鰻魚(yú)中氯霉素?zé)晒饷庖邔游隹焖贆z測(cè)方法研究

湯軼偉，崔芷萌，劉 歡，呂長(zhǎng)鑫，劉秀英，鐘克利，湯立軍

（1.渤海大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，遼寧錦州121013；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科技學(xué)院，河北保定071000；3.渤海大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，遼寧錦州121013）

0 引言

氯霉素（CAP）是一種酰胺醇類抗生素，白色細(xì)針或片狀結(jié)晶，易溶于甲醇、乙醇等有機(jī)溶劑.該藥物通過(guò)與細(xì)菌核糖核蛋白體50S亞基的可逆結(jié)合，抑制蛋白合成，實(shí)現(xiàn)對(duì)肺炎球菌、鏈球菌、李斯特菌、痢疾桿菌等細(xì)菌的廣譜抑制［1］.20世紀(jì)80年代，我國(guó)將氯霉素開(kāi)始用于水產(chǎn)養(yǎng)殖過(guò)程中細(xì)菌性疾病的防治.近年來(lái)，研究證明氯霉素對(duì)人體具有較大的潛在危害，如抑制骨髓造血功能、損傷神經(jīng)系統(tǒng)引發(fā)失眠、幻覺(jué)、狂躁等癥狀［2］.中國(guó)、美國(guó)、韓國(guó)、日本等多個(gè)國(guó)家規(guī)定水產(chǎn)品中不得檢出氯霉素［3，4］.鰻魚(yú)魚(yú)肉富含蛋白、脂肪、維生素，二十碳五烯酸（EPA）、二十二碳六烯酸（DHA）等營(yíng)養(yǎng)成分，是我國(guó)主要的出魚(yú)種之一，具有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值［5］.所以，為保證鰻魚(yú)及其制品質(zhì)量安全，建立快速、靈敏、便捷的氯霉素檢測(cè)方法具有重要意義.

目前，微生物檢測(cè)法［6，7］、高效液相色譜法［8，9］、氣相色譜法［10，11］、色譜-質(zhì)譜聯(lián)用方法［12，13］、酶聯(lián)免疫法［14，15］、膠體金免疫層析法［16，17］、電化學(xué)檢測(cè)法［18-21］、熒光檢測(cè)方法［22］等技術(shù)已廣泛用于食品中氯霉素殘留檢測(cè).其中，傳統(tǒng)儀器檢測(cè)方法操作繁瑣，檢測(cè)成本高，難以滿足快速、簡(jiǎn)便和現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)需求［23］.免疫層析技術(shù)具有檢測(cè)成本低、操作簡(jiǎn)便、結(jié)果判斷直觀等優(yōu)點(diǎn)，已成為當(dāng)前食品安全快速篩查和檢測(cè)的主要方法［24-26］.本論文以氯霉素單克隆抗體為分子識(shí)別元件，以量子點(diǎn)為標(biāo)記物構(gòu)建了氯霉素?zé)晒饷庖邔游鲈嚰?，并建立了鰻魚(yú)檢測(cè)中氯霉素殘留的檢測(cè)方法，為豐富鰻魚(yú)中氯霉素殘留快速檢測(cè)提供了技術(shù)支撐.

1 材料與方法

1.1 試劑

七水硫酸鋅（99%）、無(wú)水氯化錳（98%）、硫化鈉（95%）、谷胱甘肽（GSH，98%）、氫氧化鈉（96%）、1-（3-二甲氨基丙基）-3-乙基碳二亞胺（EDC，98%）、N-羥基琥珀酰亞胺（NHS，98%）、無(wú)水乙醇（95%）購(gòu)于阿拉丁試劑公司；氯霉素單克隆抗體、氯霉素包被原、羊抗鼠二抗購(gòu)于山東藍(lán)都生物有限公司；玻纖8964、玻纖GF-08、玻纖KB-50、玻纖CF-50、Millipore90硝酸纖維素膜、Satorius140硝酸纖維素膜、Pall170硝酸纖維素膜、吸水紙H-1購(gòu)于上海捷寧生物科技有限公司.

