干旱脅迫對(duì)桑樹葉片氧化損傷及超微結(jié)構(gòu)的影響

任迎虹，祁偉亮，王 飛，劉松青，王 萍，陳卓緣

(成都師范學(xué)院 化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，四川 成都，611130)

桑(MorusalbaL.)為?？粕俾淙~喬木，在我國(guó)具有豐富的種質(zhì)資源，具有較強(qiáng)適應(yīng)惡劣自然環(huán)境的能力和突出的水土保持、綠化美化環(huán)境等生態(tài)功能，以及具有水果、藥用、飼料等較高的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，從而受到廣泛的關(guān)注[1]。近幾年，四川省果桑產(chǎn)業(yè)也得到較大規(guī)模的發(fā)展，如涼山州德昌縣，為全國(guó)最大果桑生產(chǎn)基地，2015年被中國(guó)蠶學(xué)會(huì)命名為全國(guó)第一家“中國(guó)果桑之鄉(xiāng)”，其轄區(qū)內(nèi)的主要栽培品種德果1號(hào)可果、葉兼用，種植面積達(dá)5萬(wàn)畝、年產(chǎn)鮮桑椹約6.92萬(wàn)噸、干桑椹約1000余噸、產(chǎn)繭約6.96萬(wàn)擔(dān)、桑產(chǎn)業(yè)助農(nóng)增收達(dá)5.1億元。但干旱在西南地區(qū)發(fā)生頻率高、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、波及范圍廣，嚴(yán)重影響桑葉的產(chǎn)量和品質(zhì)[2]，嚴(yán)重影響了果桑經(jīng)濟(jì)產(chǎn)業(yè)發(fā)展。因此，針對(duì)在干旱脅迫條件下的不同桑樹品種的生長(zhǎng)狀況和品種之間抗旱能力的差異，培育抗旱、高產(chǎn)新品種的研究，便成為桑蠶研究中的重要方向。

植物在受到輕度逆境(干旱、寒冷、水澇等)脅迫時(shí)，大多數(shù)植物會(huì)通過增加或減少滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，如可溶性蛋白[3-4]、可溶性糖、脯氨酸[5]等調(diào)節(jié)細(xì)胞滲透勢(shì)保持一定的膨壓，維持植物的形態(tài)，對(duì)細(xì)胞起到保護(hù)作用。同時(shí)干旱脅迫也會(huì)導(dǎo)致植物體內(nèi)產(chǎn)生活性氧(Reactive oxygen species, ROS)，如超氧陰離子(O2-)、過氧化氫(H2O2)和羥基自由(HO.)[6-8]，它們性質(zhì)活躍，具有高反應(yīng)活性，可通過電子傳遞或其它代謝途徑產(chǎn)生[6-8]。而ROS的產(chǎn)生可能是植物細(xì)胞在非生物脅迫和衰老條件下最早的反應(yīng)之一，在正常條件下，植物細(xì)胞中產(chǎn)生的ROS可通過體內(nèi)抗氧化酶清除系統(tǒng)，從而維持在相對(duì)穩(wěn)定的水平。若植物處于深度的逆境脅迫或者發(fā)生衰老時(shí)，機(jī)體內(nèi)ROS清除機(jī)制功能異常，多種來(lái)源的ROS過度積累導(dǎo)致防御系統(tǒng)崩潰、ROS爆發(fā)[9-10]。一方面ROS會(huì)與磷脂、膜受體蛋白發(fā)生脂質(zhì)過氧化反應(yīng)產(chǎn)生丙二醛(MDA)，嚴(yán)重破壞膜系統(tǒng)的完整性和流動(dòng)性[11-12]。另一方面，過量的ROS不但會(huì)損傷自身的細(xì)胞器，也會(huì)損傷周圍其他細(xì)胞，過量的ROS常常引起葉綠體損傷、線粒體腫脹、染色質(zhì)凝聚、凋亡體形成[13-16]，最終導(dǎo)致細(xì)胞死亡[17]。最初ROS被認(rèn)為是破壞細(xì)胞成分的有毒代謝產(chǎn)物, 但最近許多研究證明，ROS在細(xì)胞中可作為信號(hào)分子，誘導(dǎo)植物防御基因表達(dá)，激活多種包括非酶和酶抗防御機(jī)制來(lái)應(yīng)對(duì)氧化應(yīng)激[7-8, 17]完成對(duì)逆境脅迫的響應(yīng)[18]。

