基于UPLC指紋圖譜和多成分定量的辛夷藥材產地差異性研究

李振雨，何嘉瑩，童培珍，魏 梅，孫冬梅，鄧淙友，陳向東

基于UPLC指紋圖譜和多成分定量的辛夷藥材產地差異性研究

李振雨，何嘉瑩，童培珍，魏 梅，孫冬梅，鄧淙友，陳向東*

廣東一方制藥有限公司，廣東省中藥配方顆粒企業(yè)重點實驗室，廣東 佛山 528244

采用超高效液相色譜（UPLC）法建立辛夷花藥材指紋圖譜，并同時測定3種有效成分的含量，評價不同產地辛夷藥材質量的差異。采用UPLC法進行測定，色譜柱為YMC Triart C18（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流動相為乙腈-0.1%磷酸溶液，梯度洗脫，體積流量為0.3 mL/min，波長為230 nm，柱溫為30 ℃，進樣量為1 μL；建立15批辛夷藥材指紋圖譜，通過對照品比對，對共有峰進行指認，并對3種有效成分的含量進行測定；對15批辛夷藥材指紋圖譜進行相似度評價、聚類分析（HCA）和主成分分析（PCA），并利用正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA）尋找不同產地辛夷藥材的差異性成分。辛夷藥材指紋圖譜有10個共有峰，指認出其中3個峰，分別為松脂素二甲醚、木蘭脂素和木蘭花堿；湖北、四川與河南產區(qū)藥材的相似度為0.585～0.793；HCA和PCA分析將15批辛夷藥材劃分為3類，分別對應3個不同的產區(qū)，OPLS-DA法確定7個差異標志物，差異顯著性排序為木蘭脂素＞峰4＞松脂素二甲醚＞峰3＞峰8＞峰9＞峰10。河南產區(qū)辛夷木蘭脂素和松脂素二甲醚含量最高，湖北產區(qū)辛夷木蘭花堿含量最高。該方法能有效地分析不同產地辛夷藥材質量的差異性，為不同產地辛夷藥材質量的評價提供參考。

辛夷；UPLC指紋圖譜；多成分定量；差異標志物；木蘭脂素；松脂素二甲醚

辛夷為木蘭科植物望春花Pamp.、玉蘭Desr.或武當玉蘭Pamp.的干燥花蕾，具有散風寒、通鼻竅的作用，用于治療風寒頭痛、鼻塞流涕、鼻鼽、鼻淵[1]。歷代本草都有關于辛夷的記載，《神農本草經》將其列為上品?，F(xiàn)代化學和藥理學研究表明，辛夷主要含揮發(fā)油、木脂素、黃酮、生物堿等多種有效成分，具有抗炎、抗過敏、降壓、興奮子宮等藥理作用，臨床上多用于治療鼻炎及鼻竇炎[2-5]。目前，辛夷藥材的質量評價多集中在對揮發(fā)油和木脂素類成分的測定上[6-8]，對一些水溶性較大的有效成分研究較少。中藥成分復雜，針對不同的疾病，發(fā)揮作用的有效成分不同，本實驗以超高效液相色譜法（UPLC）指紋圖譜結合多成分定量，增加對水溶性生物堿的測定，分析不同產地辛夷藥材的質量差異，為不同產地辛夷藥材的質量評價提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters H-Class型超高效液相色譜儀（美國沃特世公司）；YMC Triart C18色譜柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm，日本YMC公司），萬分之一天平（ME204E，梅特勒-托利多公司）；百萬分之一天平（XP26，梅特勒-托利多公司）；JJ600型百分之一天平（常熟市雙杰測試儀器廠）；KQ500D型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HWS28型恒溫水浴鍋（上海一恒科技有限公司）；超純水系統(tǒng)（Milli-Q級，德國默克股份有限公司）。

1.2 試劑與試藥

除液相用甲醇、乙腈（默克股份有限公司），磷酸（天津市科密歐化學試劑有限公司）為色譜級，其余試劑皆為分析純。對照品木蘭脂素（批號110882-201708，質量分數(shù)為96.5%，中國食品藥品檢定研究院）；木蘭花堿（批號wkq17063003，質量分數(shù)為98.0%，四川維克奇生物科技有限公司）；松脂素二甲醚（批號1506434，質量分數(shù)為100.0%，伊普賽諾公司）；辛夷對照藥材（批號121079-200704，中國食品藥品檢定研究院）；15批辛夷藥材經廣東一方制藥有限公司魏梅主任藥師鑒定均為木蘭科植物望春花Pamp. 的干燥花蕾，經檢驗，均符合《中國藥典》2015年版的規(guī)定，藥材信息見表1。

