miR-34a-Sirt1-NRF2信號通路對腦缺血損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細胞增殖的影響

廖 偉 蔡崇明 王海彬 程 偉 曾照彬 楊少春

贛南醫(yī)學院第一附屬醫(yī)院神經(jīng)外科，江西贛州 341000

腦缺血疾病是一種可導致神經(jīng)元不可逆性損傷、壞死的腦血管疾病，嚴重威脅人類健康?，F(xiàn)有的溶栓、神經(jīng)營養(yǎng)治療等方式對于腦缺血損傷的治療效果有限。據(jù)統(tǒng)計，高達75%的腦缺血損傷患者存有不同程度的神經(jīng)功能障礙，如何修復腦缺血損傷后導致的神經(jīng)功能障礙成為目前治療的難點[1]。目前在臨床上，內(nèi)源性神經(jīng)干細胞是腦缺血損傷治療的一個突破點，提高內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的數(shù)量能夠治療腦缺血損傷[2]。有研究證實[3-4]，miR-34a 能通過沉默信息調(diào)節(jié)因子1（Sirt1）調(diào)控外源性神經(jīng)干細胞增殖。但其是否參與調(diào)控腦缺血損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的增殖，目前國內(nèi)外尚未見相關(guān)報道。為此，本研究通過觀察大鼠腦缺血損傷后miR-34a 及其靶基因Sirt1、核因子E2 相關(guān)因子2（NRF2）等的表達情況，并利用激活Sirt1 的表達，觀察其上游miR-34a 及下游NRF2 的表達變化，進一步探討miR-34a-Sirt1-NRF2 通路調(diào)控腦缺血損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細胞增殖過程，以進一步揭示腦缺血損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的信號調(diào)控機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選擇50只健康成年雄性SD大鼠（購自贛南醫(yī)學院實驗動物中心，合格證號：021-96-02），體重200～300 g，8 周齡。飼養(yǎng)環(huán)境：自由喂養(yǎng)，不限制飲食，室溫（20±2）℃，濕度（60±10）%，光照時間12 h（8∶00～20∶00）。本研究經(jīng)相關(guān)實驗動物倫理委員會審核通過。

1.2 主要儀器及試劑

FL40S.BLB Toshiba 熒光顯微鏡（日本東芝機械株式會社）、ABI 7900HT Fast 實時熒光定量PCR系統(tǒng)（美國應用生物系統(tǒng)ABI公司）、Chemilmager5500 自動電泳凝膠成像分析系統(tǒng)（美國AlphaInnotech公司）、Ts2-FL 倒置顯微鏡（日本尼康株式會社）、FACSCalibur流式細胞儀（美國BD公司）、3-30K 臺式低溫超速離心機（德國希格瑪Sigma 實驗室離心機公司）；白藜蘆醇試劑（上海梯希愛化成工業(yè)發(fā)展有限公司、生產(chǎn)批號501-36-0）。

1.3 實驗分組及方法

在50只健康成年雄性SD大鼠中，將10只設為對照組，僅暴露動脈，不做缺血處理。另外40只大鼠參考文獻[3]制備改良局灶性大腦中動脈栓塞（MCAO）腦缺血損傷模型：常規(guī)消毒鋪巾，4%水合氯醛按1 mL/100 g 腹腔注射，正中頸部切口，分離并暴露右側(cè)頸總、頸外、頸內(nèi)動脈，結(jié)扎頸外動脈及其分支，于頸外、頸總動脈近心端，頸內(nèi)動脈遠心端分別留置動脈夾夾閉，于頸外動脈近分叉處剪一“V”字形切口，插入制備好的栓線，扎緊備線，松開頸內(nèi)動脈遠心端動脈夾，使線栓入頸內(nèi)動脈，插入深度在180～200 mm，阻斷大腦中動脈血液供應，松開頸總動脈動脈夾，線栓外留1 cm；待缺血2 h后，將線栓拔出，電凝頸外動脈斷端，松開頸總動脈結(jié)扎線，實現(xiàn)再灌注，縫合皮膚切口，術(shù)中室溫保持在（23±2）℃。麻醉清醒后大鼠出現(xiàn)以左前肢為主的偏癱作為模型成功的標志，將造模成功的40只大鼠分為白藜蘆醇組（n=10）、腦缺血1 d組（n=10）、腦缺血3 d組（n=10）、腦缺血7 d組（n=10），其中，白藜蘆醇組每日經(jīng)腹腔注射白藜蘆醇，劑量30 mg/kg，每日1次。對照組在手術(shù)當天處死并取材，腦缺血1 d組、腦缺血3 d組、腦缺血7 d組在造模第1、3、7 天以及白藜蘆醇組在造模第7 天處死并取材。