本研究選擇攀西地區(qū)主栽桑樹品種湖桑32、德果1號(hào)，模擬干旱脅迫條件，分析植物葉片的相對(duì)水分虧缺、脯氨酸、丙二醛、超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化物酶(POD)等生理生化指標(biāo)變化規(guī)律；并觀察干旱脅迫引起的不同桑品種葉肉細(xì)胞中葉綠體、線粒體等超微結(jié)構(gòu)及ROS的差異變化規(guī)律。旨在進(jìn)一步認(rèn)識(shí)干旱條件下桑樹的植物學(xué)特性、生理生化及細(xì)胞學(xué)響應(yīng)特征，為四川西南地區(qū)退耕還桑區(qū)桑樹抗旱育種及品種的篩選提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試桑樹品種為德果1號(hào)，湖桑32號(hào)(桑樹干旱脅迫常用對(duì)照材料)。試驗(yàn)材料均取自于德昌縣桑樹種質(zhì)資源圃。選取長(zhǎng)勢(shì)一致的幼苗種植到裝有營(yíng)養(yǎng)土(營(yíng)養(yǎng)土∶珍珠巖=1∶1)的10 L塑料盆中，每盆栽植4株幼苗，溫室自然光照下培養(yǎng)3個(gè)月(溫度為25℃，濕度為20%～30%，株高約45 cm)。在2018年7月份時(shí)，挑選長(zhǎng)勢(shì)一致的德果1號(hào)和湖桑32號(hào)各24盆。首先，將盆栽苗澆透水后進(jìn)行連續(xù)的干旱處理，試驗(yàn)設(shè)置為對(duì)照處理(CK)(土壤含水量為85%～100%)、輕度干旱脅迫(土壤含水量為65%～75%)、中度干旱脅迫(土壤含水量為50%～65%)和重度干旱脅迫(土壤含水量為35%～40%)4個(gè)梯度處理，每個(gè)梯度處理設(shè)6個(gè)重復(fù)。土壤含水量采用烘干稱重法測(cè)定，具體將盆栽苗澆透水后進(jìn)行自然干旱，每天傍晚取土樣(10～15 cm深)，待土壤含水量達(dá)到脅迫處理要求后，次日早晨8點(diǎn)，選取植株樹冠同方位、同葉位葉片，以備各指標(biāo)測(cè)定。

1.2 指標(biāo)測(cè)定方法

MDA含量測(cè)定采用硫代巴比妥酸法[19]。脯氨酸(Pro)含量測(cè)定采用磺基水楊酸法[20]。脫落酸(ABA)采用酶聯(lián)免疫間接法[21]。SOD活性測(cè)定采用氮藍(lán)四唑光化還原法[22]。POD活性測(cè)定采用愈創(chuàng)木酚法[23]。

水分飽和虧缺測(cè)定采用烘干稱重[24]：首先稱量葉片鮮重(Wf)，用蒸餾水浸泡24小時(shí)，取出用吸水紙吸去表面水分，立即稱量飽和鮮重(wt)，最后置于105℃的烘箱中，烘4 h殺青，后調(diào)至80℃，烘至恒重后，稱量干重(Wd)，相對(duì)含水量(RWC)=(Wf-Wd)/(Wt-Wd)*100%；水分飽和虧缺(WSD)=(1-RWC)*100%。

電鏡透射樣本固定24 h后，用0.1 mol·L-1磷酸緩沖液沖洗3次，然后1%鋨酸固定3 h，0.1 mol·L-1磷酸緩沖液沖洗20 min。經(jīng)過乙醇系列脫水，丙酮過渡，EPON812環(huán)氧樹脂包埋，Leica Ultracutr切片機(jī)切片，經(jīng)醋酸雙氧鈾和檸檬酸鉛染色后，在透色電鏡下觀察，拍照[19]。

