藏藥麻花秦艽防治細(xì)胞因子風(fēng)暴活性成分與作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

高小敏，徐 雅，劉杜霞，張曉英，李 捷，仝 敏，趙 勤

藏藥麻花秦艽防治細(xì)胞因子風(fēng)暴活性成分與作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究

高小敏，徐 雅，劉杜霞，張曉英，李 捷，仝 敏，趙 勤*

西藏民族大學(xué) 藏藥檢測技術(shù)教育部工程研究中心，西藏民族大學(xué)醫(yī)學(xué)院藏藥篩選實(shí)驗(yàn)室，陜西 咸陽 712082

應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法對(duì)藏藥麻花秦艽防治細(xì)胞因子風(fēng)暴的主要活性成分及可能作用機(jī)制進(jìn)行預(yù)測分析。通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫分析平臺(tái)（TCMSP）及人類基因（GeneCards）數(shù)據(jù)庫收集麻花秦艽的活性化合物和與細(xì)胞因子風(fēng)暴相關(guān)靶點(diǎn)；應(yīng)用Cytoscape 3.6.1軟件構(gòu)建麻花秦艽活性成分-細(xì)胞因子風(fēng)暴靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖；構(gòu)建蛋白-蛋白相互作用網(wǎng)絡(luò)圖篩選核心靶點(diǎn)，利用DAVID在線數(shù)據(jù)庫對(duì)核心蛋白進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析。篩選得到麻花秦艽與防治細(xì)胞因子風(fēng)暴相關(guān)的14個(gè)活性化合物和31個(gè)有效靶點(diǎn)，核心化合物和靶點(diǎn)分別為熊果酸、木犀草素、山柰酚、豆甾醇、β-谷甾醇和白細(xì)胞介素6（interleukin- 6，IL-6）、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子3（signal transducers and transcriptional activators 3，STAT3）、c-Jun氨基末端激酶（C-jun amino-terminal kinase，JNK）、蛋白激酶B1（protein kinase B1，Akt1）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metallopeptidase 9，MMP9）、血管內(nèi)皮生長因子（vascular endothelial growth factor A，VEGF）、IL-1β、IL-10等。GO分析發(fā)現(xiàn)麻花秦艽在抗細(xì)胞因子風(fēng)暴時(shí)主要涉及調(diào)控細(xì)胞凋亡、基因表達(dá)、細(xì)胞因子活性、一氧化氮生物合成過程的正調(diào)控、生長因子活性、免疫應(yīng)答等過程。KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)其主要涉及細(xì)胞因子風(fēng)暴相關(guān)通路T細(xì)胞受體信號(hào)通路、酪氨酸激酶JAK和轉(zhuǎn)錄因子STAT（Janus kinase-signal transducer and activator of transcription，Jak-STAT）信號(hào)通路、低氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia-inducible factor 1，HIF-1）信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、磷酸化磷酯酰肌醇3激酶（phosphatidylinositide 3-kinases，PI3K）-Akt信號(hào)通路等核心靶點(diǎn)通路。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)數(shù)據(jù)挖掘初步預(yù)測了藏藥麻花秦艽防治細(xì)胞因子風(fēng)暴的潛在活性成分及其可能機(jī)制，揭示其可通過多成分、多靶點(diǎn)、多通路防治細(xì)胞因子風(fēng)暴對(duì)機(jī)體造成的損傷，以期為藏藥麻花秦艽在防治細(xì)胞因子風(fēng)暴方面的應(yīng)用提供參考，為開發(fā)藏藥麻花秦艽的新藥用價(jià)值提供思路。

麻花秦艽；細(xì)胞因子風(fēng)暴；高細(xì)胞因子血癥；新型冠狀病毒肺炎；網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)；熊果酸；木犀草素；山柰酚；豆甾醇；β-谷甾醇