1.2 儀器與設(shè)備

DZF真空干燥箱（北京科偉永興儀器有限公司）；ZF-7型暗箱三用紫外分析儀（上海勤科分析儀器有限公司）；XIR冷凍離心機(jī)（美國(guó)Themo公司）；SK6210HP超聲波清洗器（上?？茖?dǎo)超聲儀器有限公司）；HM3010單維平面點(diǎn)膜噴金儀（上海金標(biāo)生物科技有限公司）；Vector 22傅里葉變換紅外光譜儀（布魯克儀器公司）；UItima-IV X-射線粉末衍射儀（日本理學(xué)公司）；F-7000熒光分光光度計(jì)（日立高新技術(shù)公司）.

1.3 GSH-Mn-ZnS 量子點(diǎn)（QD）制備

取2.5 mL 0.1 mol/L ZnSO4、1 mL 0.01 mol/L MnCl2、5 mL 0.1 mol/L GSH和41.5 mL超純水于50 mL三口燒瓶中，混合均勻后用1 mol/L的NaOH溶液將pH值調(diào)至11.室溫條件，氮?dú)獗Ｗo(hù)下磁力攪拌30 min后，將0.25 mmol的Na2S快速加入溶液，反應(yīng)20 min后，將溶液溫度升至60℃，老化2 h.待溶液溫度降至室溫后，加入相同體積的乙醇使量子點(diǎn)沉淀，在12000 rpm下離心10 min，去除上清液，所得量子點(diǎn)于真空干燥箱中干燥，于4℃冰箱保存?zhèn)溆?[27]

1.4 Mn-ZnS QD-CAP 抗體偶聯(lián)物制備

取500 μL Mn-ZnS QD（1.0 mg/mL）和500 μL磷酸鹽緩沖液（0.01 M，pH=7.4）于棕色反應(yīng)瓶中，加入300 μL EDC溶液（0.6 mg/mL）和300 μL NHS溶液（0.5 mg/mL）充分混合后迅速將反應(yīng)超聲分散30 min，然后加入500 μL CAP單克隆抗體（0.1 mg/mL），在室溫下磁力攪拌90 min后得到Mn-ZnS QD-CAP偶聯(lián)物，于4℃保存?zhèn)溆?[28]

1.5 熒光免疫層析試紙條組裝

用劃膜儀分別將包被原與羊抗鼠二抗固定于硝酸纖維素膜上作為檢測(cè)線（T線）和質(zhì)控線（C線），干燥后，在PVC背板上依次粘貼硝酸纖維素膜、釋放墊、吸收墊和樣品墊（圖1）.

1.6 靈敏度

將濃度為1.0 mg/mL的CAP貯備液用0.05%吐溫20-磷酸鹽緩沖液（PBST）分別稀釋成100、150、500、1000 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)系列溶液，將系列標(biāo)準(zhǔn)溶液和量子點(diǎn)標(biāo)記抗體溶液混合后取200 μL樣本墊上，15 min后在365 nm紫外光下觀察T線、C線的熒光強(qiáng)度.

1.7 特異性

分別選用氧氟沙星、諾氟沙星、洛美沙星、培氟沙星和加替沙星5種抗生素來(lái)進(jìn)行特異性實(shí)驗(yàn)，用PBST緩沖液將此5種藥物稀釋成濃度為1000 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行試紙條的特異性實(shí)驗(yàn).

