三七花藥材質(zhì)量控制方法的建立*

朱曉青，劉春花，龍慶德，王愛民，李勇軍，王永林，陸苑**

(1.貴州醫(yī)科大學(xué) 貴州省藥物制劑重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 & 省部共建藥用植物功效與利用國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，貴州 貴陽 550004； 2.貴州醫(yī)科大學(xué) 藥學(xué)院，貴州 貴陽 550004； 3.貴州醫(yī)科大學(xué) 民族藥與中藥開發(fā)應(yīng)用教育部工程研究中心，貴州 貴陽 550004)

三七花為五加科植物三七Panax notoginseng(Burk.)F.H.Chen的干燥花序，分布于云南、四川、廣西、湖北、廣東、江西及貴州等地，主產(chǎn)于云南、四川，野生者少見，多為栽培[1]?！吨腥A本草》記載三七花又名田七花，三七花曬干后可直接入藥，味甘、性涼，具有清熱生津、平肝降壓的功效，主治津傷口渴、咽痛喑啞、高血壓病[1]?，F(xiàn)代臨床研究表明，三七花開水泡服，當(dāng)茶飲，可治療高血壓[2]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究發(fā)現(xiàn)三七花對中樞系統(tǒng)具有抑制作用、鎮(zhèn)痛作用、降壓作用及抗炎作用等[3-5]。三七花中含有四環(huán)三萜皂苷，主要有人參皂苷Rb1、Rb2、Rb3、Rc、Rd及F2等，苷元為人參二醇和達(dá)瑪烷三醇、四醇[1, 5-6]。三七花具有良好的藥用價值，雖然《貴州省中藥材、民族藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》2003年版[7]、《廣西省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》(1990年版)[8]、《廣西壯藥質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》[9]和《四川省中藥材標(biāo)準(zhǔn)》(2010版)[10]均收載了三七花，但控制的項(xiàng)目都比較簡單，目前關(guān)于三七花含量測定研究較多[11-13]。故本實(shí)驗(yàn)中主要對三七花的薄層色譜鑒別實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了系統(tǒng)考察，同時對三七花的性狀和粉末進(jìn)行顯微鑒別，對其水分、總灰分、醇溶性浸出物進(jìn)行測定，為進(jìn)一步規(guī)范和提高三七花的質(zhì)量方法提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，從而建立更可靠的質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

1.1.1儀器 50i顯微鏡及DS-Fi2顯微成像系統(tǒng)(日本尼康公司)，REPROSTAR3薄層數(shù)碼成像系統(tǒng)(瑞士CAMAG)，WP-ΜP-II-20實(shí)驗(yàn)室超純水機(jī)(四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司)，EL204電子天平(瑞士METTLER)，DK-98-Ⅱ型水浴鍋(天津泰斯特有限公司)。

1.1.2試藥 硫酸、無水乙醇、甲醇、乙醇、正丁醇、乙醚、乙酸乙酯、石油醚、乙酸丁酯及三氯甲烷均購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司、均為分析純，青島海洋硅膠G板(青島海洋化工廠分廠)，煙臺黃海江友硅膠G板(煙臺黃海江友化工廠)，青島鼎康硅膠G板(青島鼎康化工廠)。三七花樣品5批(表1)，并以其中任一批為對照品，均經(jīng)貴州醫(yī)科大學(xué)中藥標(biāo)本館龍慶德副教授鑒定為三七花。

表1 三七花樣品信息Tab.1 The sample information of flower buds of panax notoginseng

1.2 方法

1.2.1性狀鑒定 采用標(biāo)尺對三七花的大小進(jìn)行測量，用看、摸、聞、嘗等直觀的方法對樣品形狀、色澤、表面、質(zhì)地和氣味等進(jìn)行鑒定。

1.2.2粉末顯微鑒別 取三七花粉末(過4號篩)少許置載玻片上，滴加蒸餾水、水合氯醛試液或稀甘油試液等(必要時，加熱透化)，蓋上蓋玻片，置顯微鏡下觀察、測量和拍照。

1.2.3薄層色譜鑒別 取三七花粉末1 g，加石油醚(60～90 ℃)20 mL超聲處理20 min、濾過，收集殘?jiān)?、揮干溶劑，加入70%乙醇20 mL，超聲處理30 min、濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀? mL溶解，加水飽和正丁醇15 mL(萃取3次)收集正丁醇層(上層)、用氨試液洗滌至下層溶液無色收集正丁醇層(上層)，正丁醇飽和的水溶液洗滌至中性，收集正丁醇層，蒸干，殘?jiān)眉状级ㄈ葜?0 mL，混勻即可。按照薄層色譜法(《中國藥典》2015年版四部 通則0502)實(shí)驗(yàn)，吸取上述溶液5 μL于硅膠G板上，使成條點(diǎn)狀，以正丁醇-乙酸丁酯-水(4 ∶1 ∶5,上層)為展開劑、展開，取出晾干，噴以10%硫酸乙醇容液，在105 ℃下加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。

