超聲輔助[C4m im]Br/(NH4)2SO4雙水相提取柿葉中總黃酮

周艷紅

（陜西國際商貿(mào)學(xué)院，陜西 西安712046）

雙水相萃取是利用目標(biāo)物質(zhì)在兩相間的溶解度即分配系數(shù)不同而實(shí)現(xiàn)分離的一種技術(shù)手段，其傳質(zhì)快、試驗(yàn)條件及操作環(huán)境溫和，離子液體[1]是新一代綠色設(shè)計(jì)溶劑,具有優(yōu)異的溶劑化性能，離子液體雙水相[2-6]在萃取方面顯示了良好的應(yīng)用前景。

柿葉中含有豐富的維生素、蘆丁以及鐵、鋅、鈣等對人體健康有益的多功能營養(yǎng)成分，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明柿葉具有清熱解毒、潤肺強(qiáng)心、鎮(zhèn)咳止血、改善血管通透性等多種醫(yī)療保健功能，黃酮作為柿葉的有效成分之一，具有降血糖、抗菌、抗腫瘤、止血、調(diào)血脂、改善微循環(huán)等藥理作用，藥用價(jià)值高，開發(fā)前景樂觀。

目前，國內(nèi)對柿葉中總黃酮[7,8]的研究報(bào)道頗多，但都集中于傳統(tǒng)的有機(jī)溶劑萃取方面。本實(shí)驗(yàn)用離子液體雙水相作為提取劑對柿葉有效部位總黃酮進(jìn)行了提取，效果較好，為柿葉的開發(fā)利用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 材料、試劑與儀器

柿子葉，采摘于陜西省西安市西咸新區(qū)樹葉林。

蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品（含量>98%，批號：100080-201202），中國食品藥品檢定研究院；離子液體，阿拉丁試劑（上海有限公司）；硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉等均為分析純（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

UV-2102PC型紫外可見分光光度計(jì)（上海美譜達(dá)儀器有限公司），KQ-250DE型醫(yī)用數(shù)控超聲波清洗器（昆山超聲儀器有限公司），D5-R2型離心機(jī)（湖南湘儀離心機(jī)儀器有限公司），電子天平（北京賽多利斯天平有限公司），多功能粉碎機(jī)（天津泰斯特儀器有限公司）。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

以蘆丁為標(biāo)準(zhǔn)物，測定510 nm處的吸光度,蘆丁溶液濃度（c）為橫坐標(biāo)，吸光度(A)為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程：Y蘆丁=1.3643X+0.0047(R2=0.9999)。

1.3 柿子葉的預(yù)處理

將柿子葉于60℃烘干至恒重，粉碎，過篩，取干燥后的柿子葉粉若干，加入石油醚，用索氏提取器進(jìn)行脫色處理，然后將得到的柿子葉粉置于陽光下，除去其中的石油醚，裝入密封袋中，備用。

1.4 柿葉中總黃酮含量的測定

向25mL具塞磨口錐形瓶中加入一定質(zhì)量的[C4mim]Br離子液體和(NH4)2SO4，用蒸餾水補(bǔ)充，使整個(gè)離子液體/鹽體系質(zhì)量維持在5 g，混合物充分?jǐn)嚢柚聋}完全溶解后加入一定質(zhì)量的樣品粉末m（g），調(diào)節(jié)pH，在適當(dāng)?shù)臏囟葪l件下萃取一定時(shí)間，參比溶液加入相同（樣品粉末除外）的成分。溶液形成兩相，上相富含離子液體及黃酮，雜質(zhì)留在鹽相中，記錄上層液體的體積（Vt）、下層液體的體積（Vb）。按標(biāo)準(zhǔn)曲線測定方法測上層溶液和下層溶液的吸光度A，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線方程計(jì)算出上相黃酮濃度（Ct）和下相黃酮濃度（Cb）。

相比：R=Vt/Vb

分配系數(shù)：kd=ct/cb

提取率（mg·g-1）=Vt·ct/m

1.5 提取工藝優(yōu)化

在超聲功率為100W的條件下，進(jìn)行單因素實(shí)驗(yàn)，分別考察料液比、提取時(shí)間、提取溫度和離子液體濃度對總黃酮提取率的影響，依據(jù)Box-Behnken中心組合實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，在單因素的基礎(chǔ)上選擇提取時(shí)間（A）、離子液體濃度（B）、提取溫度（C）為考察因素，利用響應(yīng)面法優(yōu)化柿子葉中總黃酮的工藝參數(shù)。

1.6 雙水相體系的確定

同等條件下選取不同碳鏈長度的離子液體[C2mim]Br、[C4mim]Br、[C6mim]Br、[C8mim]Br/(NH4)2SO4雙水相體系提取柿葉中的總黃酮，陽離子碳鏈長度對黃酮類化合物提取量的影響如圖1所示。由圖1可以看出，烷基鏈由乙基增大到丁基，提取量逐漸增大。當(dāng)碳鏈長度繼續(xù)增長，提取量不增反降，因此選取[C4mim]Br/(NH4)2SO4為本實(shí)驗(yàn)的雙水相體系。

