人抗菌肽LL-37與肺部疾病的研究進展

王全珍，張玉可，姜志明

（山東第一醫(yī)科大學第一附屬醫(yī)院RICU，山東 濟南 250014）

0 引言

抗菌肽（Anti Microbial Peptides，AMPs）是固有免疫的重要組成部分，除能直接殺滅有害微生物，它還能抑制腫瘤、中和內毒素及抗炎，并且能夠趨化樹突狀細胞、單核細胞和記憶T細胞，從而啟動適應性免疫[1]，是連接固有免疫和適應性免疫之間的橋梁。哺乳動物體內主要有兩大抗菌肽家族defensin和cathelicidin。Cathelicidin家族是一類信號肽高度保守、成熟肽高度多樣、功能豐富的抗菌肽，主要由中性粒細胞、皮膚和黏膜上皮細胞分泌。Cathelicidin抗菌肽在人體僅LL-37一種，在小鼠中表達LL-37的蛋白命名為CRAMP。

近年的研究表明LL-37在多種肺部疾病的發(fā)生和發(fā)展中起到重要的調控作用。本文總結了LL-37的結構、功能及其在多種肺部疾病中的作用機制，為探索以LL-37為靶點的治療提供新的理論基礎和思路。

1 LL-37的結構、分布及表達

1995 年，小分子肽hCAP18首次被發(fā)現(xiàn)。hCAP基因由4個外顯子和3個內含子組成。正常生理狀態(tài)下，細胞中hCAP-18以無活性的前肽形式被合成和儲存，hCAP-18前肽由信號肽、Cathelin保守區(qū)以及C端功能區(qū)組成。細胞受到外界刺激后，hCAP-18由胞內釋放至胞外，并在這一過程中去掉信號肽，成為分子量約18kDa的hCAP-18。后經絲氨酸蛋白酶3作用，Cathelin保守區(qū)也被剪切掉，最終釋放出C端具有活性的小分子的α螺旋多肽[2]。該小分子多肽由37個氨基酸構成，因其N端前兩位為亮氨酸而得名為LL-37。LL-37帶有正電荷，與帶負電荷的分子或結構相互作用，如細菌細胞壁、LPS和遺傳物質。LL-37在人體各器官中均有表達，特別是在呼吸、消化、泌尿、皮膚及口腔等上皮細胞中表達明顯[3]，此外，它在傷口滲出物、汗液、血液中均有表達。研究發(fā)現(xiàn)，白介素6（IL6）、糖皮質激素、腫瘤壞死因子α（TNFα）、丁酸鈉等均可參與調節(jié)LL-37表達[4]。

2 LL-37的生物學功能

（1）抗感染作用，LL-37兼有抗細菌、病毒、真菌的活性。LL37對多種革蘭陽性球菌及陰性桿菌均具有抗菌活性。細胞膜破壞作用是其殺菌的主要作用機制，LL-37與細菌結合后由線性結構變?yōu)槁菪Y構，迅速插入細菌的細胞膜，導致細菌裂解和死亡[5]；此外，LL-37主要抗菌區(qū)域還可直接與DNA相作用；通過TLR-9識別，LL-37可將DNA導入宿主細胞。LL-37可以通過與病毒蛋白衣殼和包膜[4]直接相互作用、阻斷病毒進入宿主細胞或通過抑制病毒基因表達復制來抑制病毒感染。此外，它還能誘導I型干擾素的產生和釋放及樹突狀細胞[6]的成熟，增強病毒dsDNA向位于細胞核附近的toll樣受體的傳遞，從而達到有效的抗病毒作用。LL-37尚具有抗真菌作用，尤其抗白色念珠菌[7]。目前研究發(fā)現(xiàn)LL-37通過以下步驟發(fā)揮作用：與真菌細胞壁相互作用；誘導ROS活性；細胞質膜中通道或孔隙的形成；小于40kDa的分子向外擴散。

（2）抗內毒素作用。脂多糖（LPS）又稱內毒素，在體內，LL-37是唯一能直接中和LPS的AMP。LL-37抑制LPS反應的多種促炎細胞因子的產生，如TNFα、IL1[8]。LL-37抑制LPS誘導的核因子kB活化，它還可以誘導外周血單核細胞激活絲裂原活化蛋白激酶、細胞外信號調節(jié)激酶1/2（ERK1/2）和p38，促進趨化因子的產生。

（3）免疫調節(jié)作用。LL-37可影響免疫系統(tǒng)細胞的趨化和細胞因子釋放。LL-37是中性粒細胞、單核細胞、樹突狀細胞和T細胞的趨化因子。

（4）促進細胞凋亡。在中性粒細胞、T細胞、血管平滑肌細胞、氣道上皮細胞和牙周膜細胞中，LL-37具有促凋亡作用?？赡芡ㄟ^調節(jié)鈣離子內流、中性粒細胞P2X7受體和甲酰肽受體2（FPR2）、抑制膿毒癥這些機制。