1.2.4水分測定 取本品粉末(過二號篩)2 g，精密稱定，按照《中國藥典》2015年版通則0832水分測定法(第二法 烘干法)測定。

1.2.5總灰分測定 取本品粉末2 g，置熾灼至恒重的坩堝中，稱定重量(準(zhǔn)確0.01 g)，按照《中國藥典》2015年版通則2302灰分測定法測定。

1.2.6醇溶性浸出物 取本品粉末(過二號篩)2 g，精密稱定，置100 mL的錐形瓶中，精密加乙醇50 mL，按照《中國藥典》2015年版四部通則2201浸出物測定法中醇溶性浸出物測定法熱浸法測定。

2 結(jié)果

2.1 三七花外觀性狀特征

通過對5批三七花的性狀進(jìn)行鑒別，該藥材的性狀鑒別特征：呈不規(guī)則的球形或半球形，直徑1～2 cm，一端具直伸或彎曲的總花梗、一端密集眾多花蕾；表面灰綠色，花梗短、纖細(xì)，基部具鱗片狀苞片，花萼5齒裂，花瓣5，氣清香，味微苦、甘。如圖1所示。

圖1 三七花(批號20160908)性狀Fig.1 Medicinal herbs of flower buds of Panax notoginseng (lot number 20160908)

2.2 顯微鑒別

5批樣品共有特征如圖2所示，三七花粉末黃綠色，氣孔在表皮細(xì)胞中呈不定式；導(dǎo)管有多為螺紋、少見梯紋，直徑5～20 μm；花粉粒呈圓球形，直徑13～30 μm，外壁有疣狀雕紋，3個萌發(fā)孔；非腺毛甚多，單細(xì)胞或多細(xì)胞，長29～138 μm；表皮細(xì)胞呈類圓形，排列緊密；樹脂道呈黃色；花冠頂端表皮細(xì)胞呈乳頭狀短絨毛突起。

注：1為氣孔，2為導(dǎo)管，3為花粉粒，4為非腺毛，5為表皮細(xì)胞，6為樹脂道，7為花冠頂端碎片。圖2 三七花粉末顯微特征Fig.2 Microscopic characteristics for powder of flower buds of panax notoginseng

2.3 薄層鑒別

2.3.1色譜條件和系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn) 分別考察了樣品的不同提取方法和不同展開條件，根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終確定了1.3.3的薄層色譜鑒別方法。利用該方法對3批三七花樣品進(jìn)行分析，結(jié)果如圖3所示。在供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，且各斑點(diǎn)分離度好。

注：1～3為3批三七花藥材，4為對照藥材。圖3 三七花薄層色譜鑒別系統(tǒng)適用性實(shí)驗(yàn)Fig.3 Applicability test of TLC system of flower buds of panax notoginseng

2.3.2硅膠板對三七花TLC鑒別圖的影響 按照擬定的薄層色譜鑒別方法，分別考察了3個廠家硅膠G板的展開效果。結(jié)果見圖4。從3個品牌的硅膠G板實(shí)驗(yàn)可知，青島海洋與青島鼎康品牌的硅膠G板斑點(diǎn)更清晰，建議用青島海洋與青島鼎康品牌的硅膠G板鑒定三七花。

注：1～3為3批三七花藥材，4為對照藥材；A為青島海洋硅膠G板，B為煙臺江友黃海硅膠G板，C為青島鼎康硅膠G板。圖4 不同廠家硅膠板的三七花TLC鑒別圖Fig.4 TLC of different manufacturers' silicone plates of flower buds of panax notoginseng

2.3.3展開濕度對三七花TLC鑒別圖的影響 為了考察相對濕度對該方法的影響，利用不同濃度硫酸調(diào)整濕度為30%、50%、70%，考察不同濕度條件下的展開效果。結(jié)果如圖5所示，不同濕度下色譜圖的條帶清晰，均能較好的鑒別三七花，說明該方法受濕度的影響不明顯。

注：1～3為三七花樣品，4為對照藥材；A為70%，B為50%，C為30%。圖5 不同展開濕度下三七花TLC鑒別圖Fig.5 TLC of different unfolding humidity of flower buds of panax notoginseng

2.3.4展開溫度對三七花TLC鑒別圖的影響 為了考察不同溫度分別在10 ℃、25 ℃、35 ℃下展開，考察不同溫度對展開的影響。結(jié)果如圖6所示，不同溫度下色譜圖的條帶清晰，均能較好的鑒別三七花，說明該方法受溫度的影響不明顯。