圖1 不同離子液體柿葉中總黃酮的提取率

2 結(jié)果與討論

2.1 單因素考察柿葉中總黃酮的提取工藝

2.1.1 離子液體濃度對黃酮提取率的影響

在[C4mim]Br/(NH4)2SO4雙水相體系中，提取時(shí)間為40min，提取溫度為50℃，料液比為1∶20，分別加入濃度為0.5mol/L、0.6mol/L、0.7mol/L、0.8mol/L、0.9mol/L、1.0mol/L的離子液體[C4mim]Br。由圖2可知，當(dāng)[C4mim]Br濃度小于0.7mol/L時(shí)，柿子葉總黃酮提取率和分配系數(shù)隨[C4mim]Br濃度的增加而增大，這主要是因?yàn)閇C4mim]Br與黃酮類化合物之間形成π-π相互作用，并且水與離子液體、總黃酮可形成氫鍵網(wǎng)絡(luò)，在親水極性區(qū)形成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)可以增加總黃酮的親水性，使其在極性區(qū)穩(wěn)定地存在，促進(jìn)了總黃酮在兩相間的轉(zhuǎn)移；當(dāng)濃度等于0.7mol/L時(shí)，柿子葉總黃酮和分配系數(shù)達(dá)到最大，說明有更多的黃酮富集在離子液體中；離子液體大于0.7mol/L時(shí)，柿子葉總黃酮和分配系數(shù)隨濃度增加而減小，因?yàn)楫?dāng)離子液體濃度過大時(shí)，體積排阻效應(yīng)增大導(dǎo)致總黃酮在相間的傳遞以及在相中的擴(kuò)散阻力大大增加，阻礙了總黃酮進(jìn)入離子液體相，分配系數(shù)、提取率逐漸降低。所以離子液體[C4mim]Br最佳濃度為0.7mol/L。

圖2 離子液體濃度對分配系數(shù)和黃酮提取率的影響

2.1.2 提取溫度對總黃酮提取率的影響

在[C4mim]Br/(NH4)2SO4雙水相體系中，提取時(shí)間為40min，料液比為1∶20，離子液體濃度為0.7mol/L，選 取 提 取 溫 度 為40℃、50℃、60℃、70℃、80℃、90℃。由圖3可知，當(dāng)體系溫度低于60℃時(shí)，柿葉總黃酮的分配系數(shù)和提取率隨溫度升高而逐漸增大，其原因是溫度升高，上相離子液體中富集的黃酮含量增多；溫度大于60℃時(shí)，柿葉總黃酮的分配系數(shù)和提取率隨溫度的升高逐漸減小，主要是因?yàn)闇囟冗^高會導(dǎo)致黃酮分解，同時(shí)溫度過高會使硫酸銨分解，鹽析能力降低，離子液體與黃酮的相互作用力減小，使上相離子液體相中黃酮含量不再增多甚至因分解而減小，導(dǎo)致分配系數(shù)和提取率減小。所以綜合考慮，選擇最佳的提取溫度為60℃。

圖3 提取溫度對分配系數(shù)和黃酮提取率的影響

2.1.3 提取時(shí)間對總黃酮提取率的影響

在[C4mim]Br/(NH4)2SO4雙水相體系中，提取溫度為60℃，料液比為1∶20，離子液體濃度為0.7mol/L，選取提取時(shí)間為30min、40min、50min、60min、70min、80min。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4所示：分配系數(shù)和提取率隨著提取時(shí)間的增加而逐漸增大，主要是因?yàn)樯舷嚯x子液體富集的黃酮含量隨著時(shí)間的增加而增大。當(dāng)提取時(shí)間大于50min時(shí)，分配系數(shù)和總黃酮提取率減小，推測主要是因?yàn)辄S酮在長時(shí)間機(jī)械效應(yīng)和熱效應(yīng)下不穩(wěn)定，發(fā)生分解或轉(zhuǎn)化為其他物質(zhì)，導(dǎo)致提取量降低。確定50min為最適宜超聲時(shí)間。

圖4 提取時(shí)間對分配系數(shù)和黃酮提取率的影響

2.1.4 料液比對總黃酮提取率的影響

在[C4mim]Br/(NH4)2SO4雙水相體系中，提取溫度為60℃，提取時(shí)間為50min，離子液體濃度為0.7mol/L，選取料液比為：1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖5所示，分配系數(shù)和提取率隨料液比增加而增大，在1∶25時(shí)最大.隨后逐漸減小，主要是因?yàn)榱弦罕却笥?∶25時(shí)，柿子葉粉質(zhì)量較大，不利于柿子葉粉的溶解和擴(kuò)散，溶劑中黃酮類物質(zhì)的溶出受到影響，而料液比小于1∶25時(shí)，總黃酮已基本完全溶出，因此提取量不再增加，且會增加濃縮成本，導(dǎo)致提取量降低，確定料液比最佳條件為1∶25。

