吳寶升,張崇志△,孫海洲*,桑 丹*,李勝利,張春華,金 鹿,斯登丹巴,谷 英
(1. 內(nèi)蒙古自治區(qū)農(nóng)牧業(yè)科學院 內(nèi)蒙古自治區(qū)草食動物營養(yǎng)科學重點實驗室 內(nèi)蒙古 呼和浩特 010031;2. 鄂爾多斯市農(nóng)牧業(yè)科學研究院,內(nèi)蒙古 鄂爾多斯 017000)
功能性氨基酸在動物機體具有合成蛋白質(zhì)及多種生物活性物質(zhì)的生理功能,尤其在母畜妊娠期階段扮演著重要的角色。功能性氨基酸家族主要包括精氨酸(Arg)、谷氨酰胺、谷氨酸、支鏈氨酸、色氨酸、甘氨酸、鳥氨酸、脯氨酸、瓜氨酸、組氨酸、甲硫氨酸和?;撬岬萚1-2]。N-氨甲酰谷氨酸(NCG)作為內(nèi)源Arg生成激活劑,具有內(nèi)源性Arg合成的限制酶激活劑和多種生物活性物質(zhì)的功能。NCG能夠通過參與二氫吡咯-5-羧酸合成酶和氨甲酰磷酸合成酶I的激活,促使谷氨酰胺合成瓜氨酸,進而促進內(nèi)源性精氨酸(Arg)的合成[3]。谷氨酰胺和Arg能夠通過AMPK、cGMP和mTOR等信號通路來調(diào)節(jié)底物氧化和蛋白質(zhì)合成[4],在妊娠前期母畜胚胎和胎盤的生長發(fā)育過程中具有重要作用[5]。
目前研究表明,動物繁殖期日糧中添加NCG不僅促進內(nèi)源Arg合成、調(diào)控動物生長發(fā)育及營養(yǎng)物質(zhì)的合理分配,也能有效降低胚胎損失、促進胎兒發(fā)育及提高母畜繁殖率[4,6-8]。Liu等[9]研究發(fā)現(xiàn),母豬妊娠早期補充0.4%NCG可以促進黃體形成,降低胚胎死亡率;妊娠后期日糧中補充0.08%的NCG相比對照組分別提高窩產(chǎn)活仔數(shù)11.75%和窩產(chǎn)活仔總重量13.23%,日糧中添加0.08%NCG和1%Arg都顯著提高血漿Arg濃度。Kwon等[10]研究發(fā)現(xiàn),在妊娠早-中期階段靜脈灌注Arg提高母羊子宮液和尿囊液中Arg和瓜氨酸含量,改善胚胎存活率。Lassal等[11]研究多胎母羊灌注Arg試驗發(fā)現(xiàn),出生羔羊死亡率降低23%,羔羊存活率增加59%,四胞胎出生體重提高23%。
目前,國內(nèi)外關于NCG對母羊妊娠前期營養(yǎng)調(diào)控方面的研究鮮有報道。因此,本試驗在日糧中添加不同劑量的NCG,研究NCG對妊娠前期鄂爾多斯細毛羊血液、尿囊液和羊水中氨基酸濃度的影響,為鄂爾多斯細毛羊妊娠期繁殖性能的提高提供科學依據(jù)。
選擇體況良好,2~3周歲,平均體重為(50.62±0.52)kg的受孕鄂爾多斯細毛羊母羊40只隨機分為3組,各組試驗母羊體重經(jīng)F檢驗差異均不顯著(P>0.05)。
本試驗于鄂爾多斯細毛羊妊娠期開始至妊娠期第90 d結束,整個試驗期90 d。
試驗母羊基礎日糧配制參考NRC(2007):按照母羊妊娠前期飼養(yǎng)標準設計配方,日糧的營養(yǎng)組成及營養(yǎng)水平見表1。
表1 日糧組成及營養(yǎng)水平(風干基礎)Table 1 Composition and nutrient levels of diets(air-dry basis)
飼喂NRC(2007)推薦的基礎日糧(滿足妊娠雙胎母羊需要量為26.2 g/kg體重),再與不同濃度NCG進行混勻,每只母羊單獨套袋飼喂,準確記錄供給飼喂量和剩料量。40只試驗母羊隨機分為3組,NCG1組飼喂基礎日糧+0.30 g NCG/d(n=13),NCG2組飼喂基礎日糧+0.40 g NCG/d(n=13),對照組飼喂基礎日糧(n=14)。每日上午8:00和下午17:00飼喂兩次,自由飲水。NCG添加劑量參考本團隊前期的試驗結果。每天清掃羊圈、清除糞便、清洗飲水池,確保周圍環(huán)境的清潔。