注：1～3為三七花樣品，4為對照藥材；A為10 ℃，B為25 ℃，C為35 ℃。圖6 不同展開溫度下三七花TLC鑒別圖Fig.6 TLC of different unfolding temperature of flower buds of panax notoginseng

2.3.5穩(wěn)定性考察 將同一批次的本品粉末于放置當(dāng)日、放置1、2和3 d時，按擬定的方法制備供試品溶液，分別點(diǎn)于同一硅膠G板上，展開、顯色，結(jié)果如圖7所示。各條帶無明顯差異，說明樣品的穩(wěn)定性良好。

注：1為當(dāng)天，2為放置1 d，3為放置2 d，4為放置3 d；5為對照藥材。圖7 供試品溶液穩(wěn)定性考察TLC圖Fig.7 TLC diagram of the stability of the test sample

2.3.6不同批次三七花樣品薄層色譜鑒別 按照擬定的薄層色譜鑒別方法，對5批樣品進(jìn)行測定，結(jié)果如圖8所示。5批樣品中各條帶無明顯差異，進(jìn)一步說明本方法專屬性強(qiáng)，可有效鑒別三七花。

注：1～5為批號順序如表1所示，6為對照藥材。圖8 不同批次三七花TLC鑒別圖Fig.8 TLC of different batches of flower buds of panax notoginseng

2.4 不同批次三七花樣品水分、總灰分和醇溶性浸出物的差別

根據(jù)1.3.4項(xiàng)、1.3.5項(xiàng)和1.3.6項(xiàng)下方法，對5批三七花進(jìn)行水分、總灰分和醇溶性浸出物測定。結(jié)果如表2所示，水分含量范圍是8.41%～10.8%，平均含量為9.63%；總灰分含量范圍是6.96%～7.95%，其平均含量是7.41%；醇溶性浸出物范圍是25.38%～34.12%，平均值含量為30.93%。

表2 不同批次三七花的水分、總灰分、醇溶性提取物測定結(jié)果/%Tab.2 Results of moisture, total ash, and alcohol soluble extracts flower buds of panax notoginseng in different batches/%

3 討論

三七花是一種具有廣泛藥理活性和應(yīng)用價值的名貴中藥，不僅可入藥, 還可用作食品、保健品加工原料, 其對治病和養(yǎng)生都有一定益處。魏莉等[14]使用高效液相色譜法和比色法證明了三七花中某些有效成分受產(chǎn)地、生長年限等因素的影響，使得它的質(zhì)量不一；同時三七花資源有限，價格相對較貴，市場上存在摻假現(xiàn)象導(dǎo)致三七花的質(zhì)量參差不齊，這不僅會造成臨床用藥療效不穩(wěn)定，更給臨床用藥安全帶來潛在危害。目前對于三七花的質(zhì)量控制國家沒有統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，只有少數(shù)省份收納并制定了各自的標(biāo)準(zhǔn)，但它們的檢測項(xiàng)目及其控制的限度各有不同。

本實(shí)驗(yàn)中增加三七花的顯微鑒別，通過對多批三七花樣品進(jìn)行顯微鑒別實(shí)驗(yàn)，選擇了它們的共有特征作為顯微鑒別的指標(biāo)；同時使用TLC對樣品進(jìn)行了鑒別實(shí)驗(yàn)，通過對三七花樣品多種提取處理方法和TLC展開條件的考察，在最終確定實(shí)驗(yàn)條件下發(fā)現(xiàn)TLC得到的斑點(diǎn)明顯、分離度好、色譜帶清晰，并且在TLC耐用實(shí)驗(yàn)中對薄層色譜板廠家、展開濕度、展開溫度、樣品穩(wěn)定性進(jìn)行了考察，發(fā)現(xiàn)在考察的薄層色譜板廠家中用青島海洋與青島鼎康品牌的硅膠G板鑒定三七花展開效果好，在確定的方法中樣品穩(wěn)定性好，展開效果受溫度、濕度影響小，說明該方法具有較好耐用性和穩(wěn)定性。但目前缺少權(quán)威的三七花對照藥材，所以如何使TLC進(jìn)行三七花鑒別更科學(xué)、可靠、合理仍然有待深入研究。 雖然三七花的真?zhèn)舞b別很重要，但是其品質(zhì)的優(yōu)劣對于藥效的發(fā)揮也至關(guān)重要，三七花的水分，總灰分及醇溶性浸提物的多少是影響品質(zhì)的主要指標(biāo)，所以控制好這些指標(biāo)對于三七花的質(zhì)量控制至關(guān)重要。本實(shí)驗(yàn)中對5批經(jīng)鑒定為三七花的樣品進(jìn)行了水分，總灰分及醇溶性浸提物的測定，它們?yōu)樘岣呷呋ǖ馁|(zhì)量控制方法提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)，可用于建立三七花的質(zhì)量評價標(biāo)準(zhǔn)，對于保證其質(zhì)量具有重要意義。