ROS(O2-)組織化學(xué)檢測(cè)按照Wang等[25]的方法，含量測(cè)定按照Elstner和Heupel等方法[26]選取品種湖桑32和德果1號(hào)的正常處理和重度干旱處理樣本，黑暗條件下浸泡于NBT中，在室溫下保存一夜。取出后，將材料浸泡于無(wú)水乙醇中，然后在沸水中加熱直到葉綠素褪去，再用甘油浸制固定材料并制成裝片，顯微拍照觀察ROS(O2-)在細(xì)胞內(nèi)部的變化規(guī)律。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

用SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析，采用二因素隨機(jī)區(qū)組設(shè)計(jì)的方差分析法分析不同干旱處理間、桑樹品種間、干旱處理間×桑樹品種間的MDA、Pro、ABA、SOD、POD、WSD和ROS(O2-)含量的差異顯著性。如果差異顯著則分別用Duncan’s法進(jìn)行多重比較，并用PSCC 2018軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

由表1可以看出，除桑樹品種×干旱處理間的桑樹水分飽和虧缺(WSD)有顯著差異外(P< 0.05)，品種間、干旱處理間、品種×干旱處理交互作用間桑樹的MDA、Pro、ABA、SOD、POD和WSD 含量均存在極顯著差異(P<0.01) ，需對(duì)上述各指標(biāo)進(jìn)行多重比較。

表1 桑樹苗期生理指標(biāo)方差分析表(F值)

2.1 干旱脅迫后各理化指標(biāo)分析

隨著干旱脅迫加劇，德果1號(hào)和湖桑32的MDA、ABA、Pro的含量呈上升趨勢(shì)，各含量變化存在顯著性差異(P< 0.05)。從正常處理到重度處理德果1號(hào)、湖桑32的MDA含量分別上升了103.81%、53.51%(圖1B)。德果1號(hào)和湖桑32的Pro含量分別是正常處理時(shí)的12.86倍、14.15倍(圖1C)。在重度脅迫時(shí)德果1號(hào)和湖桑32的ABA含量分別為229.56 μg·g-1·FW、250.66 μg·g-1·FW(圖1A)。德果1號(hào)、湖桑32的水分飽和虧缺分別上升了192.24%、123.08%(圖1D)。SOD、POD呈現(xiàn)出先升后降的變化趨勢(shì)，且各含量變化存在顯著性差異(P< 0.05)(圖1E、F)。在中度脅迫時(shí)，SOD、POD酶活力達(dá)到最高水平，湖桑32和德果1號(hào)的SOD酶活力分別為754.5 U·g-1、710.0 U·g-1，而POD酶活力分別為213.35 U·g-1、137.08 U·g-1，該數(shù)據(jù)表明湖桑32的酶清除能力高于德果1號(hào)。

2.2 干旱脅迫下桑樹葉片形態(tài)特征及ROS的分布規(guī)律變化

在對(duì)照水分條件下，湖桑32(圖2a)和德果1號(hào)(圖2g)長(zhǎng)勢(shì)良好，且ROS(O2-)的含量(圖1G)及藍(lán)色斑點(diǎn)聚合產(chǎn)物在湖桑32(圖2c、e)和德果1號(hào)(圖2i、k)的葉片上均有少量積累。重度干旱脅迫時(shí)，湖桑32出現(xiàn)輕度葉片萎蔫現(xiàn)象(圖2b)，德果1號(hào)出現(xiàn)嚴(yán)重葉片萎蔫和大面積枯黃現(xiàn)象(圖2h)。德果1號(hào)的ROS(O2-)含量是湖桑32 的1.32倍，且德果1號(hào)葉片上的藍(lán)色斑點(diǎn)聚合產(chǎn)物面積增大、色度加深、主要分布于葉肉細(xì)胞及葉脈等部位，顯著多于湖桑32(圖2 j、l)?？赡茉蛟谟跈C(jī)體內(nèi)防御系統(tǒng)崩潰，ROS清除機(jī)制功能異常，多種來(lái)源的ROS過度積累導(dǎo)致ROS爆發(fā)。德果1號(hào)的葉片ROS積累程度大于湖桑32，表明德果1號(hào)對(duì)干旱脅迫的防御機(jī)制差于湖桑32。