表1 15批辛夷藥材來源信息

2 方法與結果

2.1 辛夷藥材UPLC指紋圖譜的建立

2.1.1 色譜條件 色譜柱：YMC Triart C18（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流動相為乙腈（A）-0.1%磷酸溶液（B）；梯度洗脫（0～15 min，10%～15% A；15～25 min，15%～38% A；25～35 min，38%～44% A；35～39 min，44%～100% A；39～40 min，100% A），體積流量0.30 mL/min；檢測波長為230 nm；柱溫為30 ℃；進樣量為1 μL。

2.1.2 對照品溶液的制備 取松脂素二甲醚、木蘭脂素和木蘭花堿對照品適量，加50%乙醇制成含松脂素二甲醚50 μg/mL、木蘭脂素80 μg/mL、木蘭花堿100 μg/mL的混合對照品溶液。

2.1.3 對照藥材參照物溶液的制備 取辛夷對照藥材約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇50 mL，稱定質量，超聲處理（功率300 W，頻率40 kHz）45 min，放冷，再稱定質量，用50%乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.4 供試品溶液的制備 取辛夷藥材粉末（過二號篩）約0.2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入50%乙醇50 mL，稱定質量，超聲處理（功率300 W、頻率40 kHz）45 min，放冷，再稱定質量，用50%乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.5 精密度試驗 取辛夷藥材（批號G1703182）供試品溶液，按“2.1.1”項下確定的色譜條件連續(xù)進樣6次，檢測指紋圖譜，以木蘭脂素色譜峰為參照峰（S），計算各共有指紋峰與參照峰的相對保留時間和相對峰面積RSD值均小于3.0%，表明儀器精密度良好。

2.1.6 重復性試驗 取同一批次的辛夷藥材粉末（批號G1703182）共計6份，按“2.1.4”項下確定的供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液，分別進樣測定，檢測指紋圖譜，以木蘭脂素色譜峰為參照峰，計算各共有指紋峰與參照峰的相對保留時間和相對峰面積RSD值均小于3.0%，表明該方法重復性良好。

2.1.7 穩(wěn)定性試驗 取辛夷藥材（批號G1703182）供試品溶液，分別在0、2、4、6、8、12、24 h進樣分析，檢測指紋圖譜，以木蘭脂素色譜峰為參照峰，計算各共有指紋峰與參照峰的相對保留時間和相對峰面積RSD值均小于3.0%，說明供試品溶液在24 h內穩(wěn)定性良好。

2.1.8 指紋圖譜的建立及共有峰標定 取15批辛夷藥材樣品，按“2.1.4”項下確定的供試品溶液制備方法制備供試品溶液，另取辛夷對照藥材，按“2.1.3”項下方法制備對照藥材參照物溶液，分別按“2.1.1”項下確定的色譜條件，進樣測定，記錄各樣品的色譜圖，并導出指紋圖譜，將15批辛夷藥材指紋圖譜導入“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”軟件中，以編號為S1樣品（批號G1703052）的指紋圖譜為參照圖譜，以2號峰為Mark峰進行保留時間校正，同時進行全峰匹配，15批辛夷藥材指紋圖譜疊加圖見圖1，以平均數(shù)法生成辛夷藥材對照指紋圖譜，見圖2。查閱相關文獻報道[9]，以及與對照品的保留時間進行比對，并結合紫外吸收光譜圖，確定峰2為木蘭花堿，峰5為松脂素二甲醚，峰6為木蘭脂素。由于木蘭脂素為辛夷的主要有效成分之一，對照品易得，并且該成分色譜峰面積最大，分離度較好，因此選擇木蘭脂素色譜峰為參照峰，標定出10個共有指紋峰，計算各指紋峰的相對保留時間和相對峰面積，各指紋峰的相對保留時間RSD值在0.05%～1.39%，相對峰面積RSD值在14.86%～107.18%，結果見表2、3。以辛夷對照藥材為參照，辛夷藥材樣品指紋圖譜的10個共有指紋峰與對照藥材色譜中相應的色譜峰能夠一一對應，說明15批辛夷藥材與對照藥材基原的一致性，10個共有指紋峰能很好地表征辛夷藥材的特征。

2.1.9 相似度評價 采用“中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)”計算15批辛夷藥材指紋圖譜的相似度（表4），結果顯示，以省劃分產區(qū)，同一產區(qū)的辛夷藥材指紋圖譜的相似度值均大于0.90，不同的產區(qū)的四川和湖北2地采集的辛夷藥材，指紋圖譜的相似度也大于0.90，但與河南產區(qū)藥材的相似度只有0.585～0.793，說明四川、湖北的辛夷藥材在化學成分上與河南存在較大的差異。