妊娠期第0 d、45 d和90 d,對試驗母羊進行稱重,根據(jù)體重變化及時調(diào)整母羊的日糧供給量。妊娠期第45 d和90 d,分別每組3只母羊進行屠宰,立即取出子宮、剝離尿囊絨膜和羊膜,用50 mL注射器抽取尿囊液和羊水并測量體積,記錄胎兒體重。妊娠期第45 d和90 d每組6只試驗母羊頸靜脈采血、妊娠期90 d胎兒心臟采血,使用含肝素鈉的離心管分別收集母羊和胎兒血液10 mL,3 500 rpm離心15 min,取上清液并-20 ℃冷凍保存待測。
采用高效液相色譜法測定氨基酸濃度,由北京普瑞華盛生物科技有限公司通過高效液相色譜-四級桿離子阱串聯(lián)質(zhì)譜儀(HPLC-MS/MS API3200 Q-TRAP)檢測血漿游離氨基酸濃度。
所有數(shù)據(jù)采用SAS9.0一般線性模型統(tǒng)計分析,Duncan法進行多重比較,結果以平均值±SEM表示。
由表2可知,妊娠期第0 d和45 d,對照組、NCG1組和NCG2組母羊體重沒有顯著差異(P>0.05);妊娠期第90 d,NCG2組母羊體重最高,達到61 kg,但與對照組和NCG1組母羊體重差異不顯著(P>0.05)。妊娠期第45 d,對照組、NCG1組和NCG2組胎兒體重沒有顯著差異(P>0.05);妊娠期第90 d,NCG1組胎兒體重最高,達到537.50 g,但與對照組和NCG2組胎兒體重差異不顯著(P>0.05)。妊娠期第45 d和90 d,對照組、NCG1組和NCG2組母羊尿囊液和羊水含量均呈現(xiàn)逐漸遞增的趨勢,但其差異均不顯著(P>0.05)。
表2 妊娠前期母羊體重、胎兒體重、尿囊液量及羊水量變化情況 Table 2 Changes of maternal body weight, fetal weight, allantoic fluid and amniotic fluid in pre-pregnancy
由表3可知,妊娠期第45天,NCG2組母羊血漿中瓜氨酸和鳥氨酸濃度顯著高于NCG1組(P<0.05)、極顯著高于對照組(P<0.01);對照組、
表3 妊娠期第45天和90天母羊血漿中氨基酸濃度的變化Table 3 Changes of amino acids concentrations in maternal plasma at 45 and 90 days of pregnancy μmol/L
NCG1組和NCG2組母羊血漿中脯氨酸、天冬酰胺、色氨酸、β-丙氨酸和亮氨酸濃度表現(xiàn)逐漸降低的趨勢,但差異不顯著(P>0.05),纈氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸、Arg和牛黃氨酸濃度表現(xiàn)逐漸升高的趨勢,但差異不顯著(P>0.05)。妊娠期第90天,對照組母羊血漿中甘氨酸和甲硫氨酸濃度顯著高于NCG1組(P<0.05),NCG2組絲氨酸和Arg濃度顯著高于對照組(P<0.05),NCG1組和NCG2組谷氨酸濃度顯著高于對照組(P<0.05);對照組、NCG1組和NCG2組母羊血漿中丙氨酸和天冬酰胺濃度表現(xiàn)逐漸降低的趨勢,但差異不顯著(P>0.05),半胱氨酸和β-丙氨酸濃度表現(xiàn)逐漸升高的趨勢,但差異不顯著(P>0.05)。