2019年12月世界范圍出現(xiàn)了不明原因的新型冠狀病毒肺炎，并迅速蔓延。WHO將此病毒命名為嚴(yán)重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（severe acute respiratory syndrome coronavirus 2，SARS-COV-2），所致的疾病命名為新型冠狀病毒肺炎（coronavirus disease 2019，COVID-19）[1-2]。臨床治療過程中發(fā)現(xiàn)感染了SARS-COV-2的重癥患者或輕癥患者病情突然惡化時(shí)，患者體內(nèi)出現(xiàn)大量的白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）、γ干擾素（interferon-γ，IFN-γ）等促炎細(xì)胞因子[3-4]，呈現(xiàn)細(xì)胞因子風(fēng)暴的特征。細(xì)胞因子風(fēng)暴（cytokine storm）又稱高細(xì)胞因子血癥（hypercytokinemia），是由感染、藥物或某些疾病刺激引起的免疫系統(tǒng)過度激活，炎癥細(xì)胞因子與白細(xì)胞在體內(nèi)不受調(diào)控，過度釋放，呈現(xiàn)高炎癥反應(yīng)狀態(tài)，一旦發(fā)生可迅速引起急性呼吸窘迫綜合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS），最終可導(dǎo)致多器官功能衰竭，甚至死亡。多項(xiàng)研究揭示大量且難以控制的細(xì)胞因子風(fēng)暴是導(dǎo)致重癥肺炎、全身臟器衰竭的重要原因[5-6]。細(xì)胞因子風(fēng)暴發(fā)病機(jī)制復(fù)雜、疾病進(jìn)展迅速、死亡率高，尋找有效藥物，預(yù)防細(xì)胞因子風(fēng)暴發(fā)生對(duì)防治ARDS具有重大意義。

此次疫情中我國采用中西醫(yī)聯(lián)合治療COVID-19，取得了很好的療效[7-8]，尤其在治療輕癥患者和防治患者病情惡化方面療效突出，在抑制細(xì)胞因子風(fēng)暴方面有一定的優(yōu)勢。藏醫(yī)藥學(xué)是我國傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)的重要組成部分，此次疫情中也將藏藥納入到一線防疫治療中，并取得了較好的效果。本課題組正在研究的藏藥麻花秦艽Maxim. 是我國西藏高原地產(chǎn)藏藥，獨(dú)特的高原環(huán)境孕育了其優(yōu)良的生物活性，是藏醫(yī)藥中重要的常用藥材。藏藥麻花秦艽為龍膽科（Gentianaceae）龍膽屬(Tourn.) L.多年生草本植物，藏醫(yī)將其稱為“解吉嘎保”，以根和花入藥，具有祛風(fēng)濕、清濕熱、止痹痛的功效，常用于胃腸炎、肝炎、膽囊炎等疾病的治療[9-10]。研究發(fā)現(xiàn)麻花秦艽具有良好的抗炎作用，可以改善佐劑和膠原誘導(dǎo)型關(guān)節(jié)炎模型（collagen-induced arthritis，CIA）大鼠的炎癥，降低CIA大鼠血清中炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平，抑制滑膜組織中核因子-κB（nuclear factor- κB，NF-κB）p65蛋白表達(dá)，減輕滑膜炎癥[11-17]。前期的研究結(jié)果也顯示麻花秦艽具有抗氧化和抗缺氧作用，能夠保護(hù)低壓缺氧大鼠心、腦、肺組織損傷，降低低壓缺氧大鼠肺組織上清液中IL-6、IL-1β、TNF-α的含量，減少低壓缺氧大鼠心肌組織mRNA的表達(dá)[18]。另有研究報(bào)道，麻花秦艽其主要成分龍膽苦苷對(duì)于小鼠膿毒癥急性肺損傷也具有抗感染及保護(hù)肺功能等作用，可顯著降低肺部中性粒細(xì)胞的浸潤及炎性滲出，減少脂質(zhì)過氧化，降低支氣管肺泡灌洗液中TNF-α、IL-6含量，減輕肺部炎癥反應(yīng)[19]；明顯降低脂多糖（lipopolysac- charide，LPS）致小鼠BALF中炎癥細(xì)胞及中性粒細(xì)胞比例，減輕肺部炎癥反應(yīng)，有一定的抗急性肺損傷作用[13]；還可顯著降低LPS刺激的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7中一氧化氮的產(chǎn)生[20]。其主要成分獐牙菜苦苷對(duì)LPS刺激的小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7中TNF-α、IL-6的生成具有抑制作用，機(jī)制可能與抑制NF-κB通路相關(guān)因子p65、核因子-κB抑制物激酶α（nuclear factor κB inhibitor kinase，IKK-α）的水平有關(guān)[21]。綜上研究結(jié)果提示，麻花秦艽可能是新型抗炎藥物的有力潛在候選者，其可能具有防治細(xì)胞因子風(fēng)暴發(fā)生的作用。因此，本研究通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法分析麻花秦艽防治細(xì)胞因子風(fēng)暴的活性成分、作用靶點(diǎn)及信號(hào)通路等，為后續(xù)開發(fā)麻花秦艽防治細(xì)胞因子風(fēng)暴臨床應(yīng)用提供思路和方法。

