清化飲對慢性胃炎脾胃濕熱證模型大鼠miR155/SOCS1介導(dǎo)的炎癥通路的作用機制研究

王薇 徐叢榮 任彥 王施瑋 廖春麗 付肖巖 胡海霞

摘要：目的基于miR-155/SOCS1炎癥通路研究清化飲對慢性胃炎脾胃濕熱證治療作用的機制研究。方法將60只Wistar大鼠隨機分為對照組、脾胃濕熱模型組、清化飲組，采用濕熱環(huán)境+高脂高糖飲食+白酒的造模方法建立脾胃濕熱證慢性胃炎大鼠模型，清化飲連續(xù)灌胃給藥20 d。治療結(jié)束后處死大鼠，腹主動脈取血并留取胃組織，HE染色觀察胃組織病理改變情況，應(yīng)用ELISA檢測血清TNF-α、IL-6的含量，應(yīng)用RT-PCR法檢測miR-155及其靶基因SOCS1的表達(dá)水平，應(yīng)用免疫組化實驗檢測轉(zhuǎn)錄因子NFκB p65及SOCS1的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果與對照組比較，脾胃濕熱模型組大鼠胃組織炎癥細(xì)胞浸潤增多，且miR-155的表達(dá)量明顯上調(diào)，其靶基因SOCS1顯著下調(diào)，導(dǎo)致炎癥通路關(guān)鍵的轉(zhuǎn)錄因子NFκB p65核內(nèi)表達(dá)水平及血清TNF-α、IL-6的生成顯著上升。而與模型組比較，清化飲可降低胃組織炎癥細(xì)胞的浸潤和miR-155的表達(dá)水平，并且使NFκB p65的核內(nèi)表達(dá)水平降低，同時上調(diào)SOCS1表達(dá)，進而降低TNF-α、IL-6的分泌水平。結(jié)論清化飲可通過miR-155/SOCS1通路抑制NFκB活化及過度炎癥反應(yīng)保護胃組織，為臨床治療慢性胃炎脾胃濕熱證提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

關(guān)鍵詞：清化飲;慢性胃炎;脾胃濕熱模型;miR-155;炎癥通路.

The study of regulation of Qinghuayin on the rat model of spleen stomach damp heat syndrome of chronic gastritis via miR-155/SOCS1 mediated inflammatory pathway

Wang Wei1，Xu Congrong1，Ren Yan1，Wang Shiwei1，F(xiàn)u Xiaoyan1，Liao Chunli1，Hu Haixia2，3

1 The Second Affiliated Hospital of Fujian University of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian，350003，China

2 Academy of Integrative Medicine，F(xiàn)ujian University of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350122，China

3 Fujian Key Laboratory of Integrative Medicine on Geriatrics，F(xiàn)ujian University of Traditional Chinese Medicine，F(xiàn)uzhou，F(xiàn)ujian 350122，China

Abstract：Objective To study the therapeutic mechanism of Qinghuayin on spleen and stomach dampness-heat syndrome of chronic gastritis via miR-155/SOCS1 mediated inflammatory pathway.Methods 60 Wistar rats were randomly divided into control group，spleen stomach damp heat model group and Qinghuayin group.The wet heat environment plus a high-fat and high-sugar diet was used to establish a rat model of dampness-heat syndrome of the spleen and stomach，and Qinghuayin was continuously intragastric administered for 20 days.After treatment，the rats were executed and then the blood of abdominal aorta was taken and the gastric tissue was retained for analysis.HE staining was used to observe the pathological changes of gastric tissue，the serum TNF-αand IL-6 was detected by ELISA.The expression level of miR-155 and its target gene SOCS1 was detected by RT-PCR，the protein expression levels of NFκB p65 and SOCS1were detected by immunohistochemistry.Results Compared with the control group，the infiltration of inflammatory cells were increased significantly in gastric tissue of rats with dampness-heat syndrome of the spleen and stomach model group，the expression of miR-155 was significantly up-regulated，and its target gene SOCS1 was significantly down regulated，resulting in the increased expression level of transcription factor NFκB p65 in nucleus and SOCS1，and the production of TNF-αand IL-6 increased significantly in rat serum.However，Qinghuayin can reduce the infiltration of inflammatory cells and the expression level of miR-155 in gastric tissue，and reduce the nuclear expression level of NFκB p65 decreased，up-regulated the expression of SOCS1，thereby reducing the secretion level TNF-αand IL-6 comparing with model group.Conclusion Qinghuayin can inhibit NFκB activation through miR-155/SOCS1 pathway and excessive inflammatory reaction，protecting gastric tissue from damage and providing basic theoretical basis for clinical treatment of spleen and stomach dampness-heat syndrome of chronic gastritis.