圖1 不同干旱脅迫處理下生理指標(biāo)的變化規(guī)律Fig. 1 The change trend on Physiological index with the aggravation of drought stress

圖2 干旱脅迫引起的湖桑32(a、b)、德果1號(hào)(g、h)葉片形態(tài)學(xué)變化Fig. 2 Phenotypic symptoms of cultivars Husang 32 (a, b) and Deguo No.1 (g, h) in response to drought stress

2.3 干旱脅迫下葉片超微結(jié)構(gòu)變化情況

正常水分條件下，湖桑32(圖3a、b)和德果1號(hào)(圖4a、b)葉肉細(xì)胞有明顯的細(xì)胞核及葉綠體、線粒體等細(xì)胞器，各細(xì)胞的形狀規(guī)則。葉肉細(xì)胞壁均勻，未出現(xiàn)斷裂現(xiàn)象，細(xì)胞膜清晰可見。葉綠體較大、數(shù)目多，分布于細(xì)胞邊緣，呈梭形，排列整齊且結(jié)構(gòu)完整，同時(shí)類囊體片層垛疊整齊，膜系統(tǒng)結(jié)構(gòu)清晰完整，未見有解體現(xiàn)象。葉綠體內(nèi)部具有少量淀粉粒、嗜鋨顆粒；重度干旱脅迫后，德果1號(hào)細(xì)胞結(jié)構(gòu)(圖4c、d)變化顯著于湖桑32(圖3c、d)，主要特征：出現(xiàn)明顯的質(zhì)壁分離和細(xì)胞壁斷裂；細(xì)胞膜膨散，輪廓不清晰，內(nèi)部結(jié)構(gòu)混亂，細(xì)胞液泡收縮，核染色質(zhì)凝聚，線粒體結(jié)構(gòu)破壞；葉綠體囊體出現(xiàn)空泡化、片層結(jié)構(gòu)混亂，淀粉粒變少等。