2-木蘭花堿 5-松脂素二甲醚 6-木蘭脂素

2-木蘭花堿 5-松脂素二甲醚 6-木蘭脂素

2.1.10 聚類分析 使用SPSS 20.0軟件，以10個共有指紋峰的峰面積為變量，采用Z得分法進行數(shù)據(jù)標準化處理，以組間聯(lián)接法進行系統(tǒng)聚類，結果見圖3，15批辛夷藥材被聚成3類，湖北、四川和河南3個產區(qū)的辛夷藥材各自聚為一類，分類結果明顯與藥材產地密切相關，聚類分析的結果與指紋圖譜的相似度計算結果相似。

2.1.11 主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘法-判別分析（OPLS-DA） 采用SIMCA14.1軟件，以10個共有指紋峰峰面積積分值為變量進行PCA，共生成5個主成分，累積貢獻率達到99.5%，其中前2個主成分累積貢獻率達到81.2%，Q2為0.919，證明模型有效。以PCA得分和峰面積變量得到Scores圖和Loading圖（圖4、5），結果顯示，湖北、四川和河南3個產區(qū)的藥材分別聚集在3個不同的區(qū)域，得到較好地區(qū)分，說明不同產地辛夷藥材化學成分具有較大差異。根據(jù)變量離原點的距離判斷變量對主成分的影響權重，距離原點越遠，變量對主成分的影響權重越大，分析變量對主成分1的影響權重大小依次為峰4、9、8、木蘭脂素和松脂素二甲醚，變量對主成分2的影響權重大小依次為峰10、1、3。根據(jù)PCA分析結果，將湖北、四川和河南3個產區(qū)的藥材分3組，以10個共有指紋峰峰面積積分值為變量進行OPLS-DA分析，得到10個變量的VIP圖（圖6），以VIP＞1.0為顯著影響，共找到7個差異標志物，對其影響顯著性排序，分別為木蘭脂素＞峰4＞松脂素二甲醚＞峰3＞峰8＞峰9＞峰10，說明不同產區(qū)的辛夷藥材木蘭脂素和松脂素二甲醚的含量存在顯著差異。

表2 15批辛夷藥材指紋圖譜共有峰的相對保留時間

表3 15批辛夷藥材指紋圖譜共有峰的相對峰面積

表4 15批辛夷藥材相似度

圖3 系統(tǒng)聚類樹狀圖

圖4 15批辛夷藥材Scores圖

圖5 辛夷藥材色譜峰變量Loading圖

圖6 辛夷藥材VIP圖

2.2 有效成分的測定

2.2.1 線性關系考察 取松脂素二甲醚、木蘭脂素及木蘭花堿對照品適量，精密稱定，加50%乙醇制成含對照品松脂素二甲醚1 010.54 μg/mL，木蘭脂素1 439.281 μg/mL，木蘭花堿739.753 μg/mL的混合對照品儲備液。精密移取混合對照品儲備液0.1、0.2、0.5、1.5、2.5、5.0 mL，分別置10 mL量瓶中，加50%乙醇至刻度，搖勻，得到分別含松脂素二甲醚10.105、20.211、50.527、151.581、252.635、505.270 μg/mL，木蘭脂素14.393、28.786、57.571、143.928、431.784、719.641 μg/mL、木蘭花堿7.398、14.795、36.988、110.963、184.938、369.877 μg/mL的系列對照品溶液，分別精密吸取上述6個不同質量濃度的對照品溶液各1 μL，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，以色譜峰峰面積為縱坐標（），對照品質量濃度為橫坐標（）進行線性回歸，繪制標準曲線，3種成分的線性回歸方程和線性范圍見表5。

2.2.2 精密度試驗 取“2.1.4”項下供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜方法連續(xù)進樣6次，記錄松脂素二甲醚、木蘭脂素和木蘭花堿的峰面積，并計算松脂素二甲醚、木蘭脂素和木蘭花堿峰面積RSD值分別為0.57%、0.68%、0.29%，結果表明儀器精密度良好。

表5 3種成分的線性回歸方程及線性范圍

2.2.3 穩(wěn)定性試驗 取“2.1.4”項下供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件分別在0、2、4、6、8、12、24 h進樣分析，記錄松脂素二甲醚、木蘭脂素和木蘭花堿的峰面積，并計算不同時間點松脂素二甲醚、木蘭脂素和木蘭花堿峰面積RSD值，分別為0.81%、1.26%、0.95%。

