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    針刺百會、印堂對腦卒中抑郁大鼠神經(jīng)遞質(zhì)釋放及miRNA-219/CaMKⅡγ通路的影響*

    2021-01-06 13:48:06黃秀容柳愛紅王興旺方宣瓊
    針灸臨床雜志 2020年12期
    關鍵詞:神經(jīng)遞質(zhì)蔗糖腦組織

    黃秀容,袁 青,柳愛紅,王興旺,方宣瓊

    (1.深圳市人民醫(yī)院,廣東 深圳 518001; 2.廣州中醫(yī)藥大學針灸康復臨床醫(yī)學院,廣東 廣州 510405)

    腦卒中后抑郁癥(Post stroke depression,PSD)是腦卒中患者經(jīng)常出現(xiàn)的情感障礙性疾病,臨床癥狀以悲觀絕望、食欲下降、活動減少以及睡眠紊亂等為主,嚴重時會導致自殺,嚴重延緩患者康復,影響其生活質(zhì)量,并可再次誘發(fā)卒中[1]。PSD作為腦卒中患者常見的并發(fā)癥之一,腦內(nèi)炎癥及神經(jīng)遞質(zhì)功能缺陷在其發(fā)病過程中發(fā)揮著重要作用,腦部缺血缺氧極易引發(fā)患者腦組織炎癥損傷并造成神經(jīng)功能障礙,從而誘發(fā)PSD[2-3]。單胺類神經(jīng)遞質(zhì)水平與人類情感、認知功能密切相關,腦卒中可導致患者腦組織神經(jīng)遞質(zhì)減少,進而引發(fā)抑郁、攻擊性增強等情感障礙癥狀[4-5]。研究發(fā)現(xiàn),miRNA-219水平與缺血性腦卒中患者梗死體積、炎癥水平呈負相關,降低其水平可加劇腦組織炎癥損傷[6]。miRNA-219可通過下調(diào)鈣/鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶Ⅱγ(Calcium/calmodulin-dependent protein kinase kinase Ⅱγ,CaMKⅡγ)表達,改善臨床使用氯胺酮誘發(fā)的精神分裂癥[7]。另有研究發(fā)現(xiàn),β-CaMKⅡ蛋白參與抑郁的發(fā)生發(fā)展,抑制其表達可明顯改善抑郁大鼠臨床癥狀[8]。根據(jù)以上研究推測miRNA-219/CaMKⅡγ信號可能是抑郁癥的潛在治療靶點。針刺特定穴位是臨床治療PSD的常用方法,具有簡便、安全和經(jīng)濟等優(yōu)點,針刺百會、印堂、神庭、風池、大椎及四神聰穴可抑制抑郁患者體內(nèi)炎癥,提高神經(jīng)遞質(zhì)5-羥色胺(5-hydroxytryptamine,5-HT)水平,緩解其臨床癥狀[9-10],但針刺百會、印堂對腦卒中抑郁大鼠神經(jīng)遞質(zhì)釋放及miRNA-219/CaMKⅡγ通路的影響目前還不清楚。本研究通過建立PSD大鼠模型,對此進行探討。

    1 材料與方法

    1.1 實驗材料

    1.1.1 動物 清潔級SD大鼠購自康美華大基因技術有限公司,動物生產(chǎn)許可證號:SYXK(粵)2019-0205,動物質(zhì)量合格證號:00592317,雄性,體質(zhì)量180~220 g。所有大鼠在本院動物房中適應飼養(yǎng)1周后進行實驗,飼養(yǎng)條件:自然照明,溫度25℃,相對濕度50%,大鼠自由飲食、飲水,保持動物房環(huán)境清潔、安靜和通風良好。