圖5 料液比對分配系數(shù)和黃酮提取率的影響

2.2 響應(yīng)面法實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.1 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果及方差分析

在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取離子液體濃度（A）、提取時(shí)間（B）和提取溫度（C）等3因素按照Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)方案進(jìn)行優(yōu)化試驗(yàn)[9,10]，結(jié)果如表1及表2所示。

表1 星點(diǎn)設(shè)計(jì)因素與水平

表2 響應(yīng)面試驗(yàn)以及響應(yīng)值

對表2中數(shù)據(jù)進(jìn)行回歸擬合，獲得擬合方程為Y=26.63-0.00875A+0.00375B+0.43C+0.23AB-0.34AC+0.29BC-0.72A2-0.68B2-0.58C2對回歸方程進(jìn)行方差分析。由表3可以看出，試驗(yàn)回歸模型P＜0.01，說明回歸模型達(dá)到高度顯著水平；失擬項(xiàng)P=0.2803＞0.05，失擬項(xiàng)不顯著，說明試驗(yàn)數(shù)據(jù)與模型擬合良好。該模型擬合的最佳提取工藝為離子液體濃度為0.7mol/L，超聲時(shí)間為50.00 min，超聲溫度為60℃，在該條件下預(yù)測總黃酮提取量可以達(dá)到26.62 mg/g，A2，B2，C2的P值均小于0.05，說明提取時(shí)間、提取濃度、提取溫度對柿子葉中總黃酮的提取量有很大的影響。

表3 響應(yīng)面方差分析表

2.2.2 響應(yīng)面分析

根據(jù)Box-Behnken軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)并獲得響應(yīng)模型，保持三個(gè)變量因素中的一個(gè)不改變，得到離子液體濃度、提取時(shí)間、體系溫度之間其他兩個(gè)因素之間的三維響應(yīng)面曲線和輪廓曲線，所得結(jié)果見圖6（a）、6（b）和6（c）。根據(jù)Box-Behnken軟件模型所得的結(jié)果和統(tǒng)計(jì)學(xué)進(jìn)行方差分析（ANOVA）獲得離子液體雙水相各個(gè)因素的最佳組合條件為濃度為0.7mol/L，超聲時(shí)間為50min，超聲溫度為60℃，黃酮提取量可以達(dá)到26.62mg/g。

圖6 響應(yīng)模型

2.2.3 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

為驗(yàn)證該擬合模型的可靠性，同時(shí)為了試驗(yàn)操作實(shí)施的便利，在離子液體濃度為0.7mol/L、超聲時(shí)間50min、超聲溫度60℃條件下，固定其他各因素不變，進(jìn)行3次平行試驗(yàn)。結(jié)果在該工藝條件下，柿子葉總黃酮提取量為26.84mg/g，與預(yù)測值之間相差較小，說明該模型能夠很好地?cái)M合柿子葉總黃酮的提取過程，優(yōu)化得到的最佳提取條件參數(shù)可靠性較好。

2.2.4 對比實(shí)驗(yàn)

分別以同濃度乙醇、離子液體、離子液體/(NH4)2SO4體系提取柿葉中的黃酮，時(shí)間為50min，溫度為40℃，料液比為1∶10，從表4可以看出雙水相體系的提取率最高。

表4 三種提取劑的對比研究

2.2.5 柿葉總黃酮抗自由基實(shí)驗(yàn)結(jié)果

對柿葉中總黃酮及Vc對DPPH自由基、羥自由基以及超氧自由基的清除能力進(jìn)行了研究[11]，結(jié)果如表5。結(jié)果表明柿葉總黃酮具有較高的清除DPPH自由基和羥自由基的能力，對DPPH自由基的清除率達(dá)到86%，略高于同濃度的Vc。對羥自由基的清除率達(dá)到68%，高于同濃度的Vc，而對超氧自由基清除能力低于Vc，清除率只有30%，比同濃度的Vc低了10%。

表5 對自由基的清除實(shí)驗(yàn)結(jié)果

3 結(jié)論

本文采用超聲輔助[C4mim]Br/(NH4)2SO4雙水相提取柿葉中的總黃酮，確定離子液體的種類，離子液體的濃度，超聲提取時(shí)間、溫度和液固比值為影響提取率的因素，并優(yōu)化了提取條件。離子液體提取黃酮類化合物的最佳條件為：離子液體種類為[C4mim]Br，離子液體濃度為0.7mol/L，提取時(shí)間為50分鐘，提取溫度為60℃，液固比為1∶25。此時(shí)提取黃酮類化合物的效率最高。與無水乙醇作為提取劑提取柿葉中的黃酮的方法相比，具有特殊結(jié)構(gòu)性質(zhì)的離子液體能夠更好地溶解出柿葉中的黃酮類物質(zhì)，優(yōu)化的工藝為工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)提供了參考數(shù)據(jù)。