1.4 檢測指標

1.4.1 逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應（RT-PCR）檢測miR-34a mRNA 的相對表達水平 應用RT-PCR 法檢測各組大鼠室管膜下區(qū)miR-34a mRNA 的相對表達水平。具體操作：嚴格按照Trizol reagent 說明書提取室管膜下區(qū)腦組織總RNA，依照OD260/OD280 比值，估測RNA質(zhì)量（比值在1.8～2.0 之間，滿足實驗要求），-80℃保存?zhèn)溆?。?00 ng 總RNA、miRNA 莖環(huán)引物，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進行逆轉(zhuǎn)錄。采用SYBR GreenI Real-time PCR Master Mix 試劑盒進行RT-PCR 檢測miR-34amRNA的相對表達量。

1.4.2 Western blotting 法檢測Sirt1、NRF2 蛋白的相對表達量 取各組大鼠室管膜下區(qū)腦組織，加入適量冷裂解緩沖液、蛋白酶抑制劑、磷酸酶抑制劑、苯甲基磺酰氟化物混勻，離心處理（轉(zhuǎn)速3000 r/min，離心半徑4 cm，離心時間10 min）取全蛋白提取物，滴加兔抗人Sirt1 單克隆抗體、NRF2 兔單克隆抗體。隨后應用ECL 化學發(fā)光試劑盒檢測雜交信號，曝光后掃描膠片，使用Image J 軟件分析各蛋白條帶的灰度值，以β-actin 蛋白作為內(nèi)參，計算出相應的目標蛋白條帶的灰度值與內(nèi)參蛋白條帶灰度值的比值，即為Sirt1、NRF2 目標蛋白的相對表達量。

1.5 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 23.0 統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以均數(shù)±標準差（±s）表示，多組間均數(shù)比較采用單因素方差分析，任意兩組間比較采用LSD-T檢驗，P＜0.05 為差異存在統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

與對照組比較，白藜蘆醇組、腦缺血1 d組、腦缺血3 d組、腦缺血7 d組miR-34a mRNA 相對表達量升高，Sirt1、NRF2 蛋白相對表達量降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與白藜蘆醇組比較，腦缺血1 d組、腦缺血3 d組、腦缺血7 d組miR-34a mRNA 相對表達量升高，Sirt1、NRF2 蛋白相對表達量降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與腦缺血1 d組比較，腦缺血3 d組、腦缺血7 d組miR-34a mRNA 相對表達量升高，Sirt1、NRF2 蛋白相對表達量降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與腦缺血3 d組比較，腦缺血7 d組miR-34a mRNA 相對表達量升高，Sirt1、NRF2 蛋白相對表達量降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）（表1）。

表1 各組miR-34a mRNA 和Sirt1、NRF2蛋白相對表達量的比較（±s）

表1 各組miR-34a mRNA 和Sirt1、NRF2蛋白相對表達量的比較（±s）

與對照組比較，aP＜0.05；與白藜蘆醇組比較，bP＜0.05；與缺血1 d組比較，cP＜0.05；與缺血3 d組比較，dP＜0.05

組別例數(shù) miR-34a mRNA Sirt1 蛋白 NRF2 蛋白對照組白藜蘆醇組腦缺血1 d組腦缺血3 d組腦缺血7 d組10 10 10 10 10 1.09±0.88 2.13±0.92a 3.21±1.04ab 4.68±1.39abc 6.14±1.75abcd 2.91±0.24 2.50±0.46a 2.01±0.32ab 1.58±0.56abc 1.04±0.51abcd 3.35±0.42 2.99±0.54a 2.50±0.89ab 2.06±0.65abc 1.01±0.37abcd