    1.1.2 主要試劑及儀器 文拉法辛(批號B33845)、蔗糖(批號B21647)購自上海源葉生物科技有限公司;NE(批號30189117)、DA 標準品(批號IR-44626)購自上海甄準生物科技有限公司;5-HT標準品(批號D1834)購自上海寶曼生物科技有限公司;兔源GAPDH一抗(批號ab181602)、兔源CaMKⅡγ一抗(批號ab79359)、羊抗兔二抗(批號ab150077)購自美國Abcam公司;RNAiso Plus試劑盒(批號9108)、逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(批號RR037Q/A/B)、熒光定量PCR試劑盒(批號639519)購自日本Takara公司;蛋白裂解液(批號RIPA20110527)購自上海研謹生物科技有限公司;BCA試劑盒(批號P0011)、HE染色試劑盒(批號C0105)購自上海碧云天公司等。華佗牌針灸針(0.20 mm×15 mm)購自蘇州醫(yī)療用品有限公司;敞箱(100 cm×100 cm×50 cm)購自北京友誠嘉業(yè)生物科技有限公司;Agilent1260液相色譜儀購自美國安捷倫公司;3900高通量DNA合成儀購自美國應用生物系統(tǒng)公司;CFX96 Touch Deep Well熒光定量PCR儀購自美國Bio-Rad公司;Mini PROTEAN蛋白電泳儀及轉(zhuǎn)膜儀購自美國Bio-Rad公司;2500凝膠成像系統(tǒng)購自上海天能公司等。

    1.2 實驗方法

    1.2.1 動物模型制備及分組給藥 首先建立腦卒中大鼠模型,參照文獻[11],方法如下:采用2.5%戊巴比妥鈉溶液(45 mg/kg腹腔注射)麻醉SD大鼠,頸部備皮、消毒后,經(jīng)頸部解剖暴露右側(cè)頸總動脈(CCA)、頸外動脈(ECA)及頸內(nèi)動脈(ICA)后進行鈍性分離,取兩根6-0絲線,其中一根結(jié)扎ECA、CCA遠端,另一根穿過ICA松松地環(huán)繞1周,然后使用一根長40 mm、直徑0.26 mm的尼龍單絲,將其光滑圓潤的尖端通過CCA穿刺進入ICA,并經(jīng)ICA進入大腦中動脈(MCA),直到有輕微阻力,接著收緊環(huán)繞ICA的絲線,將尼龍線固定,防止出血,2 h后抽出尼龍線,按照Longa分級法[12]評價模型:0分,無明顯神經(jīng)功能缺損;1分,對側(cè)前爪不能完全伸直;2分,大鼠向左側(cè)盤旋;3分,大鼠向左側(cè)墜落;4分,不能行走。評分為1~3分的大鼠采用慢性不可預見性溫和應激刺激后孤養(yǎng)法[13-14]制備PSD模型,如下方法:禁食24 h、禁水24 h、以1 mA電流足底電擊30 min(1次/min,每次持續(xù)1 s)、晝夜顛倒24 h、4℃冰水游泳5 min、水平振蕩30 min(160次/min)、夾尾1 min,每天隨機選取1種方法刺激大鼠,保證不連續(xù)出現(xiàn)同種刺激,持續(xù)3周,然后以單籠飼養(yǎng)大鼠16 d,測得大鼠蔗糖水消耗量降低,敞箱水平與垂直運動次數(shù)均降低,表明模型建立成功。共建模54只,成功48只,隨機分為模型組、針刺組、非經(jīng)非穴組和文拉法辛組,每組12只,另取12只大鼠進行同樣的手術,不插入尼龍線,不做慢性不可預見性溫和應激刺激,正常飼養(yǎng)并設定為假手術組。

    依據(jù)《大鼠穴位圖譜》及解剖學方法,針刺組大鼠選取百會、印堂穴,非經(jīng)非穴組大鼠選取雙側(cè)前肢足背側(cè)第3、4 跖骨間隙凹陷處[14],采用0.20 mm×15 mm針灸針在大鼠清醒狀態(tài)下針刺,進針深度2~3 mm,20 min行針1次,每次行針30 s,針刺40 min,每日針刺1次,持續(xù)4周。以生理鹽水溶解文拉法辛配制為終濃度2 mg/kg的溶液,文拉法辛組大鼠以10 mL/kg的劑量進行灌胃[15],假手術組和模型組大鼠以等劑量生理鹽水灌胃,1次/d,持續(xù)4周。

