關(guān)基因的差異表達(dá)，發(fā)現(xiàn)非典型溺死組與典型溺死組表達(dá)有顯著性差異的基因有13 種，這說明非典型溺死與典型溺死兩種死亡過程有不同的應(yīng)激反應(yīng)機(jī)制，其中以CCL2 為代表的CCL 家族基因和IL 家族基因是鑒別非典型溺死的有效生物標(biāo)志物。

4 總結(jié)

從相關(guān)研究的基因片段來看，以上基因片段基本都可輔助溺死的定性診斷，靈敏度普遍高于傳統(tǒng)的酸消化法。適用于溺死地點(diǎn)推斷的基因有藻類的16S rDNA（真核為18S rDNA）、硅藻的5.8S+ITS2 分子標(biāo)記和細(xì)菌的基因。其中16S rDNA（真核為18S rDNA）用于溺死推斷需要使用對不同核酸片段區(qū)別度更高的基因檢測技術(shù)，而硅藻的5.8S+ITS2 分子標(biāo)記僅用法醫(yī)工作者常用的PCR-CE 法即可；細(xì)菌的基因只能用來進(jìn)行大區(qū)域的溺死地點(diǎn)推斷，無法進(jìn)行某單一水域中更具體地點(diǎn)的推斷。rbcL、EG 和COX-Ⅰ能對硅藻進(jìn)行再分類，UPA 能對紅藻在種的平面上進(jìn)行再分類，有用來進(jìn)行溺死地點(diǎn)推斷的潛力。

從相關(guān)研究使用的檢測技術(shù)來看，一般的PCR 法、PCRCE 法、PCR-DHPLC 法、PCR-DGGE 法、qPCR 法和巢式PCR 技術(shù)等均可用于溺死的診斷。其中，一般的PCR 法成本最低，其次由于PCR-CE 設(shè)備在法醫(yī)裝備中的普及，PCRCE 法使用成本也比較低，是利于基層開展基因檢測技術(shù)用于溺死定性診斷的兩種方法。用于溺死地點(diǎn)推斷研究的檢測技術(shù)中，PCR-DHPLC 法、PCR-DGGE 法和qPCR 法表現(xiàn)得更加適用，推測是由于其分辨率或靈敏度更高的原因，可更好的將不同的目標(biāo)產(chǎn)物區(qū)別開來，利于多種種屬的鑒別。除此以外，由于細(xì)菌的核酸和RNA 一般為單鏈，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定、易降解，因此更合適使用靈敏度高的qPCR 法和巢式PCR 技術(shù)。

5 展望

目前，已有科研人員開發(fā)了相關(guān)浮游生物基因座的復(fù)合擴(kuò)增體系[44-45]，可同時擴(kuò)增水中多種有利于診斷溺死的微生物的基因，這無疑比單一檢測某種微生物的某類基因準(zhǔn)確性更高。還有研究人員將PCR 探針用于無創(chuàng)性的尸體檢驗中[46]，這也大大的擴(kuò)展了應(yīng)用范圍，對溺死診斷有著重要的實用價值?；驒z測技術(shù)現(xiàn)已進(jìn)入三代測序時代，進(jìn)一步使用該方法檢測各種標(biāo)記物輔助溺死的診斷相較于傳統(tǒng)的基因檢測方法在大規(guī)模檢測上無疑更加有優(yōu)勢。因此，增加基因檢測速度、提高基因檢測精度、擴(kuò)大基因檢測范圍是目前基因檢測技術(shù)用于溺死診斷的研究方向。