3 討論

目前在臨床上，內(nèi)源性神經(jīng)干細胞再生療法是腦缺血損傷治療方法之一。正常生理情況下，內(nèi)源性神經(jīng)干細胞處于“休眠”的狀態(tài)，但腦缺血損傷后，內(nèi)源性神經(jīng)干細胞能夠定向增殖分化并靶向遷移至腦缺血損傷部位，修復受損神經(jīng)[6]。室管膜下區(qū)是哺乳動物顱內(nèi)最大的神經(jīng)壁龕，此處聚集著較多的內(nèi)源性神經(jīng)干細胞，但正常情況下內(nèi)源性神經(jīng)干細胞數(shù)量有限，腦缺血損傷后僅僅依靠激活正常數(shù)量的內(nèi)源性神經(jīng)干細胞是遠遠不夠的，因此如何提高神經(jīng)干細胞的數(shù)量是當前研究的熱點及難點[7]。相關(guān)研究表明[8]，腦缺血損傷后，內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的增殖受諸多因素調(diào)控，外源性輸入促紅細胞生成素、神經(jīng)生長因子等均可促進腦缺血損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的增殖，但其具體調(diào)控機制尚不明確。王瑞彤等[9]的研究發(fā)現(xiàn)，在哺乳動物的胚胎發(fā)育階段，大腦內(nèi)有包括miR-34a、miR-126、miR-200b 等在內(nèi)大量miRNA 的表達，提示miRNAs 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育過程中以及對神經(jīng)干細胞命運的調(diào)控過程中發(fā)揮了重要的作用。

miR-34a是一種高度進化保守的miRNA，相關(guān)文獻報道[10]，miR-34a 能夠通過調(diào)節(jié)基因及蛋白的表達，參與神經(jīng)細胞的增殖及分化，在神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮獨特的調(diào)控作用。同時體外研究發(fā)現(xiàn)[11]，在包括胚胎干細胞、神經(jīng)干細胞等干細胞的增殖分化過程中，miR-34a 能夠促使胚胎干細胞、神經(jīng)干細胞進一步增殖并分化為神經(jīng)元等終末神經(jīng)細胞，在胚胎干細胞、神經(jīng)干細胞的增殖分化過重中起著重要的作用。

Sirt1是一種依賴煙酰胺腺嘌呤二核苷酸的組蛋白去乙?；?，參與了體內(nèi)許多生理功能的調(diào)節(jié)[12]。姬紅培等[13]研究發(fā)現(xiàn)，Sirt1 在胚胎干細胞定向分化的神經(jīng)干細胞中表達，在輕度氧化或高表達Sirt1 的情況下能夠促使胚胎干細胞定向分化的神經(jīng)干細胞分化，而抑制Sirt1 表達則對于維持神經(jīng)干細胞的增殖具有促進作用。趙忠惠等[14]同樣發(fā)現(xiàn)，Sirt1是神經(jīng)保護的重要作用因子。NRF2 核因子是一種調(diào)節(jié)細胞內(nèi)氧化還原平衡的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子，作為Sirt1 的下游基因，與Sirt1 協(xié)同參與包括眾多基因轉(zhuǎn)錄、能量代謝以及細胞增殖的過程。眾多研究已證實[15]，Sirt1 作為miR-34a 的靶基因能夠參與干細胞的增殖與分化，而miR-34a可通過Sirt1/NRF2 通路一定程度修復心肌及肝臟的缺血再灌注損傷。本研究結(jié)果也顯示，與對照組比較，白藜蘆醇組、腦缺血1 d組、腦缺血3 d組、腦缺血7 d組miR-34a mRNA 相對表達量升高，Sirt1、NRF2 蛋白相對表達量降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與白藜蘆醇組比較，腦缺血1 d組、腦缺血3 d組、腦缺血7 d組miR-34a mRNA 相對表達量升高，Sirt1、NRF2 蛋白相對表達量降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與腦缺血1 d組比較，腦缺血3 d組、腦缺血7 d組miR-34a mRNA 相對表達量升高，Sirt1、NRF2 蛋白相對表達量降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。與腦缺血3 d組比較，腦缺血7 d組miR-34a mRNA 相對表達量升高，Sirt1、NRF2 蛋白相對表達量降低，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。表明了miR-34a 有可能通過調(diào)節(jié)Sirt1/NRF2 通路來調(diào)控腦缺血損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細胞增殖過程。