    1.2.2 大鼠神經(jīng)功能損傷檢測 治療結(jié)束24 h后,參照Longa分級法[12]對各組大鼠神經(jīng)功能缺損進行評分。

    1.2.3 大鼠行為學檢測及標本收集 神經(jīng)功能損傷檢測結(jié)束后,以蔗糖水消耗實驗及敞箱實驗檢測大鼠行為學變化,蔗糖水消耗實驗:將大鼠禁食禁水24 h,然后給予10 g/L蔗糖水,讓其自由飲用,24 h后計算糖水消耗量,公式為:蔗糖水消耗量=蔗糖水消耗量/蔗糖水總量×100%;敞箱實驗:大鼠置于敞箱正中,以大鼠三足跨入鄰格為水平運動1次,以大鼠雙足離開底面直立為垂直運動1次,測定5 min內(nèi)大鼠水平運動與垂直運動次數(shù)。

    行為學檢測結(jié)束后,麻醉大鼠后處死,迅速解剖分離大腦,獲得腦組織,剪取約1.5 g儲存在-80℃冰箱備用。

    1.2.4 高效液相色譜法測定大鼠腦組織NE、5-HT及DA含量 取腦組織約0.5 g剪碎后,置于蛋白裂解液中混勻,以勻漿機制備為勻漿液,離心后收集上清,置于4℃冰箱中解凍,以高效液相色譜儀測定其中NE、5-HT及DA水平,具體操作參照說明書進行。

    1.2.5 qRT-PCR檢測大鼠腦組織miRNA-219及CaMKⅡγ mRNA水平 取腦組織0.5 g剪碎后,置于RNAiso Plus混勻,參照其說明書的操作步驟提取總RNA,接著采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒及熒光定量PCR試劑盒將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA后進行熒光定量PCR反應,參照試劑盒各自的說明書進行反應體系的配制、反應條件的設定,使用U6為miR-219的內(nèi)參,GADPH為CaMKⅡγ的內(nèi)參,以2-ΔΔCt算法計算分析所得實驗數(shù)據(jù),進而得到各組樣品中miRNA-219及CaMKⅡγ mRNA相對表達量。miR-219、U6、CaMKⅡγ和GAPDH引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。各基因引物序列見表1。

    表1 qRT-PCR引物序列

    1.2.6 蛋白免疫印跡法檢測各組大鼠腦組織CaMKⅡγ蛋白表達 冰箱備用腦組織中剩余腦組織剪碎后,置于蛋白裂解液中混勻,以勻漿機制備勻漿液,離心后取上清獲得總蛋白樣品液,以BCA試劑盒測量其中蛋白總濃度,具體操作步驟參照說明書進行,然后根據(jù)結(jié)果調(diào)整各組樣品,使總蛋白濃度相同,煮沸5 min后變性,各組取相同體積的樣品液上樣進行電泳,蛋白分離后將其轉(zhuǎn)移至PVDF膜上,使用5%脫脂奶粉溶液于室溫下進行封閉,根據(jù)蛋白分子量截取目的蛋白條帶,將其置于分別含有兔源GAPDH、CaMKⅡγ一抗的孵育盒中,于4℃冰箱中孵育過夜,以TBST漂洗后加入羊抗兔二抗,置于搖床上室溫孵育2 h,以TBST再次漂洗后采用增強化學發(fā)光法顯色,采用凝膠成像系統(tǒng)拍攝蛋白條帶,并以Quantity One軟件對其進行分析,得到各組蛋白相對表達量。

    1.3 統(tǒng)計學分析

    2 結(jié)果

    2.1 各組大鼠神經(jīng)功能比較

    與假手術組比較,模型組大鼠神經(jīng)功能缺損評分明顯升高(P<0.05)。與模型組相比,文拉法辛組、針刺組大鼠神經(jīng)功能缺損評分降低(P<0.05);非經(jīng)非穴組大鼠神經(jīng)功能缺損評分差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。針刺組與文拉法辛組比較,大鼠神經(jīng)功能缺損評分差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖1。