1 方法

1.1 麻花秦艽活性成分、靶點(diǎn)收集

通過中國知網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)庫相關(guān)文獻(xiàn)收集麻花秦艽化學(xué)成分，將收集的化學(xué)成分通過中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫與分析數(shù)據(jù)庫（TCMSP http//ibts.hkbu. edu.hk/LSP/tcmsp.php）[22]查找成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，排除無靶點(diǎn)、冗長（結(jié)構(gòu)式復(fù)雜、數(shù)據(jù)庫無對(duì)應(yīng)成分及靶點(diǎn)）的成分，對(duì)最終納入研究的麻花秦艽活性成分的對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)進(jìn)行Uniprot數(shù)據(jù)庫標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2 藥物-疾病靶標(biāo)預(yù)測

以關(guān)鍵詞“cytokine storm”“hypercytokinemia”在Genecards數(shù)據(jù)庫[23]檢索疾病相關(guān)靶點(diǎn)。將麻花秦艽活性成分的相關(guān)靶點(diǎn)與細(xì)胞因子風(fēng)暴的靶點(diǎn)取交集，得到麻花秦艽活性成分-疾病的靶標(biāo)及其韋恩圖。

1.3 成分-靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建

將篩選的麻花秦艽活性成分和疾病靶點(diǎn)通過 Cytoscape軟件（V3.6.1）[24]得到活性成分-靶點(diǎn)的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖，對(duì)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖進(jìn)一步分析得出麻花秦艽防治細(xì)胞因子風(fēng)暴的主要活性成分。

1.4 蛋白-蛋白相互作用（protein-protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)的構(gòu)建和篩選核心靶標(biāo)

將“1.2”項(xiàng)中的藥物-疾病靶標(biāo)利用String數(shù)據(jù)庫進(jìn)行分析，設(shè)定種屬為“homo sapiens”，最小互作分?jǐn)?shù)值≥0.7，不顯示在網(wǎng)絡(luò)中未連接的節(jié)點(diǎn)，得出網(wǎng)絡(luò)圖及輸出藥物-疾病靶標(biāo)蛋白相互作用結(jié)果。通過R語言（3.6.1）篩選核心靶標(biāo)并繪制核心靶標(biāo)的條形圖。

1.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

將篩選的核心靶點(diǎn)利用DAVID在線數(shù)據(jù)庫[25]進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析，結(jié)果按值由小到大排序及結(jié)果分析，＜0.05代表統(tǒng)計(jì)學(xué)有差異。

2 結(jié)果

2.1 麻花秦艽活性成分和靶點(diǎn)的篩選

通過TCMSP數(shù)據(jù)庫，將收集的化學(xué)成分根據(jù)口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥20%，類藥性（drug likeness，DL）≥0.09進(jìn)行篩選，匯總符合篩選條件的化學(xué)成分及對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。因熊果酸[26]、當(dāng)藥苷[27]為麻花秦艽主要成分，且具有較好的抗炎作用[28-29]。因此，將熊果酸和當(dāng)藥苷也納入此次研究，最終篩選出的化學(xué)成分共14個(gè)（表1），藥物靶點(diǎn)共126個(gè)。