圖3 湖桑32的超微結(jié)構(gòu)分析Fig. 3 Scanning electron micrographs of Husang 32

圖4 德果1號(hào)的超微結(jié)構(gòu)分析Fig. 4 Scanning electron micrographs of Deguo No.1

3 討 論

3.1 干旱脅迫引起的生理變化

所有生物都面臨著突發(fā)和不利的環(huán)境條件(如：干旱、高溫等)。植物與動(dòng)物不同的是，植物是不能移動(dòng)的，為適應(yīng)各種不利環(huán)境，植物進(jìn)化出了復(fù)雜的機(jī)制來(lái)感知外部信號(hào)，并對(duì)環(huán)境條件做出最佳反應(yīng)[27]。首先，葉片的保水能力直接反映了植株的抗旱性[28]，葉片相對(duì)含水量越小，說明植物缺水越嚴(yán)重，適應(yīng)干旱能力越弱；反之，則說明植物生理功能代謝旺盛，抗旱能力強(qiáng)[29]。本試驗(yàn)中，隨著干旱脅迫加劇，德果1號(hào)的葉片含水量變化顯著高于湖桑32，且德果1號(hào)葉片出現(xiàn)大面積的萎蔫和枯萎現(xiàn)象。而干旱脅迫引起桑樹葉片水分飽和虧缺變化規(guī)律與干旱脅迫引起的葉片形態(tài)學(xué)結(jié)果相一致，這進(jìn)一步證明德果1號(hào)的保水能力相對(duì)較差。葉片細(xì)胞為了維持在逆境下的滲透壓，保證植物正常生長(zhǎng)，Pro、ABA等物質(zhì)的形成，能夠有效提高細(xì)胞液濃度、降低細(xì)胞滲透勢(shì)、調(diào)節(jié)氣孔關(guān)閉以適應(yīng)干旱脅迫[30-31]。植物在干旱脅迫條件下，Pro含量的增加，在一定程度上能夠有效提高細(xì)胞液濃度、降低細(xì)胞滲透勢(shì)，對(duì)維持葉片細(xì)胞滲透壓和保證植物正常生長(zhǎng)發(fā)揮著重要作用[30-31]。但滲透調(diào)節(jié)能力的大小因品種的不同而表現(xiàn)出差異性。研究表明，隨著干旱脅迫加劇，Pro含量變化呈上升趨勢(shì)與抗旱性呈正相關(guān)，其中湖桑32的Pro積累顯著高于德果1號(hào)，說明湖桑32 具有較好的滲透調(diào)節(jié)能力，較高的Pro含量有利于緩解干旱脅迫對(duì)葉片造成的傷害[32]。ABA是一種植物內(nèi)源激素，參與調(diào)控植物對(duì)逆境的響應(yīng)，在干旱、寒害等脅迫環(huán)境下，具有促進(jìn)植物水、肥吸收平衡和協(xié)調(diào)體內(nèi)代謝的能力，可有效調(diào)控植物的營(yíng)養(yǎng)生長(zhǎng)與生殖生長(zhǎng)，對(duì)提高農(nóng)作物的產(chǎn)量和品質(zhì)具有極其重要的作用[33]。另外，ABA能通過引起氣孔關(guān)閉，降低蒸騰速率來(lái)改善干旱脅迫下植物的滲透調(diào)節(jié)作用，調(diào)節(jié)植株體內(nèi)的水分平衡，保持質(zhì)膜結(jié)構(gòu)和功能，提高植物抗逆性[6-7]。因此，ABA含量高低可作為植物抗旱性強(qiáng)弱的指標(biāo)之一。本研究結(jié)果表明，隨著干旱脅迫加劇，ABA含量呈增加趨勢(shì)，這標(biāo)志著干旱脅迫應(yīng)答機(jī)制的啟動(dòng)。且湖桑32的ABA積累顯著高于德果1號(hào)，說明ABA對(duì)調(diào)節(jié)氣孔開閉及調(diào)節(jié)植株體內(nèi)的水分平衡，保持質(zhì)膜結(jié)構(gòu)和功能等方面發(fā)揮重要作用，從而使湖桑32表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗旱性。

3.2 干旱脅迫引起的氧化應(yīng)激反應(yīng)變化差異

由于植物自身的滲透調(diào)節(jié)有一定的局限性，當(dāng)干旱嚴(yán)重時(shí)，植物會(huì)表現(xiàn)出膨壓不能維持、生長(zhǎng)率下降和氣孔阻力增加等現(xiàn)象[2]。因此，對(duì)植物細(xì)胞來(lái)說，如何維持活性氧產(chǎn)生與清除之間的平衡，增強(qiáng)抗氧化酶活性，從而避免對(duì)膜、光合器官等造成傷害，是其抵御逆境傷害的重要途徑[34]，其中SOD是O2-和H2O2的主要清除劑，催化O2-分解成H2O2和O2，POD最終將H2O2轉(zhuǎn)化為水和氧達(dá)到清除的效果[35-36]。但隨著干旱脅迫加劇，這種動(dòng)態(tài)平衡會(huì)被打破，造成植物體內(nèi)的氧化脅迫[22, 37]。本研究表明：在正常處理下湖桑32(2c、e)和德果1號(hào)(2i、k)均有少量的ROS積累，推測(cè)適量ROS 的產(chǎn)生，可作為信號(hào)分子激活ROS酶清除系統(tǒng)發(fā)揮作用[18]。隨著干旱脅迫加劇，湖桑32和德果1號(hào)的葉片均出現(xiàn)不同程度的ROS積累，而SOD(圖1E)與POD(圖1F)酶活力均呈先升后降的趨勢(shì)，這一結(jié)果與韓剛[38]和沈萩荻[39]等人研究結(jié)果一致，即ROS濃度未超過“閾值”時(shí)，SOD和POD酶活性會(huì)表現(xiàn)出較好的協(xié)同作用；但ROS水平超出一定閾值，自由基產(chǎn)生與清除間的平衡失調(diào)，就會(huì)導(dǎo)致酶活性的降低[40]。時(shí)連輝[41]報(bào)道，桑樹受到干旱脅迫時(shí)，細(xì)胞膜會(huì)受到傷害，透性增加，主要原因在于過量的ROS會(huì)引發(fā)膜脂過氧化加劇，導(dǎo)致膜結(jié)構(gòu)破壞。而膜脂過氧化產(chǎn)物MDA含量高低，可以有效反映植物膜脂受氧化損傷的程度[42]。本研究表明，在重度干旱脅迫下，德果1號(hào)的ROS積累量和MDA含量(0.139 μmolg-1·FW)顯著高于湖桑32，這與Yao等[13]、Ali等[43]、Zhu等[16]的研究一致，即ROS的產(chǎn)生與MDA成正相關(guān)。