Key words：Qinghuayin;Chronic gastritis;spleen and stomach dampness-heat syndrome;miR-155;Inflammatory pathway

【中圖分類號】R573 ?【文獻(xiàn)標(biāo)識碼】A ?【文章編號】1673-9026（2021）14--03

慢性胃炎病癥表現(xiàn)為納差、嘈雜、燒心等癥狀，在中醫(yī)劃歸為“胃脘痛”“痞滿”等疾病范疇，其臨床治療目前無特效藥物，長期使用西醫(yī)治療會造成耐藥，治療效果不佳且易復(fù)發(fā)。慢性胃炎發(fā)病多會累及脾，脾胃濕熱是其最為常見的證型[1，2]。脾胃濕熱證的脾胃組織存在大量炎癥浸潤，其發(fā)病機制與炎癥病變密切相關(guān)。局部的過度炎癥反應(yīng)將導(dǎo)致脾胃組織的損傷遷延難愈，因此針對炎癥反應(yīng)的治療將有效地改善慢性胃炎的臨床癥狀[3]。目前已證實非編碼單鏈小RNA miR-155（microRNA-155）是調(diào)控免疫炎癥反應(yīng)的關(guān)鍵小RNA之一，主要通過調(diào)控其下游基因SOCS1（suppressors of cytokine signaling）抑制炎癥反應(yīng)的進展[4]，因此miR-155/SOCS1是是調(diào)控炎癥反應(yīng)的一個關(guān)鍵炎癥通路。清化飲是我國楊春波國醫(yī)大師治療慢性胃炎脾胃濕熱證的經(jīng)驗方，具有健脾清熱的效果。前期研究已證實清化飲對慢性胃炎炎癥反應(yīng)具有確切的臨床療效[5]，因此，本研究將從信號通路miR-155/SOCS1水平進一步揭示清化飲治療慢性胃炎脾胃濕熱證的分子作用機制，將有助于疾病的早期診斷和治療。

1實驗材料

1.1實驗動物選取6-8周齡，SPF清潔級Wistar大鼠60只，體重為220-250 g[上海斯萊克實驗動物有限責(zé)任公司，許可證號SYXK（閩）2019～0007]。

1.2主要試劑清化飲（閩藥制字Z05104030）購于福建中醫(yī)藥大學(xué)附屬第二人民醫(yī)院;IL-6 ELISA檢測試劑盒（批號：F15870）、TNF-αELISA檢測試劑盒（批號：F16960）購自上海西唐生物科技有限公司;RT-PCR試劑盒（批號：DRR036A）購自大連TaKaRa公司;RIPA裂解液（批號：P0013B）、BCA蛋白濃度測定試劑盒（批號：P0010S）、超敏ECL化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（批號：P0018FM）均購自碧云天生物技術(shù)有限公司，SOCS1（批號：3950）、NFκB p65（批號：6956）、羊抗兔HRP IgG（批號：91196）購自美國Cell Signaling Technology公司。

1.3主要儀器

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（型號：RE-520A，上海亞榮生化儀器廠）;奧林巴斯顯微鏡（型號：BX51T-PHD-J11，日本奧林巴斯公司），酶標(biāo)儀（型號：ELX808，美國BioTek公司），熒光定量PCR儀（型號：7500，美國ABI公司），凝膠成像分析系統(tǒng)（型號：ChemiDoc XRS+，美國BioRad公司）。