表1 麻花秦艽活性成分基本信息

2.2 疾病靶點(diǎn)和藥物-疾病靶點(diǎn)的交集

Genecards數(shù)據(jù)庫檢索與細(xì)胞因子風(fēng)暴相關(guān)的靶點(diǎn)，排除重復(fù)后共得到315個(gè)靶點(diǎn)。通過R語言軟件（V3.6.2）映射麻花秦艽活性成分相關(guān)靶點(diǎn)到細(xì)胞因子風(fēng)暴靶點(diǎn)，得出麻花秦艽活性成分與細(xì)胞因子風(fēng)暴的有效靶標(biāo)共31個(gè)（圖1和表2）。

2.3 成分-靶點(diǎn)調(diào)控網(wǎng)絡(luò)圖

將麻花秦艽防治細(xì)胞因子風(fēng)暴的活性成分及作用靶點(diǎn)導(dǎo)入Cytoscape 3.6.1軟件，構(gòu)建可視化分析網(wǎng)絡(luò)圖，圖中的菱形代表基因，圓形代表化學(xué)成分。圖形的大小及顏色深度與度（degree）呈正相關(guān)，度值的大小與該成分在疾病中發(fā)揮作用的大小相關(guān)，值越大表明該成分治療疾病的可能性越大。結(jié)果可得出熊果酸（DY3）、木犀草素（DY11）、山柰酚（DY12）、豆甾醇（DY10）、β-谷甾醇（DY1）在麻花秦艽防治細(xì)胞因子風(fēng)暴時(shí)為主要活性成分（圖2）。

圖1 麻花秦艽防治細(xì)胞因子風(fēng)暴靶點(diǎn)韋恩圖

表2 麻花秦艽防治細(xì)胞因子風(fēng)暴的關(guān)鍵靶點(diǎn)

2.4 PPI網(wǎng)絡(luò)圖和核心靶點(diǎn)

將麻花秦艽與細(xì)胞因子風(fēng)暴映射得到的31個(gè)靶點(diǎn)導(dǎo)入String數(shù)據(jù)庫，按“1.4”項(xiàng)中的條件進(jìn)行設(shè)置，得到麻花秦艽-細(xì)胞因子風(fēng)暴相互作用網(wǎng)絡(luò)圖，位于中心且邊數(shù)越多的節(jié)點(diǎn)成為核心靶點(diǎn)的可能性越大（圖3）。用R語言（V3.6.2）進(jìn)一步篩選麻花秦艽-細(xì)胞因子風(fēng)暴靶點(diǎn)相互作用網(wǎng)絡(luò)，按鄰接節(jié)點(diǎn)數(shù)目由多到少形成條形圖（圖4）。鄰接節(jié)點(diǎn)的數(shù)量與成為核心基因的概率相關(guān)，其數(shù)量越多成為核心靶點(diǎn)的概率越大。結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-6、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子與轉(zhuǎn)錄激活子3（signal transducers and transcriptional activators 3，STAT3）、c-Jun氨基末端激酶（C-jun amino-terminal kinase，JNK）、蛋白激酶B1（protein kinase B1，Akt1）、表皮生長因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metallopeptidase 9，MMP9）、血管內(nèi)皮生長因子A（vascular endothelial growth factor，VEGF）、IL-1β、IL-10等與細(xì)胞因子風(fēng)暴關(guān)系密切。