2.2.4 重復性試驗 取同批次辛夷藥材粉末，按“2.1.4”項下確定的供試品溶液制備方法制備6份供試品溶液，并按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，計算松脂素二甲醚、木蘭脂素、木蘭花堿的質量分數(shù)分別為20.02、50.10、4.92 mg/g，RSD值分別為1.52%、0.27%和1.95%，說明該方法重復性良好。

2.2.5 加樣回收率試驗 取辛夷藥材粉末（批號G1703182，過二號篩）約0.1 g，精密稱定，按樣品與對照品松脂素二甲醚、木蘭脂素、木蘭花堿的含量比為1∶0.5、1∶1及1∶1.5加入松脂素二甲醚、木蘭脂素、木蘭花堿對照品，每種比例平行3份，按“2.1.4”項下方法制備9份供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，計算3種成分的回收率范圍及RSD值，松脂素二甲醚、木蘭脂素和木蘭花堿的加樣回收率分別為95.20%～99.71%、95.94%～101.99%、90.42%～99.65%，平均加樣回收率分別為98.16%、99.42%、96.99%，RSD分別為1.60%、2.15%、和3.00%，均小于4.0%，表明該分析方法準確度良好。

2.2.6 中間精密度試驗 由本項目組其他分析人員在不同日期和不同色譜儀下操作，取同一批辛夷藥材粉末（過二號篩）約0.2 g，精密稱定，平行6份，按“2.1.4”項下方法制備6份供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，計算松脂素二甲醚、木蘭脂素、木蘭花堿的質量分數(shù)分別為20.18、50.87、4.99 mg/g，與6份重復性試驗樣品的RSD分別為0.56%、1.27%和1.69%，表明該方法中間精密度良好。

2.2.7 樣品測定 取15批辛夷藥材粉末，按“2.1.4”項下方法制備供試品溶液，按“2.1.1”項下色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，按外標法計算各批次樣品松脂素二甲醚、木蘭脂素和木蘭花堿的含量，結果見表6，15批辛夷藥材松脂素二甲醚、木蘭脂素和木蘭花堿的總量在1.71%～8.02%。

表6 樣品測定結果(n＝15)

《中國藥典》2015年版辛夷藥材項下規(guī)定木蘭脂素的含量應不低于0.40%，15批樣品均符合藥典的規(guī)定，其中湖北產地的3批藥材木蘭脂素的含量是藥典限度的3～4倍，河南產地的9批藥材木蘭脂素的含量是藥典限度的6～14倍，四川產地的3批藥材木蘭脂素的含量是藥典限度的2～3倍，此外，木蘭花堿的含量以湖北最高，松脂素二甲醚的含量以河南最高，3種有效成分的總含量，以河南最高，分別為湖北的2～3倍，四川的3～5倍。

3 討論

3.1 色譜條件的選擇

與HPLC相比，UPLC法因分辨率高、分離能力強、分析時間縮短，在中藥指紋/特征圖譜的建立方面優(yōu)勢明顯[10]。本實驗采用UPLC譜，在45 min內，即完成主要色譜峰的良好分離，其中松脂素二甲醚、木蘭脂素和木蘭花堿3種有效成分的分離度和峰純度符合定量要求，3種化合物均在230 nm附近有最大吸收，且指紋圖譜研究發(fā)現(xiàn)，230 nm處色譜峰數(shù)目較多，響應值較大，基線平穩(wěn)，因此選擇230 nm作為指紋圖譜和含量測定的檢測波長。流動相的篩選考察了甲醇-0.1%磷酸溶液，乙腈-0.1%磷酸溶液和甲醇-水3種溶劑系統(tǒng)的洗脫和分離效果，結果顯示，以乙腈-0.1%磷酸溶液為流動相，各色譜峰出峰時間短，分離度較好。色譜柱的選擇，分別考察了YMC Triart C18（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）色譜柱、Waters HSS T3 C18（100 mm×2.1 mm，1.8 μm）色譜柱、Waters Acquity BEH C18（100 mm×2.1 mm，1.7 μm）色譜柱和Waters Cortecs T3 C18（100 mm×2.1 mm，1.6 μm）色譜柱這4種不同品牌和柱填料的柱子對指紋圖譜和含量測定各色譜峰的分離效果，結果顯示，采用YMC Triart C18（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）柱，各色譜峰分離效果最佳。

3.2 供試品溶液制備方法考察

在方法的建立過程中，分別對不同的提取溶劑（甲醇、50%甲醇、30%甲醇和50%乙醇）、提取方式（超聲、回流）、提取時間（30、45、60 min）進行考察，以各色譜峰的總峰面積/稱樣量以及3種有效成分的含量為考察指標，優(yōu)選最佳的提取方法，結果顯示，以50%乙醇超聲提取45 min，提取效率最高。