由表4可知,妊娠期第45 d,NCG1組和NCG2組母羊尿囊液中谷氨酰胺濃度顯著高于對照組(P<0.05),對照組、NCG1組和NCG2組母羊尿囊液中甘氨酸、丙氨酸、牛黃氨酸和β-丙氨酸濃度表現(xiàn)逐漸降低的趨勢,但差異不顯著(P>0.05),天冬酰胺、谷氨酸、色氨酸、賴氨酸、瓜氨酸、鳥氨酸和亮氨酸濃度表現(xiàn)逐漸升高的趨勢,但差異不顯著(P>0.05)。妊娠期第90 d,對照組母羊尿囊液中甲硫氨酸濃度顯著高于NCG2組(P<0.05),對照組組氨酸濃度顯著高于NCG1組和NCG2組(P<0.05),NCG2組和NCG1組Arg濃度顯著高于對照組(P<0.05),NCG1組鳥氨酸濃度顯著高于NCG2組(P<0.05)和對照組(P<0.01),NCG1組蘇氨酸和半胱氨酸濃度顯著高于對照組(P<0.05);對照組、NCG1組和NCG2組母羊尿囊液中甘氨酸、絲氨酸、色氨酸和賴氨酸濃度表現(xiàn)逐漸降低的趨勢,但差異不顯著(P>0.05),異亮氨酸、天冬氨酸、瓜氨酸和β-丙氨酸濃度表現(xiàn)逐漸升高的趨勢,但差異不顯著(P>0.05)。
表4 妊娠期第45和90天母羊尿囊液中氨基酸濃度的變化Table 4 Changes of amino acids concentrations in maternal allantoic fluid at 45 and 90 days of pregnancy μmol/L
由表5可知,妊娠期第45 d,對照組母羊羊水中絲氨酸濃度顯著高于NCG1組(P<0.05);對照組、NCG1組和NCG2組母羊羊水中脯氨酸、蘇氨酸、天冬氨酸、谷氨酸、甲硫氨酸、Arg、色氨酸、賴氨酸、鳥氨酸和β-丙氨酸濃度表現(xiàn)逐漸升高的趨勢,但差異不顯著(P>0.05)。妊娠期第90 d,NCG2組母羊羊水中谷氨酰胺、Arg和瓜氨酸濃度顯著高于對照組(P<0.05),對照組牛黃氨酸濃度顯著高于NCG1組(P<0.05),NCG2組和NCG1組鳥氨酸濃度顯著高于對照組(P<0.05);對照組、NCG1組和NCG2組母羊羊水中半胱氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、組氨酸和本丙氨酸濃度表現(xiàn)逐漸降低的趨勢,但差異不顯著(P>0.05),脯氨酸和纈氨酸濃度表現(xiàn)逐漸升高的趨勢,但差異不顯著(P>0.05)。
表5 妊娠期第45和90天母羊羊水中氨基酸濃度的變化Table 5 Changes of amino acids concentrations in maternal amniotic fluid at 45 and 90 days of pregnancy μmol/L
由表6可知,妊娠期第90 d,對照組胎兒血漿中甘氨酸和甲硫氨酸濃度極顯著高于NCG1組和NCG2組(P<0.01),NCG2組和NCG1組蘇氨酸和鳥氨酸濃度極顯著高于對照組(P<0.01),對照組半胱氨酸和色氨酸濃度顯著高于NCG1組(P<0.05),NCG1組丙氨酸濃度顯著高于對照組(P<0.05),NCG2組和NCG1組Arg濃度顯著高于對照組(P<0.05),NCG2組瓜氨酸濃度顯著高于對照組(P<0.05),對照組牛黃氨酸濃度顯著高于NCG2組(P<0.05)、極顯著高于NCG1組(P<0.01)。
表6 妊娠期第90天胎兒血漿中氨基酸濃度的變化Table 6 Changes of amino acids concentrations in fetal plasma at 90 days of pregnancy μmol/L