（5）促皮膚傷口修復、血管生成。傷口修復的過程大多需要表皮生長因子受體（EGFR）活化介導，而LL-37可以加速G蛋白偶聯(lián)受體反式激活EGFR。LL-37還具有促進血管新生作用，它可以在傷口愈合的部位吸引內皮祖細胞，并誘導其增殖[9]。

（6）參與癌癥發(fā)生發(fā)展。由于LL-37參與增殖、遷移和血管生成等多種細胞生理過程，不加控制的LL-37表達，也可能導致上述過程的異常并促發(fā)癌癥。但實際上在不同腫瘤中LL-37致癌、抑癌作用各不相同，考慮可能與LL-37誘導的膜受體不同組織特異性有關。

3 LL-37與支氣管哮喘

支氣管哮喘是由多種細胞及其所分泌的細胞組分參與的氣道慢性炎癥，包括：肥大細胞、嗜酸粒細胞和T淋巴細胞等。LL-37通過其趨化及免疫調節(jié)作用參與氣道炎癥反應過程。它能夠促進中性粒細胞釋放細胞因子如白細胞介素8（IL-8）等；通過活化巨噬細胞及肥大細胞等引起TNF-α及組胺的生成增多；還作用于嗜酸性粒細胞促進其生成白三烯。IL-8、TNF-α及白三烯等都是哮喘發(fā)病過程中的重要炎性介質[10]。

王璐等[11]等發(fā)現(xiàn)，哮喘患兒LL-37、白三烯水平顯著高于肺炎組及對照組患兒，初步提示LL-37與哮喘的發(fā)生發(fā)展密切相關。王輝等則[12]分析了不同炎癥表型哮喘患者的血漿及痰液上清中LL-37表達。僅在治療后，EOS型哮喘患者與非EOS型哮喘患者血漿及痰液上清LL-37水平均顯著增高，且EOS型哮喘患者高于非EOS型患者。王利玲等[13]研究得到LL-37可作為嗜酸性粒細胞激活肽觸發(fā)炎癥介質的釋放，通過調節(jié)ERK1/2的磷酸化激活細胞質磷脂酶A2（cPLA2）磷酸化，進而引起半胱胺酰白三烯（Cys-LTs）的合成，參與哮喘的發(fā)生發(fā)展，此研究也再次驗證了2013年J.Sun等關于LL-37是種嗜酸性粒細胞激活肽的說法。

4 LL-37與慢性阻塞性肺疾?。–OPD）

LL-37的抗感染作用使得其與COPD急性加重密切相關。此外，LL37還可通過誘導支氣管及肺泡上皮細胞的凋亡，對體內多種細胞（如單核細胞、上皮細胞和樹突細胞等）產生免疫調節(jié)及誘導成纖維細胞增長、膠原合成增加促進氣道纖維化等方面參與COPD的發(fā)生發(fā)展。

M Golec等[14]對COPD患者根據(jù)GOLD分類進行分組，與健康對照相比，早期COPD（GOLD I-II期）無論支氣管肺泡灌洗液（BALF）還是肺泡內襯液（ELF）中LL-37水平均顯著升高，而晚期COPD（GOLD Ⅲ-IV）患者的BALF和ELF中LL-37濃度均顯著降低。Pelin Uysal[15]的研究也得到相似的趨勢，提示血漿LL-37低水平可能是COPD患者加重的預示因素。但是Persson LJ等[16]研究結果卻不盡相同，COPD穩(wěn)定患者的痰中AMP水平高于對照組，隨COPD加重患者痰及血漿LL-37均升高。關于嚴重COPD患者血漿LL-37增高或者降低的不同結論考慮與不同研究選取的患者人群疾病病程不同有關。我們課題組近年來致力于LL-37與COPD氣道重塑的研究。Sun CC等2014年研究發(fā)現(xiàn)[17]，LL-37在上皮細胞中的表達量與氣道壁厚度和膠原沉積呈正相關。同年，Zhang YK等的研究[18]顯示LL-37誘導氣道上皮細胞產生MUC5AC粘蛋白，其中需要TNF-α轉換酶（TACE）-EGFR-ERK1/2途徑和IL-8參與。此外，近期我們還發(fā)現(xiàn)LL-37通過調節(jié)氣道上皮間質轉化參與COPD發(fā)展。