2實驗方法

2.1藥物制備

清化飲的藥物組成：茵陳9 g、薏苡仁20 g、厚樸6 g、生扁豆12 g、黃連3 g。將藥物先泡30 min，加蒸餾水量約為藥量的8倍，煎煮3次，煎煮中用冷凝管收集蒸汽中揮發(fā)性的藥物成分，將3次藥汁混合，離心取澄清藥汁，配制成1.0 g/ml濃度藥液，4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2造模與干預(yù)治療

大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1 w后，隨機分成3組，分別為對照組，脾胃濕熱模型組，清化飲治療組，每組20只。采用濕熱環(huán)境+高脂高糖飲食+白酒的造模方法建立脾胃濕熱證慢性胃炎大鼠模型：飼以高脂高糖飲食（高糖高脂飼料普通飼料中混入12%豬油、8%蜂蜜加工而成），并與油脂隔日交替灌服白酒2 ml/200 g大鼠，共10 d，然后放入人工氣候箱中，溫度為32±2℃，相對濕度為95%，共5 d。對照組普通飼料喂養(yǎng)，清化飲治療組于造模后給予清化飲灌胃治療21 d，1次/d。給藥期間自由進食、飲水。每天觀察其一般情況，記錄精神狀態(tài)、進食、活動和大便情況。

2.3標(biāo)本采集

取材前禁食24 h。腹主動脈采血5 mL，靜置后以3000 r/min離心15 min，取上層血清置于EP管中，于-80℃冰箱中保存待測。脫頸處死后取胃組織，置于液氮中冷凍保存?zhèn)溆谩?/p>

2.4胃黏膜組織病理學(xué)觀察

制備組織石蠟切片，將制備好的石蠟切片用梯度酒精依次進行脫蠟處理后，蘇木素染色5～10 min，流水沖洗觀察效果，可進行復(fù)染。伊紅染色約30 s，流水沖洗，也可復(fù)染，即可于普通光鏡下進行觀察拍照。

2.5炎癥因子檢測

取離心后的血清，按照ELISA試劑盒說明書檢測血清中的炎癥因子，并依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算IL-6、TNF-α的含量。

2.6 RT-PCR法檢測miR-155 mRNA、SOCS1 mRNA的表達(dá)水平

將胃組織用剪刀剪碎并將其置于裝有液氮的離心管中，先加入200μl Trizol，用高溫滅菌的玻璃研磨棒磨至細(xì)膩，然后再加入800μl Trizol，用槍頭吹打溶解后提取組織總mRNA并計算其濃度。先進行cDNA逆轉(zhuǎn)錄后，再行實時熒光定量PCR。引物序列為：miR-155：F，5’-TATCAACACCACCTGCGACC-3’;R，5’-ACTCGGTCAGAAAGCCAGTG-3’;SOCS-1：F，5’-GGAGTCTGTGCTCTG GGATT-3’，R，5’-TGAG GGAGTGAAGGAGCAAC-3’。反應(yīng)體系為：95℃10 min，95℃15 s，58℃60 s擴增35個循環(huán)，采用2-△△Ct法計算各基因的相對表達(dá)量。

2.7免疫組織化學(xué)法觀察胃組織SOCS1、NFκB p65的表達(dá)水平

取胃組織，制備蠟塊，并包埋切片備用。將切片放入0.01 M檸檬酸鹽緩沖液（PH 6.0）中，在微波爐內(nèi)微波輻射10 min，待修復(fù)液降至室溫后，PBS（0.1 M）洗3次。切片上滴加正常山羊血清封閉液，室溫孵育20 min。在切片上滴加炎癥相關(guān)蛋白（SOCS1、NFκB p65）一抗，4℃過夜孵育，PBS（0.1 M）洗3次。在切片上滴加生物素化第二抗體（IgG），37℃孵育20 min，PBS（0.1 M）洗3次。在切片上滴加辣根酶標(biāo)記鏈霉卵白素工作液（S-A/HRP），37℃孵育20 min，PBS（0.1 M）洗3次。使用DAB顯色試劑盒進行顯色，顯微鏡取五個不同視野進行觀察并拍照后，計算單位面積內(nèi)的陽性細(xì)胞數(shù)。Image J軟件分析實驗結(jié)果。