菱形代表靶點(diǎn)，圓形代表化學(xué)成分

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)圖

圖4 核心靶點(diǎn)條形圖

2.5 GO功能富集分析和KEGG通路富集分析

將“2.4”項(xiàng)中的核心靶點(diǎn)利用DAVID數(shù)據(jù)庫進(jìn)行GO功能富集分析和KEGG通路富集分析。GO功能富集分析共得出231條結(jié)果，以生物過程為主，結(jié)果顯示麻花秦艽防治細(xì)胞因子風(fēng)暴生物過程主要與凋亡、轉(zhuǎn)錄、基因表達(dá)、一氧化氮生物合成等有關(guān)。細(xì)胞過程主要與細(xì)胞外空隙、細(xì)胞外間質(zhì)有關(guān)，分子功能通過影響細(xì)胞因子活性、生長因子活性發(fā)揮作用（圖5、6）。KEGG通路富集分析得出83條相關(guān)通路，與細(xì)胞因子風(fēng)暴直接相關(guān)的有27條，按照值由小至大排序，分析麻花秦艽防治細(xì)胞因子風(fēng)暴直接相關(guān)的前10條信號(hào)通路并繪制氣泡圖，圖中圓圈的大小與該通路有關(guān)的靶點(diǎn)數(shù)呈正相關(guān)，顏色越深表示值越小。結(jié)果顯示，T細(xì)胞受體信號(hào)通路、酪氨酸激酶JAK和轉(zhuǎn)錄因子STAT（Janus kinase-signal transducer and activator of transcription，Jak-STAT）信號(hào)通路、低氧誘導(dǎo)因子1（hypoxia- inducible factor 1，HIF-1）信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路及磷酸化磷酯酰肌醇3激酶（phosphatidylinositide 3-kinases，PI3K）-Akt信號(hào)通路可能與麻花秦艽防治細(xì)胞因子風(fēng)暴密切相關(guān)（圖7）。

圖5 GO富集分析餅形圖

3 討論

COVID-19已經(jīng)在全球迅速蔓延，值得警惕的是，在此次疫情的重癥患者體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)有大量的炎癥因子IL-6、TNF-α、IFN-γ等，目前認(rèn)為病情加重的原因可能是患者體內(nèi)啟動(dòng)了“炎癥因子風(fēng)暴”[3]。此外，ICU的患者粒細(xì)胞集落刺激因子（granulocytecolony-stimulatingfactor，G-CSF）、趨化因子-10（interferon-inducible protein-10，IP-10）、單核細(xì)胞趨化蛋白1（monocyte chemoattractant protein，MCP-1）、巨噬細(xì)胞炎性蛋白-1α（macrophage inflammatory protein-1α，MIP-1α）、TNF-α濃度高于非ICU的患者，也說明疾病嚴(yán)重程度與細(xì)胞因子風(fēng)暴相關(guān)[3]。因此，早期干預(yù)細(xì)胞因子風(fēng)暴可縮短治療COVID-19療程，減輕對(duì)機(jī)體的損傷，減少重癥患者、死亡患者數(shù)量?，F(xiàn)代研究[11-18]揭示藏藥麻花秦艽具有較強(qiáng)抗炎作用，可以降低炎癥因子IL-1β、IL-6和TNF-α水平，減輕肺部炎癥反應(yīng)，保護(hù)急性肺損傷。通過網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，本研究預(yù)測了麻花秦艽防治細(xì)胞因子風(fēng)暴的核心靶點(diǎn)和活性成分，主要為IL-6、STAT3、JUN、AKT1、EGFR等和木犀草素、熊果酸、β-谷甾醇、山柰酚等。T細(xì)胞受體信號(hào)通路、PI3k-AKT信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路及Jak-STAT信號(hào)通路可能與麻花秦艽防治細(xì)胞因子風(fēng)暴密切相關(guān)。