    注:A.假手術組;B.模型組;C.非經(jīng)非穴組;D.針刺組;E.文拉法辛組。與假手術組比較,aP<0.05;與模型組比較,bP<0.05。圖1 各組大鼠神經(jīng)功能缺損評分比較

    2.2 各組大鼠行為學比較

    與假手術組比較,模型組大鼠蔗糖水消耗量、水平運動與垂直運動次數(shù)明顯降低(P<0.05)。與模型組相比,文拉法辛組、針刺組大鼠蔗糖水消耗量、水平運動與垂直運動次數(shù)升高(P<0.05);非經(jīng)非穴組大鼠蔗糖水消耗量、水平運動與垂直運動次數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。針刺組與文拉法辛組比較,大鼠蔗糖水消耗量、水平運動與垂直運動次數(shù)差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表2。

    表2 各組大鼠蔗糖水消耗量、水平運動與垂直運動次數(shù)比較

    2.3 各組大鼠腦組織中神經(jīng)遞質(zhì)NE、5-HT和DA含量比較

    與假手術組比較,模型組大鼠腦組織中神經(jīng)遞質(zhì)NE、5-HT和DA含量明顯降低(P<0.05)。與模型組比較,文拉法辛組、針刺組大鼠腦組織中神經(jīng)遞質(zhì)NE、5-HT和DA含量升高(P<0.05);非經(jīng)非穴組大鼠腦組織中神經(jīng)遞質(zhì)NE、5-HT和DA含量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。針刺組與文拉法辛組比較,大鼠腦組織中神經(jīng)遞質(zhì)NE、5-HT和DA含量差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表3。

    表3 各組大鼠腦組織神經(jīng)遞質(zhì)NE、5-HT和DA含量

    2.4 各組大鼠腦組織miRNA-219、CaMKⅡγ mRNA水平比較

    與假手術組相比,模型組大鼠腦組織中miRNA-219明顯降低(P<0.05),CaMKⅡγ mRNA表達明顯升高(P<0.05)。與模型組相比,文拉法辛組、針刺組大鼠腦組織中miRNA-219升高(P<0.05),CaMKⅡγ mRNA表達降低(P<0.05);非經(jīng)非穴組大鼠腦組織中miRNA-219、CaMKⅡγ mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。針刺組與文拉法辛組比較,大鼠腦組織中miRNA-219、CaMKⅡγ mRNA表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見表4。

    表4 各組大鼠腦組織miRNA-219、CaMKⅡγ mRNA相對表達水平

    2.5 各組大鼠腦組織中CaMKⅡγ蛋白表達比較

    與假手術組相比,模型組大鼠腦組織中CaMKⅡγ蛋白表達明顯升高(P<0.05)。與模型組相比,文拉法辛組、針刺組大鼠腦組織中CaMKⅡγ蛋白表達降低(P<0.05);非經(jīng)非穴組大鼠腦組織中CaMKⅡγ蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。針刺組與文拉法辛組比較,大鼠腦組織中CaMKⅡγ蛋白表達差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。見圖2、圖3。

    圖2 免疫印跡檢測各組大鼠腦組織中CaMKⅡγ蛋白表達

    注:A.假手術組;B.模型組;C.非經(jīng)非穴組;D.針刺組;E.文拉法辛組。與假手術組相比,aP<0.05;與模型組相比,bP<0.05。圖3 各組大鼠腦組織中CaMKⅡγ蛋白表達比較

    3 討論

    本研究以大腦中動脈線栓阻塞法建立腦卒中模型大鼠后,采用慢性不可預見性溫和應激刺激后孤養(yǎng)法制備PSD大鼠模型。結(jié)果顯示,模型大鼠神經(jīng)功能缺損評分明顯升高,表明建模大鼠神經(jīng)功能明顯受損。蔗糖水消耗實驗可檢測大鼠快感缺乏程度,曠場實驗可測定大鼠的自主活動及探索行為強度,兩者均是判定抑郁癥狀嚴重程度的常用實驗手段[16],單胺類神經(jīng)遞質(zhì)去甲腎上腺素(Norepinephrine,NE)、多巴胺(Dopamine,DA)和5-HT在人類情感、認知功能的正常維持中起到關鍵作用,腦組織中含量降低可引發(fā)患者抑郁[5]。本研究發(fā)現(xiàn),與假手術組比較,模型大鼠蔗糖水消耗量、水平運動與垂直運動次數(shù)、神經(jīng)遞質(zhì)NE及5-HT、DA含量均明顯降低,表明以慢性不可預見性溫和應激刺激后孤養(yǎng)法處理腦卒中大鼠可導致其快感缺乏,興趣及自主活動降低,神經(jīng)傳導功能受損,引發(fā)抑郁,揭示PSD大鼠模型建立成功。