2.8統(tǒng)計學(xué)方法

數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，組間比較采用單因素方差分析，運用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

3結(jié)果

3.1動物一般狀況

空白對照組小鼠精神狀態(tài)良好，皮毛有光澤，反應(yīng)靈敏，活動自如，大便正常。脾胃濕熱模型組小鼠出現(xiàn)嗜睡懶動，反應(yīng)遲鈍，皮毛無光澤，大便溏膩等表現(xiàn)。清化飲灌胃治療后，上述癥狀逐漸改善。

3.2大鼠胃黏膜組織病理改變情況

與對照組相比，脾胃濕熱證模型組腺體腫大排列不齊，且出現(xiàn)明顯的炎癥細(xì)胞浸潤，清化飲組與模型組相比較，胃部腺體排列變齊，炎癥細(xì)胞浸潤等病理改變有所緩解。見圖1。

注：CTR：對照組;Model：脾胃濕熱模型組;QHY：清化飲組。

圖1大鼠胃粘膜組織HE染色情況（200×）

3.3清化飲對脾胃溫?zé)岚Y模型大鼠外周血清中炎癥因子含量的影響

與對照組比較，脾胃濕熱模型組外周血中的IL-6、TNF-α釋放量顯著升高，提示脾胃濕熱證大鼠體內(nèi)炎癥因子含量升高;與脾胃濕熱模型組比較，清化飲可顯著降低IL-6、TNF-α釋放量，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（見表1）。結(jié)果表明，清化飲能顯著降低炎癥因子的含量，減輕胃部炎癥反應(yīng)。

3.4清化飲對脾胃溫?zé)岚Y模型大鼠中miR-155及其靶基因表達(dá)水平的影響

結(jié)果表明，清化飲能夠抑制脾胃濕熱模型中miR-155的表達(dá)，同時促進其靶基因SOCS1的表達(dá)升高，進而抑制下游炎癥因子表達(dá)及胃部炎癥所致的組織損傷，見圖2。

注：CTR：對照組;Model：脾胃濕熱模型組;QHY：清化飲組。與對照組比較，*P<0.05;與脾胃濕熱模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

3.5清化飲對脾胃溫?zé)岚Y模型大鼠中炎癥通路蛋白表達(dá)水平的影響

SOCS1及NFκB p65是炎癥通路中抑制炎癥因子表達(dá)的關(guān)鍵蛋白。如圖3，清化飲能夠升高SOCS1的蛋白表達(dá)水平，同時使胞核內(nèi)NFκB p65的蛋白表達(dá)下調(diào)，提示清化飲同時能抑制p65核移位，這可能是緩解胃組織炎癥損傷的原因之一。

注：CTR：對照組;Model：脾胃濕熱模型組;QHY：清化飲組。與對照組比較，*P<0.05;與脾胃濕熱模型組比較，#P<0.05，##P<0.01。

4討論

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為脾胃是人體后天之本，人體受到濕熱侵犯后，中焦脾胃是病變部位。脾胃濕熱證是常見的臨床實性證候，多因濕邪入侵、長時間飲食不合理、情緒失調(diào)、脾胃稟賦不足而損傷脾胃，出現(xiàn)脾氣下降，胃氣上升相關(guān)癥狀，在福建等氣候潮濕、高溫多雨的地區(qū)容易發(fā)生[6]。脾胃濕熱證在臨床治療時要遵循和胃、醒脾、化濕清熱原則。脾胃濕熱證的臨床表現(xiàn)主要是消化系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)，但過度的炎癥反應(yīng)會導(dǎo)致大量炎癥細(xì)胞浸潤胃組織并釋放炎癥因子，產(chǎn)生嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致胃黏膜的結(jié)構(gòu)和功能損傷[7]。