圖7 KEGG富集分析氣泡圖

有研究報(bào)道木犀草素可顯著降低急性痛風(fēng)性關(guān)節(jié)炎大鼠體內(nèi)Toll樣受體2（Toll-like receptor 2，TLR2）、TLR4、髓樣分化因子（myeloid differentiation factor 88，MyD88）和NF-κB蛋白的表達(dá)，明顯減少IL-1β、TNF-α、IL-6細(xì)胞因子的釋放[30]。其還可通過PI3K-Akt信號(hào)通路調(diào)節(jié)MMP9、MMP1的釋放從而抑制小細(xì)胞肺癌H1688、H466細(xì)胞的增殖與分化，下調(diào)VEGF的水平，抑制細(xì)胞外基質(zhì)重塑，減輕炎癥因子引起血管內(nèi)皮細(xì)胞過度活化造成的機(jī)體損傷[31]。山柰酚可下調(diào)乙酰氨基酚誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷p細(xì)胞核激酶（Jun nuclear kinase，p-JNK）和內(nèi)切糖苷酶（endo-glycosidase，Endo G）表達(dá)，上調(diào)Bcl-2蛋白表達(dá)，降低炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α水平[32]。木犀草素、山柰酚均是黃酮類成分，常作為抗細(xì)胞因子風(fēng)暴的主要化學(xué)成分，其具有抗炎、降低血管的脆性、改善血管的通透性等作用，還可以通過調(diào)節(jié)一氧化氮（NO）進(jìn)一步減輕血管內(nèi)皮細(xì)胞的損傷[33]。熊果酸是一種三萜類天然產(chǎn)物，具有抗氧化、抗炎、調(diào)節(jié)免疫、抗腫瘤等多種生物學(xué)活性[34-36]。β-谷甾醇屬于甾醇類，具有調(diào)血脂、抗炎、抗腫瘤作用。Valerio等[37]通過LPS誘導(dǎo)的J774A1巨噬細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)β-谷甾醇可升高抗炎因子IL-10的活性，減小趨化因子和促炎因子活性，下調(diào)核轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)。綜上所述，麻花秦艽含有的活性成分木犀草素、山柰酚、熊果酸素等具有防治細(xì)胞因子風(fēng)暴的作用，與本研究的推測是一致的。

預(yù)測了麻花秦艽防治細(xì)胞因子風(fēng)暴的核心靶點(diǎn)為IL-6、STAT3、JUN、AKT1、EGFR、MMP9、VEGFA、IL-1β、IL-10等。細(xì)胞因子風(fēng)暴是多種促炎因子如白介素家族、腫瘤壞死因子、選擇素、黏附素的過高表達(dá)，尤其是 IL-6、TNF-α、IL-1β的迅速大量產(chǎn)生打破了免疫平衡，在細(xì)胞因子風(fēng)暴中發(fā)揮著重要作用。國家衛(wèi)生健康委員會(huì)、國家中醫(yī)藥管理局最新印發(fā)的《新型冠狀病毒感染的肺炎診療方案（試行第七版）》[2]已經(jīng)明確將IL-6水平上升作為病情惡化的臨床警示指標(biāo)。TNF-ɑ是細(xì)胞因子風(fēng)暴的核心炎癥因子，能夠促進(jìn)多種免疫細(xì)胞分化、分泌、殺傷功能，是引起其他細(xì)胞因子水平上升和組織損傷的核心。在機(jī)體感染病毒時(shí)，外周血中TNF-ɑ表達(dá)升高，激活T細(xì)胞促進(jìn)IL-1、IL-6、IL-8和IL-12等細(xì)胞因子的產(chǎn)生及分泌，從而激活一系列炎性反應(yīng)，還可激活TNF-ɑ/NF-κB途徑參與急性肺損傷的發(fā)生[38]。