母體子宮內(nèi)胎兒的生長發(fā)育是一個復雜的生物學過程,其過程中受到營養(yǎng)、遺傳、生理、母體成熟和環(huán)境等綜合因素影響的作用[12-13]。母體的自然分娩和新生兒的正常生存需要有一個“最佳”的母體配種體重和胎兒初生體重[14]。胎兒初生體重在“最佳”范圍之外出現(xiàn)偏差或者波動都有可能對胎兒生長發(fā)育有明顯的影響,使胎兒的體尺和組織器官生長發(fā)育出現(xiàn)異常變化,可能對后代的生理和代謝造成永久性的改變,甚至影響新生兒的生存能力,同時改變后代的健康[15-17]。研究發(fā)現(xiàn),日糧中添加NCG對母畜妊娠期的胚胎、胎盤和胎兒生長發(fā)育過程中具有重要作用[18-19]。劉俊鋒等[20]研究發(fā)現(xiàn),妊娠早期胎兒的體重與尿囊液及和羊水量以及生化參數(shù)緊密相關,尿囊液與羊水量及化學成分的變化可以反映胎兒-母體間營養(yǎng)素轉運和胎兒生長發(fā)育的狀況[21]。母畜體內(nèi)尿囊液和羊水中的生化成分是胎兒生命活動的物質(zhì)基礎,其含量或活性的變化可反映胎兒組織細胞通透性與機體新陳代謝狀況[22]。羊水中的氨基酸(AA)主要源于妊娠前期母體胎盤和胎兒之間的物質(zhì)循環(huán),尿囊液中的AA主要來自于母體和胎兒的分泌物[23]。胎兒能過通過吞咽羊水獲得自身生長發(fā)育所需要的AA和其他生物分子[24],這些物質(zhì)部分來自于胎盤,因此羊膜腔內(nèi)的羊水量及成分受到胎兒和胎盤等因素的影響。在本試驗中,妊娠前期(0~90 d)日糧添加不同劑量的NCG對鄂爾多斯細毛羊母羊體重和胎兒體重沒有顯著的影響(P>0.05),而日糧添加不同劑量的NCG在妊娠期45 d和90 d都有增加尿囊液和羊水含量的趨勢(P>0.05), 這可能由于日糧中NCG的添加改變了尿囊液和羊水中的物質(zhì)代謝反應[20],尿囊液和羊水量的增加可能對鄂爾多斯細毛羊胎兒-母體間營養(yǎng)素轉運及胎兒的生長發(fā)育起到重要作用。
氨基酸在動物妊娠過程中對于胎盤和胎兒的發(fā)育具有重要的代謝作用,由AA合成的蛋白質(zhì)是胎兒組織器官的主要組成部分,母體血液AA能夠通過胎盤運輸?shù)教后w內(nèi)以供給胎兒生長發(fā)育[25],因此妊娠期母體蛋白質(zhì)的補充是改善胎兒生長發(fā)育的有效措施[19]。Arg作為人體和動物組織中蛋白質(zhì)最豐富的載體之一,是機體內(nèi)合成蛋白質(zhì)、一氧化氮(NO)、尿素、多胺、鳥氨酸、瓜氨酸、谷氨酰胺和肌丁胺等多種物質(zhì)的直接或間接前體物質(zhì)[26]。Arg也可以通過其代謝物調(diào)控下丘腦、腎上腺和胰腺中激素的分泌、胎盤的營養(yǎng)運輸及組織中蛋白質(zhì)的合成等。NCG作為Arg的合成限速酶有效激活劑,可以增強內(nèi)源性Arg的合成。研究發(fā)現(xiàn),母體補充Arg會增加子宮-胎盤血流量,有效促進胎兒生長發(fā)育[15,27]。Arg是哺乳動物妊娠期必需的功能性氨基酸,也是合成動物機體內(nèi)多種生物活性分子的前體物質(zhì)[4,28],在妊娠期母羊日糧中添加功能性氨基酸對胎兒和胎盤生長發(fā)育過程中至關重要。Thureen等[29]研究發(fā)現(xiàn),母體血漿Arg濃度通過子宮-胎盤樞紐功能的臍帶和血管轉運至胎兒體內(nèi),提高胎兒體內(nèi)的Arg濃度,促進胎兒器官和組織的生長發(fā)育。NO是血管舒張和信號分子,多胺是DNA和蛋白合成的關鍵調(diào)控者,作為NO和多胺合成的前體物,Arg能夠能夠調(diào)控胎盤的營養(yǎng)運輸,參與組織中蛋白質(zhì)合成等多種生理過程,對胎盤和胎兒的發(fā)育具有重要調(diào)節(jié)作用[16,19,30]。