新近研究提示，MicroRNAs是調(diào)控炎癥反應(yīng)中發(fā)揮著關(guān)鍵作用，它是長度為20-24nt單鏈小分子RNA，人類基因中約30-90%受microRNAs調(diào)控。其中，miR-155調(diào)控著炎癥反應(yīng)中炎癥相關(guān)基因的表達(dá)，是一個NF-B p65依賴性miRNA，且基因敲除miR-155后，則NF-B p65將不會發(fā)生核移位[8]，可見miR-155在炎癥通路中的關(guān)鍵調(diào)控作用。炎癥反應(yīng)發(fā)生時，miR-155表達(dá)顯著上調(diào)，可靶向抑制SOCS-1，從而使一系列促炎因子如TNF-α，IL-6等生成增多，從而造成組織損傷[9]。

清化飲是我國楊春波國醫(yī)大師治療脾胃濕熱證的經(jīng)驗方，經(jīng)多年臨床證實，清化飲治療慢性胃炎脾胃濕熱證具有良好的療效。清化飲由茵陳、生扁豆、黃連、厚樸、薏苡仁、赤芍等組成，方中茵陳性苦微寒，以其善能清熱利濕，又因其長于三月獨得春升之氣，故入肝經(jīng)兼能上行，為君藥;生扁豆味甘性微溫，能醒脾化濕;輔以苦寒之黃連清熱燥濕;配以辛溫之厚樸，化濕理氣除滿;薏苡仁利水滲濕而健脾;佐以赤芍以清熱涼血，散瘀止痛。全方藥性平和，藥味精，藥量輕，寒溫并用，共奏清熱化濕、理氣活血之功。中焦脾胃為樞機之地，濕熱之邪阻滯中焦，則中焦氣機不通，治法當(dāng)恢復(fù)脾胃生理功能[10]。

既往研究證實，清化飲能提高機體抗氧化的能力并調(diào)整免疫功能，改善胃腸功能[11，12]。本研究結(jié)果表明，與對照組相比，脾胃濕熱模型組的miR-155表達(dá)量增高，其抑制其靶基因SOCS1的表達(dá)，促使下游炎癥因子TNF-α、IL-6含量升高，提示脾胃濕熱證能激活過度的免疫炎癥反應(yīng)，炎癥加劇還將進一步促使氧化應(yīng)激發(fā)生，從而形成正反饋式的損傷作用，不斷地加重胃組織損傷。脾胃濕熱模型大鼠經(jīng)清化飲治療后，miR-155的表達(dá)水平顯著降低，且其靶基因SOCS1表達(dá)水平明顯增高，同時炎癥通路轉(zhuǎn)錄因子NFκB p65的胞核內(nèi)表達(dá)水平顯著降低，通路下游炎癥因子TNF-α、IL-6分泌量顯著下降，提示清化飲可能通過調(diào)控miR-155/SOCS1信號通路從而抑制炎癥通路的激活及炎癥因子的產(chǎn)生。

綜上所述，清化飲可能通過調(diào)控miR-155及其靶基因SOCS1的表達(dá)從而降低胞核NFκB p65轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)水平，抑制下游炎癥因子的分泌，近而減輕脾胃濕熱證炎癥反應(yīng)而改善胃組織粘膜的損傷。這可能是清化飲臨床治療慢性胃炎脾胃濕熱證的分子作用機制，研究結(jié)果將為臨床治療提供基礎(chǔ)理論依據(jù)。

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作者簡介：王薇（1975—），碩士研究生，主要從事中西醫(yī)結(jié)合防治胃腸道疾病的研究。

通訊作者：胡海霞（1981—），女，醫(yī)學(xué)博士，副研究員。E-mail：454090364@qq.com