1.8 實(shí)際樣品檢測(cè)

稱取5 g添加了氯霉素標(biāo)品的鰻魚(yú)肌肉樣品（450 ng/g）于50 mL離心管中，均質(zhì)后加入20 mL乙酸乙酯提取氯霉素，渦旋20 min后于4000 rpm離心5 min，將乙酸乙酯層轉(zhuǎn)移到100 mL圓底燒瓶中.提取2次，合并的乙酸乙酯提取液于40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)干燥.向懸干的圓底燒瓶?jī)?nèi)加1 mL甲醇、15 mL正己烷和25 mL 4%的氯化鈉溶液復(fù)溶殘留物，震蕩混勻1 min，在5000 rpm下離心5 min，除去正己烷層，再加入15 mL乙酸乙酯，渦旋2 min，5000 rpm離心5 min，吸取乙酸乙酯層，將其旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)（45℃，10 min），蒸干后加入1 mL無(wú)水乙醇復(fù)溶，再加入4 mL PBST后，進(jìn)行免疫層析檢測(cè).

2 結(jié)果與討論

2.1 GSH-Mn-ZnS QD 的表征

通過(guò)高分辨透射電鏡對(duì)制備的GSH-Mn-ZnS QD形貌結(jié)構(gòu)進(jìn)行了表征.如圖2A所示，GSH-Mn-ZnS QD分散性好，粒徑分布均一，約4.5 nm，適合用于構(gòu)建熒光免疫層析試紙條.紅外光譜圖（圖2B）中1637 cm-1和1938 cm-1光譜峰分別為C=O和C-N振動(dòng)吸收峰，3415 cm-1為-OH振動(dòng)吸收峰.該結(jié)果表明制備的量子點(diǎn)表面有豐富的氨基和羧基，為共價(jià)鍵法標(biāo)記抗體提供了化學(xué)基團(tuán).

2.2 量子點(diǎn)標(biāo)記CAP 抗體表征

量子點(diǎn)標(biāo)記CAP抗體是熒光免疫層析試紙構(gòu)建及檢測(cè)方法建立的關(guān)鍵.量子點(diǎn)標(biāo)記抗體前后紫外吸收光譜如圖3所示，量子點(diǎn)標(biāo)記抗體前在295 nm左右出現(xiàn)吸收肩峰，偶聯(lián)抗體后肩峰出現(xiàn)紅移現(xiàn)象，這可能是偶聯(lián)抗體后量子點(diǎn)粒徑微小變化造成的.分別吸取一定量的量子點(diǎn)和標(biāo)記抗體后量子點(diǎn)于試紙條樣品墊，15 min后偶聯(lián)抗體的量子點(diǎn)分別在試紙條的T線和C線出現(xiàn)了熒光條帶，這是由于偶聯(lián)在量子上的CAP抗體與T線的包被原及C線的二抗特異性結(jié)合的結(jié)果.量子點(diǎn)標(biāo)記抗體前后的紫外吸收光譜及試紙條驗(yàn)證結(jié)果表明，CAP抗體與量子點(diǎn)偶聯(lián)成功.

2.3 樣品墊和NC 膜優(yōu)化

不同類型樣品墊和NC膜對(duì)量子點(diǎn)熒光免疫層析試紙條的性能影響較大.實(shí)驗(yàn)優(yōu)化了不同樣品墊和NC膜對(duì)試紙條T線和C線熒光強(qiáng)度的影響.圖4A表明，玻纖GF-08和玻纖KB-50樣本墊試紙條的T線、C線熒光強(qiáng)度接近，然而GF-08的層析速度較快.Millipore90、Satorius140和Pall170 NC膜實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖4B所示，Pall170 NC膜層析速度快，且T線、C線的熒光強(qiáng)度較強(qiáng).所以，本實(shí)驗(yàn)玻纖GF-08樣本墊和Pall170 NC膜組裝試紙條.

2.4 包被原和二抗包被濃度優(yōu)化

包被原包被于T線的濃度與二抗包被于C線的濃度對(duì)試紙條靈敏度影響較大.包被原包被量?jī)?yōu)化結(jié)果如圖5A所示，當(dāng)包被原在T線的包被量為1.0 ng/mL時(shí)熒光強(qiáng)度強(qiáng)，包被量為1.2 ng/mL時(shí)熒光強(qiáng)度變化不大.圖5B為二抗包被量?jī)?yōu)化結(jié)果，當(dāng)二抗包被量為1.0 ng/mL時(shí)，試紙條C線熒光強(qiáng)度強(qiáng)，可滿足檢測(cè)要求.所以，本實(shí)驗(yàn)確定包被原和二抗分別在T線和C線的濃度為1.0 ng/mL.