本試驗結果發(fā)現(xiàn),妊娠前期(0~90 d)日糧添加不同劑量的NCG顯著增加母羊血漿、尿囊液、羊水及胎兒血漿中Arg、瓜氨酸和鳥氨酸的濃度(P<0.05),母羊血漿和胎兒血漿中谷氨酸的濃度隨著NCG劑量的增加而增加,母羊尿囊液和羊水中谷氨酰胺的濃度顯著增加(P<0.05)。日糧中添加NCG不僅能夠提高母羊血漿中Arg家族的濃度,還能增加尿囊液、羊水和胎兒血液中Arg家族的濃度,提高機體內(nèi)源性Arg濃度,促進機體合成肌酸、多胺、NO和激素等重要的生物活性物質(zhì)[31]。這些生物活性物質(zhì)能夠提高母羊卵子質(zhì)量和排卵數(shù)、受精卵的定植和胚胎在子宮內(nèi)附植,促進胎盤生成及孕體的生長發(fā)育。有研究發(fā)現(xiàn),Arg使母畜血漿、羊水和尿囊液中精氨酸的濃度顯著提高,這與本試驗研究結果相一致[20]。尿囊液和羊水中Arg濃度的增加與妊娠前期胎盤合成最大量的NO和多胺有關,此時胎盤正在快速生長,Arg在母畜體內(nèi)經(jīng)NOS分解代謝為NO后,子宮對Arg以及NO進行充分吸收和合成,以滿足胚胎生長發(fā)育的需要[13,32-33]。日糧中添加NCG通過提高母羊自身和胎兒體內(nèi)Arg、瓜氨酸和鳥氨酸濃度,進而提高胰島素、生長激素、胰島素樣-1、甲狀腺素等的分泌,胰島素和生長激素能夠調(diào)節(jié)肌肉、脂肪和肝臟組織中的糖酵解、TCA循環(huán)、脂肪酸氧化以及糖異生和氨基酸代謝途徑的相互轉換和合成[4,15]。在若干個代謝通路的協(xié)同作用下,妊娠期第10~15天母羊子宮腔內(nèi)Arg濃度將增加8倍[34-36],子宮腔內(nèi)的Arg會增加生物活性分子NO和多胺含量,能夠誘導母羊孕體滋養(yǎng)外胚層中的IFNT使胚胎從球形狀改變?yōu)榻z狀結構。體內(nèi)的Arg在Arg脫羧酶(ADC)作用下分解為胍丁胺,胍丁胺在胍丁胺酶(AGAMAT)的作用下形成腐胺,胍丁胺和腐胺是直接影響子宮和孕體發(fā)育的關鍵活性物質(zhì)。在Arg代謝途徑中,ODC1作為限制性酶抑制Arg的轉變多胺途徑,SLC7A1是孕體滋養(yǎng)外胚層最主要的轉運Arg的載體,NOS3是母羊孕體滋養(yǎng)外胚層合成NO和瓜氨酸的關鍵NOS異構酶[37]。鳥氨酸是Arg在Arg酶的作用下的代謝產(chǎn)物,作為尿素循環(huán)的一部分與尿素形成有關。增加的Arg濃度促進鳥氨酸濃度升高,在鳥氨酸脫羧酶作用下形成多胺,從而進入尿素循環(huán)促進氨解毒作用。妊娠前期日糧添加不同劑量的NCG顯著增加母羊尿囊液和胎兒血漿中蘇氨酸的濃度(P<0.05),母羊血漿和羊水中蘇氨酸的濃度也不同程度表現(xiàn)出增加的趨勢(P>0.05)。蘇氨酸屬于生糖氨基酸家族的成員,可以代謝轉變成丙酮酸、a-酮戊二酸和草酰乙酸,通過羧酸變成葡萄糖和糖原。這些AA濃度的增加能夠促進新生羔羊糖代謝,從而提高抵抗饑餓和寒冷等外界環(huán)境的能力,有效維持體溫和提高生存能力。
本試驗條件下,妊娠前期日糧中添加NCG有效提高母羊血漿、尿囊液、羊水和胎兒血漿中Arg家族氨基酸的濃度,對保障胎兒早期程序化的健康生長發(fā)揮重要作用。