GO富集分析結(jié)果得出，生物過程主要與細(xì)胞凋亡、轉(zhuǎn)錄，細(xì)胞對(duì)LPS的反應(yīng)等有關(guān)。細(xì)胞組成主要與細(xì)胞外空隙功能有關(guān)。分子功能通過影響細(xì)胞因子活性、生長因子活性發(fā)揮作用。機(jī)體在肺部感染后，細(xì)胞凋亡增加，Bax水平顯著升高、Bcl-2水平下降，提示細(xì)胞凋亡在感染過程中發(fā)揮重要作用[39]。KEGG通路富集分析得出與上述靶點(diǎn)相關(guān)的核心通路為T細(xì)胞受體信號(hào)通路、Jak-STAT信號(hào)通路、HIF-1信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、PI3K-Akt信號(hào)通路，這些通路是與細(xì)胞因子風(fēng)暴密切相關(guān)的，可能是麻花秦艽防治細(xì)胞因子風(fēng)暴的途徑。當(dāng)抗原侵入人體后與T細(xì)胞受體結(jié)合，同時(shí)白細(xì)胞共同抗原抗體45（leukocyte common antigen antibody，CD45）可與CD4或CD8聚集，促使淋巴細(xì)胞特異性蛋白酪氨酸激酶抗體P56（lymphocyte-specific protein tyrosine kinase antibody P56，P56 lck）等蛋白酪氨酸激酶（protein yyrosine kinase，PTK）分子去磷酸化，而引發(fā)一系列激酶的活化和級(jí)聯(lián)反應(yīng)，使得活化信號(hào)可以逐級(jí)下傳[40]。JAK-STAT信號(hào)通路是參與多種細(xì)胞因子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的重要路徑，對(duì)機(jī)體免疫應(yīng)答、免疫細(xì)胞分化發(fā)育及炎癥反應(yīng)有重要影響[41]。HIF-1普遍存在于機(jī)體各組織和細(xì)胞中，當(dāng)機(jī)體發(fā)生炎癥反應(yīng)時(shí)組織對(duì)氧的需求增加，血管血栓的形成或壓力增大進(jìn)一步引起血液的營養(yǎng)來源減少，氧氣的供需比率變化使炎癥組織低氧情況加重[42]。Toll樣受體中的TLR2、TLR4影響炎癥因子表達(dá)及PI3K-Akt激活在麻花秦艽成分研究中也多次提到。TLR4可識(shí)別LPS，并通過TRIF介導(dǎo)TLR4-TRIF或TLR4- MyD88-IKK-NF-κB下游信號(hào)通路，產(chǎn)生大量促炎細(xì)胞因子和趨化因子介導(dǎo)急性肺炎，由病毒感染壞死細(xì)胞釋放的高遷移率族蛋白B1（high mobility group B1，HMGB1）可通過TLR4誘導(dǎo)細(xì)胞因子分泌，也會(huì)導(dǎo)致過度的炎癥反應(yīng)及重癥肺炎[43]。而免疫T細(xì)胞亞群CD4＋/CD8＋比例失衡，是激活TLR4-MyD88-IKK-NF-κB信號(hào)通路的主要因素，可促使肺泡巨噬細(xì)胞大量分泌I型IFN、TNF-α、IL-6、IL-8、IL-1β等炎性細(xì)胞因子和MCP-1、MIP-1α、調(diào)節(jié)活化的正常T細(xì)胞表達(dá)及分泌的趨化因子（activation regulates expression and secretion of normal T cells，RANTES）、IP-10等趨化因子[44]，誘發(fā)和加重細(xì)胞因子風(fēng)暴發(fā)生急性肺損傷（acute lung injury，ALI）/急性呼吸窘迫（acute respiratory distress，ARDS）。這些研究表明，T細(xì)胞受體信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、PI3K/Akt、JAK/STAT、TNF-α/NF-κB信號(hào)途徑的激活在細(xì)胞因子風(fēng)暴引起臟器損傷中具有重要的作用，并可以成為潛在的治療靶點(diǎn)。結(jié)合前期對(duì)麻花秦艽的免疫作用研究發(fā)現(xiàn)，麻花秦艽醇提物可顯著降低白細(xì)胞、淋巴細(xì)胞水平，抑制刀豆蛋白A（concanavalin A，ConA）和LPS誘導(dǎo)的小鼠T、B淋巴細(xì)胞增殖，降低CD4＋、升高CD8＋，使CD4＋/CD8＋值降低，表明麻花秦艽醇提物可能是通過調(diào)整T細(xì)胞亞群CD4＋和CD8＋比例平衡關(guān)系來調(diào)控小鼠T細(xì)胞免疫。這些結(jié)果充分顯示，麻花秦艽可通過多成分、多靶點(diǎn)及多信號(hào)通路發(fā)揮抗細(xì)胞因子風(fēng)暴作用。