5 LL-37與支氣管擴張

支氣管擴張是一種以支氣管永久性擴張為特征的慢性炎癥性肺病。Cole提出的“惡性循環(huán)模型”是目前廣為接受的發(fā)病模型。氣道內持續(xù)發(fā)生炎癥反應，使支氣管管腔內中性粒細胞募集及支氣管壁和肺組織內中性粒細胞、單核巨噬細胞、CD4+細胞浸潤，這些炎癥細胞釋放多種細胞因子，包括IL-16、IL-8、TNFα等。研究表明，抗菌肽作為一種先天宿主防御機制，在支氣管擴張反復的炎癥過程中可能是無效的，特別是在那些患有嚴重疾病和慢性銅綠假單胞菌感染的支氣管擴張患者中，抗菌肽可能有助于維持炎癥增加的惡性循環(huán)，而不消除細菌感染。以往主要在囊性纖維化中的研究表明，LL-37與DNA和糖胺聚糖在炎癥肺中的相互作用損害了LL-37的抗菌功能及其中和LPS的能力[19]。LL-37能夠增強黏液的產生和促進炎癥，同時失去其抗菌活性。

我國學者在4~5年前就進行過LL-37在支氣管擴張患者中的研究。武莉莉等[20]發(fā)現(xiàn)，隨著血25（OH）D水平的升高，可以上調LL-37的表達，增強免疫應答，有助于患者防御病原微生物和促炎性細胞因子的攻擊。李成偉等[21]研究發(fā)現(xiàn)，支氣管擴張癥患者灌洗液LL-37水平顯著增高，且與支氣管擴張癥嚴重程度具有相關性，提示LL-37參與了支氣管擴張的發(fā)病過程。

其他關于LL-37與支氣管擴張具體機制的研究尚不多，LL-37是否通過抗感染、免疫調節(jié)之外的途徑參與支氣管擴張發(fā)生發(fā)展尚不得而知。

6 LL-37與肺結核

在21世紀之初有較多關于肺結核與LL-37的研究[22]。針對結核分枝桿菌這類特殊細菌，Martineau等人指出LL-37可以抑制結核分枝桿菌的生長，而且這種抑菌作用與LL-37的含量成正比。LL-37除了通過其直接的抑菌作用，還通過TLRs作為宿主反應的啟動子來發(fā)揮抗結核分枝桿菌的作用。2006年Liu等還第一次證實了維生素D通過調控hCAP-18（CAMP）基因表達LL-37進而在液體培養(yǎng)系統(tǒng)中抑制結核分枝桿菌的生長。

Nathella P K等[23]研究發(fā)現(xiàn)，與肺結核（PTB），潛伏期肺結核（LTB）或無肺結核（NTB）患者相比，合并糖尿病的肺結核患者（PTB-DM）循環(huán)cathelicidin水平顯著增高，而且在患有雙側和空洞疾病的PTB-DM或PTB個體cathelicidin的水平顯著增高，此外還顯示出與細菌負荷的顯著正相關。而抗結核療法可顯著降低抗菌肽水平。2020年Dhruva Deshpande等人[24]通過超高分辨率顯微鏡揭示了細胞內結核分枝桿菌與抗菌肽LL-37的直接相互作用。LL-37破壞了細胞內和細胞外結核分枝桿菌的細胞壁，從而殺死病原體。

7 LL-37與肺損傷

急性肺損傷（ALI）是由感染性和非感染性的炎癥刺激因子啟動的細胞內“瀑布式”反應所產生的。抗菌肽LL-37在抗感染、免疫調節(jié)中的突出作用使得其成為當前肺損傷研究的熱點。

Zuo YL等研究發(fā)現(xiàn)[25]，LL-37治療后可阻止線粒體DNA降解誘導的自噬，從而加重膿毒癥相關急性肺損傷的局部炎癥。Qin XC[26]發(fā)現(xiàn)了肽LL-37及其類似物sLL-37可以通過抑制中性粒細胞的滲透和通過FAK，ERK和P38途徑的遷移，減輕敗血癥誘導的急性肺損傷進程。譚丹等[27]研究了百草枯中毒患者及大鼠血清LL37濃度，在發(fā)病早期LL-37即顯著升高，提示其可能是百草枯中毒所致肺部損傷的早期致病因素，且LL-37水平與中毒時間以及肺損傷程度成正比。2020年張群先等[28]研究發(fā)現(xiàn)機械通氣引起的肺損傷會導致抗菌肽LL-37和維生素D受體表達下調，免疫功能紊亂，從而介導或者加重機械通氣肺損傷。

鑒于LL-37在肺部疾病發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮的重要作用，它可能成為診斷及治療上述疾病的重要靶點，但LL-37在這些疾病中的具體分子機制仍需要進一步深入研究。