2.5 熒光免疫層析試紙檢測(cè)限

不同濃度氯霉素量子點(diǎn)熒光免疫層析試紙檢測(cè)結(jié)果如圖6所示，當(dāng)氯霉素濃度為100 ng/mL時(shí)試紙條T線熒光強(qiáng)度與空白有明顯差別，為目測(cè)判斷濃度；當(dāng)氯霉素濃度為150 ng/mL時(shí)T線熒光消失.所以，基于GSH-Mn-ZnS量子點(diǎn)標(biāo)記抗體構(gòu)建的氯霉素?zé)晒庠嚰垪l的目測(cè)檢測(cè)限為100 ng/mL，消線濃度為150 ng/mL.

2.6 特異性

以10倍氯霉素目測(cè)濃度的氧氟沙星、諾氟沙星、洛美沙星、培氟沙星和加替沙星用于量子點(diǎn)熒光免疫試紙條的特異性.檢測(cè)結(jié)果如7所示，可見(jiàn)該濃度下所測(cè)藥物均為陰性結(jié)果，表明制備的氯霉素?zé)晒饷庖邔游鲈嚰垪l有較好的特異性.

2.7 樣品檢測(cè)

為評(píng)估量子點(diǎn)熒光試紙條對(duì)鰻魚(yú)樣品中氯霉素殘留的檢測(cè)性能，進(jìn)行了添加回收實(shí)驗(yàn).圖8為鰻魚(yú)樣品添加濃度為450 ng/g時(shí)的檢測(cè)結(jié)果，可見(jiàn)試紙條T線的熒光強(qiáng)度較空白有明顯降低.該結(jié)果表明，本實(shí)驗(yàn)構(gòu)建的熒光免疫層析試紙條可用于鰻魚(yú)樣品中氯霉殘留檢測(cè).

國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 22959-2008規(guī)定了鰻魚(yú)中氯霉素殘留的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法檢測(cè)方法［29］，檢出限為0.1 μg/kg，該方法靈敏度高，所需檢測(cè)儀器昂貴，不能滿足現(xiàn)場(chǎng)快速篩查的需要.基于氯霉素的廣譜抗菌特性，宋杰等［30］建立了微生物法檢測(cè)牛奶中氯霉素殘留方法，該方法操作簡(jiǎn)單，速度快，但多用于氯霉素殘留的定性檢測(cè).膠體金是目前免疫層析試紙條常用的標(biāo)記物［17］，與膠體金標(biāo)記相比，熒光標(biāo)記免疫層析試紙條的抗干擾能力，靈敏度、穩(wěn)定性有明顯提高［31］.

3 結(jié)論

本實(shí)驗(yàn)制備的GSH-Mn-ZnS量子點(diǎn)分散性好，粒徑約4.5 nm，表面含氨基和羧基，適合與氯霉素單克隆抗體進(jìn)行偶聯(lián)，制備Mn-ZnS QD抗體熒光免疫探針.以玻纖GF-08，Pall170 NC膜，包被濃度為1.0 ng/mL構(gòu)建的熒光免疫層析試紙條靈敏度高、特異性好，檢測(cè)速度快，可用于鰻魚(yú)中氯霉素殘留的快速檢測(cè).

隨著納米技術(shù)的發(fā)展，越來(lái)越多的熒光標(biāo)記物被設(shè)計(jì)合成，極大促進(jìn)了熒光免疫層析檢測(cè)方法的發(fā)展，與對(duì)應(yīng)的熒光試紙條讀取儀配合建立現(xiàn)場(chǎng)快速定量熒光檢測(cè)方法，符合該技術(shù)發(fā)展趨勢(shì)，適用于基層對(duì)食品安全快速檢測(cè)的應(yīng)用.