3.3 指紋圖譜的構建及分析評價

辛夷（望春花Pamp.）為落葉喬木，生于海拔400～2400 m的山坡林中，多為家種，野生資源較少，主要分布于河南、湖北及四川等地[11]，15批辛夷藥材指紋圖譜共標識出10個共有指紋峰，通過對照品指認出3個有效成分，分別為木蘭脂素、松脂素二甲醚和木蘭花堿。相似度評價結果顯示，同省區(qū)的藥材，相似度較高，不同的省區(qū)，湖北、四川與河南存在明顯的差異，HCA和PCA分析將15批藥材分為3類，并對應不同的產區(qū)，OPLS-DA分析找到7個差異標志物，說明不同產區(qū)辛夷藥材的化學成分存在較大差異，這種差異可能與藥材的生長環(huán)境、采收加工等因素密切相關。

3.4 有效成分的測定與分析

15批藥材3種有效成分的測定結果顯示，木蘭脂素和木蘭花堿的含量，河南均明顯高于湖北與四川，木蘭脂素的含量更是藥典限度的6～14倍，而湖北辛夷木蘭花堿的含量最高，且3批藥材木蘭花堿的含量較穩(wěn)定?！吨袊幍洹?015年版辛夷藥材項下以木蘭脂素為含測指標，但是單一的成分測定，尚不足以全面評價辛夷藥材的質量。中藥成分復雜，針對不同的功能主治，發(fā)揮作用的有效成分不同，因此，有必要增加多指標的含量測定，并根據(jù)發(fā)揮作用的藥效物質不同，選擇合適的藥材產地。本文在指紋圖譜的基礎上，增加對有效成分木蘭脂素、木蘭花堿和松脂素二甲醚的同時測定，從多角度研究不同產地辛夷藥材質量的差異性，該方法簡便，專屬性強，重復性良好，分析時間短，能有效地分析不同產地辛夷藥材質量的差異性，為不同產地辛夷藥材的質量評價提供參考。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Differences offrom different producing areas based on fingerprint and multi-components determination

LI Zhen-yu, HE Jia-ying, TONG Pei-zhen, WEI Mei, SUN Dong-mei, DENG Cong-you, CHEN Xiang-dong

Guangdong Key Laboratory of Traditional Chinese Medicine Formula Granule, Guangdong Yifong Pharmaceutical Co., Ltd., Foshan 528244, China

To evaluate the difference offrom different producing areas by establishing UPLC fingerprint and determining contents of three effective components of.UPLC method was adopted. The determination was performed on YMC Triart C18column (100 mm ×2.1 mm,1.9 μm) with acetonitrile-0.1% phosphoric acid solution as the mobile phase by gradient elution at a flow rate of 0.3 mL/min. The detective wavelength was 230nm, the column temperature was 30 ℃, the injection volume was 1μL. The UPLC fingerprints of 15 batches ofwere established and the common peaks were identificated by reference substances. The contents of three effective components were determined. Similarity evaluation, cluster analysis (HCA), and principal component analysis (PCA) were carried out on the fingerprints and orthogonal partial least squares discriminant analysis (OPLS-DA) was used to find the different components offrom different producing areas.There were 10 common peaks in the fingerprints of. By comparing with the reference substances, three common peaks were identified, namely, magnolin, pinoresinol dimethyl ether, and magnolflorine. The similarity among Hubei, Sichuan and Henan was 0.585—0.793. According to the analysis of HCA and PCA, 15 batches ofwere divided into three categories, corresponding to three different producing areas. Seven kinds of biomarkers were determined by OPLS-DA method. The order of significance was magnolin > peak 4 >pinoresinol dimethyl ether > peak 3 > peak 8 > peak 9> peak 10, respectively. The contents of magnolin and pinoresinol dimethyl ether inof Henan Province were the highest and the content of magnolflorine inof Hubei Province was the highest.This method can effectively analyze the quality differences offrom different producing areas and provide reference for the quality evaluation.

; UPLC fingerprints; multi-components determination; differential marker; magnolin; pinoresinol dimethyl ether

R286

A

0253 - 2670(2021)01 - 0234 - 07

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.01.028

2020-05-10

廣東省省級科技計劃項目（2018B030323004）

李振雨（1989—），主管中藥師，從事中藥飲片及中藥配方顆粒研究。

陳向東，高級工程師，從事中藥飲片及中藥配方顆粒研究。E-mail: 1083656123@qq.com

[責任編輯 時圣明]