    PSD的臨床治療主要分為藥物療法和非藥物療法,非藥物療法包括針刺治療、經(jīng)顱直流電刺激、心理疏導和高壓氧治療等,其中針刺療法因簡便有效、經(jīng)濟安全等優(yōu)點而廣泛應用于臨床,近年來因穴位選擇的不同,使得其治療方法越來越豐富多樣。中醫(yī)學認為,PSD屬于郁證,因內(nèi)傷七情造成,氣機紊亂、腦失所養(yǎng)、神機不運是其主要病機,印堂為經(jīng)外奇穴,以針刺之具有鎮(zhèn)靜安神的功效,百會穴屬于督脈經(jīng)穴,以針刺之可調(diào)控人體陰陽平衡、改善精神異常[17-18]。本研究結(jié)果顯示,針刺百會、印堂穴可降低模型大鼠神經(jīng)功能缺損評分,升高蔗糖水消耗量、水平運動與垂直運動次數(shù),表明經(jīng)百會、印堂穴進行針刺治療可修復PSD大鼠神經(jīng)功能障礙,提高大鼠快感、興趣及活動度,進而改善抑郁癥狀,進一步證實針刺對PSD具有一定療效。

    PSD發(fā)病機制復雜,腦損傷、神經(jīng)遞質(zhì)、炎癥、基因多態(tài)性與社會因素等均是其致病因素,其中腦內(nèi)炎癥導致的腦組織變性壞死,腦部單胺類神經(jīng)遞質(zhì)NE、5-HT和DA缺乏造成的神經(jīng)傳導功能缺陷是PSD發(fā)生發(fā)展的重要誘因[5,19]。miRNA-219作為腦內(nèi)廣泛分布的內(nèi)源性非編碼小RNA,可與CaMKⅡγ mRNA結(jié)合抑制其蛋白表達,參與調(diào)控突觸發(fā)生、神經(jīng)發(fā)育和神經(jīng)元凋亡等過程,與精神分裂癥、抑郁等神經(jīng)疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關[6-8]。研究顯示,抑郁癥患者外周血miRNA-219表達水平降低、CaMKⅡγ mRNA表達水平升高,提示miRNA-219/CaMKⅡγ信號通路可能是治療抑郁癥的作用靶點之一,但目前針刺百會、印堂穴是否對PSD大鼠神經(jīng)遞質(zhì)釋放及miRNA-219/CaMK Ⅱγ通路有影響還未見研究[20]。本研究對此進行探討,結(jié)果顯示針刺百會、印堂穴后,PSD大鼠腦組織中神經(jīng)遞質(zhì)NE及5-HT、DA含量、腦組織miRNA-219表達升高,CaMKⅡγ mRNA及蛋白表達降低,表明針刺百會、印堂穴可增強PSD大鼠神經(jīng)傳導功能、上調(diào)miRNA-219表達、下調(diào)CaMKⅡγ表達,可能與促進神經(jīng)功能修復、改善抑郁癥狀有關。

    綜上所述,針刺百會、印堂穴可抑制miRNA-219表達、促使CaMKⅡγ表達,促進腦卒中大鼠腦部神經(jīng)遞質(zhì)釋放,促進神經(jīng)功能修復并改善抑郁癥狀,調(diào)控miRNA-219/CaMKⅡγ信號通路可能是其作用機制之一,為臨床PSD的治療提供了新思路,因本研究只對其分子機制進行了初步研究,未上調(diào)或抑制miR-219表達來進行對照驗證,故存在一定不足,有待后續(xù)進行深入探討。

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