綜上所述，經(jīng)網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)挖掘預(yù)測得出的麻花秦艽抗細(xì)胞因子風(fēng)暴主要成分、靶點(diǎn)以及信號(hào)通路、生物學(xué)功能與已經(jīng)報(bào)道文獻(xiàn)基本吻合，說明運(yùn)用網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)挖掘具有一定的可行性。但是，網(wǎng)絡(luò)數(shù)據(jù)挖掘也有一定的缺陷，麻花秦艽中部分成分未在數(shù)據(jù)庫找到而無法進(jìn)行分析，部分通路仍未證實(shí)?？傮w而言，網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)作為一門通過計(jì)算機(jī)大量數(shù)據(jù)計(jì)算等方法為研究供藥物成分、靶點(diǎn)、信號(hào)通路的預(yù)測具有可信性，在藥物研究中提供研究方向指導(dǎo)，為證實(shí)藥物的作用及挖掘藥物新用途提供依據(jù)。

利益沖突 所有作者均聲明不存在利益沖突

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Active components and mechanism of Tibetan medicineagainst cytokine storm

GAO Xiao-min, XU Ya, LIU Du-xia, ZHANG Xiao-ying, LI Jie, TONG Min, ZHAO Qin

Engineering Research Center of Tibetan Medicine Testing Technology of Ministry of education, Tibetan Medicine Screening Laboratory, School of Medicine, Tibet University for Nationalities, Xianyang 712082, China

To analyze the main active components and possible mechanism of Mahuaqinjiao () in the preventive treatment of cytokine storm by network pharmacology.The therapeutic targets for cytokine storms and its active ingredients ofwere searched and collected from the database of TCMSP and GeneCards; The regulatory network map of active component cytokine storm targets ofwas constructed by using Cytoscape 3.6.1; The network map of protein-protein interaction was constructed to screen the core target, and the gene ontology (GO) function enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis of the core protein were carried out by using the online database of DAVID.After screening, 14 active components and 31 effective targets for prevention and treatment of cytokine storm were obtained, mainly including IL6, STAT3, Jun, AKT1, EGFR, MMP9, VEGFA, IL-1β, IL-10, and other core targets. Go analysis showed thatmainly involved in the regulation of apoptosis, gene expression, cytokine activity, positive regulation of nitric oxide biosynthesis, growth factor activity, immune response and other processes. KEGG pathway analysis showed that the main pathways related to cytokine storm were T-cell receptor signaling pathway, JAK STAT signaling pathway, HIF-1 signaling pathway, tumor necrosis factor signaling pathway, Toll like receptor signaling pathway, PI3K Akt signaling pathway and other core target pathways.Based on the data mining of network pharmacology, the potential active components and possible mechanism targets ofagainst cytokine storm were predicted preliminarily, in order to provide reference for the application ofin the prevention and control of cytokine storm, and provide ideas for the development of new uses of.

Mahuaqinjiao (Maxim.); cytokine storm; hypercytokinemia; coronavirus disease 2019 (COVID-19); network pharmacology; ursolic acid; luteolin; kaempferol; stigmasterol; β-sitosterol

R285

A

0253 - 2670(2021)01 - 0186 - 10

10.7501/j.issn.0253-2670.2021.01.022

2020-05-11

國家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（81660722）；西藏民族大學(xué)新冠肺炎疫情應(yīng)急項(xiàng)目（XZMDYJ02）；陜西省中醫(yī)管理局（2019-ZZ-JC046）；西藏民族大學(xué)重點(diǎn)項(xiàng)目（13myZP07）

高小敏（1992—），女，碩士在讀，研究方向?yàn)楦咴〖安厮幩幮W(xué)。Tel: 18220741795 E-mail: 2456711545@qq.com

趙 勤，教授，碩士生導(dǎo)師，主要從事高原病及藏藥藥效學(xué)研究。E-mail: xyzhaoqin@126.com

[責(zé)任編輯 潘明佳]