3.3 干旱脅迫引起的細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化

葉片是植物感受干旱脅迫最敏感的器官，它的形態(tài)結(jié)構(gòu)及生理變化可反映植株適應(yīng)和抵御干旱的能力[44]。陳健輝等[45]對(duì)干旱脅迫下的3個(gè)大麥品種研究表明細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性與其抗旱性有關(guān)。本試驗(yàn)通過超微結(jié)構(gòu)觀察，正常供水條件下，湖桑32和德果1號(hào)的葉綠體都緊貼細(xì)胞壁分布，這種分布有利于CO2的吸收，進(jìn)而促進(jìn)光合作用[46]。干旱脅迫下，湖桑32和德果1號(hào)的葉綠體膨脹變形，淀粉粒變少、甚至消失，基質(zhì)片層排列松散、囊泡化嚴(yán)重，產(chǎn)生嗜鋨顆粒，葉肉細(xì)胞出現(xiàn)明顯的質(zhì)壁分離，葉綠體膜結(jié)構(gòu)遭到破壞。湖桑32的葉細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)受損程度低于德果1號(hào)(圖3)，說明湖桑32的抵抗干旱的能力強(qiáng)于德果1號(hào)，這與生理指標(biāo)、形態(tài)學(xué)和ROS積累結(jié)果相一致。

四川攀西地區(qū)氣候類型為干濕季節(jié)分明的季風(fēng)氣候，在6～10月為雨季，降雨量在600～1000 mm，占全年降雨量的90%以上；11月至翌年5月為干旱季節(jié)。由于攀西地區(qū)日照充足，且桑樹具有很好的防風(fēng)固土的作用，因此其成為攀西地區(qū)在二半山坡退耕還林的首選經(jīng)濟(jì)樹種。經(jīng)過長(zhǎng)時(shí)間的育種選擇和適應(yīng)性推廣，湖桑32和德果1號(hào)(果桑)已成為攀西地區(qū)的主要當(dāng)家桑品種，對(duì)促進(jìn)當(dāng)?shù)亟?jīng)濟(jì)發(fā)展、脫貧致富和生態(tài)環(huán)境保護(hù)具有重要意義。而果桑(德果1號(hào))以產(chǎn)果為主，采收季節(jié)在4～5月份之間，正處于攀西地區(qū)的干旱季節(jié)。為了保證果桑優(yōu)良品質(zhì)和產(chǎn)量，多采用漫灌澆水的措施，以緩解干旱造成的經(jīng)濟(jì)損失。但依然面臨很多問題，如二半山坡灌溉困難，其次漫灌也造成大量的水資源浪費(fèi)。因此，本研究通過抗旱性研究，探明德果1號(hào)和對(duì)照品種湖桑32的植物學(xué)特征、生理生化及細(xì)胞結(jié)構(gòu)變化規(guī)律，為進(jìn)一步闡明耐旱品種湖桑32和干旱敏感性品種德果1號(hào)的抗旱差異機(jī)理打下基礎(chǔ)。在本試驗(yàn)基礎(chǔ)上，課題組已完成德果1號(hào)和湖桑32在干旱脅迫下的轉(zhuǎn)錄組測(cè)序工作。下一步將從生理生化、細(xì)胞、分子學(xué)等角度出發(fā)，挖掘抗旱基因，為德果1號(hào)的品種改良提供理論依據(jù)。