杜仲膠生物合成機制研究進展

徐鈺涵，任園園，呂玉紅，李 澳，岳昌武，屈漢林，王伊璠，馬瑞晨

(延安市微生物藥物創(chuàng)新及轉(zhuǎn)化重點實驗室， 延安大學(xué)醫(yī)學(xué)院， 陜西 延安 716000)

中國每年消費的天然橡膠量高達500萬噸，位列全球首位。以順式聚異戊二烯為主要成分的三葉橡膠是工業(yè)用天然橡膠的主要原料，但目前我國天然三葉橡膠年產(chǎn)量僅為80萬噸，難以滿足國內(nèi)需求，嚴重依賴于國外橡膠進口，因而開發(fā)三葉橡膠的可替代資源刻不容緩。杜仲(EucommiaulmoidesOliver.)是在我國廣泛分布、具有重要的藥用價值的特有珍稀野生藥用物種和經(jīng)濟植物資源[1]。研究發(fā)現(xiàn)，在杜仲植物的果實、樹皮、葉和根中均含有豐富的結(jié)構(gòu)為反式聚異戊二烯的杜仲膠(EucommiaulmoidesOliver. gum)[2]。與三葉橡膠相比，杜仲膠具有“橡塑二重性”的特性[3]，即杜仲膠在室溫時為無色或略帶雜色的皮革狀堅韌物質(zhì)，具有可塑性，10℃時為晶體，當(dāng)加熱到40℃左右時杜仲膠開始表現(xiàn)出彈性，繼續(xù)加熱到100℃時軟化，冷卻后可恢復(fù)原來的性質(zhì)。基于杜仲膠的熱塑性、熱彈性和橡膠彈性等優(yōu)點[4]，可利用杜仲膠作為原料開發(fā)出各種新式材料，在軍工、航空、運輸工具、通訊、電力、醫(yī)療、建筑工程、體育賽事等方面由著極大應(yīng)用前景。然而，與成熟的三葉橡膠工業(yè)相比，現(xiàn)階段杜仲膠的產(chǎn)量過低而生產(chǎn)成本相對過高，這在很大程度上制約了杜仲膠的應(yīng)用和產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。通過對植物體內(nèi)杜仲膠生物合成代謝途徑和分子調(diào)控機制的解析，為科學(xué)家研究杜仲膠產(chǎn)量提高以及改性提供思路，為杜仲膠的工業(yè)化發(fā)展提供借鑒。例如，以杜仲膠生物合成代謝途徑中的關(guān)鍵酶作為切入點，將相關(guān)基因在杜仲體內(nèi)過量表達或抑制表達，從而使杜仲膠的含量提高，或通過向杜仲體內(nèi)轉(zhuǎn)入其他物種的產(chǎn)膠相關(guān)基因以實現(xiàn)對杜仲膠的改性。

1 杜仲膠

杜仲膠是平均分子量為160000～173000的化學(xué)結(jié)構(gòu)為反式聚異戊二烯的長分子鏈生物大分子(圖1)。杜仲膠長鏈分子結(jié)構(gòu)有序、易堆砌結(jié)晶。杜仲膠的晶型有α-晶型和β-晶型兩種，二者的熔融溫度峰值分別為62℃與52℃[5]。杜仲膠的有序分子鏈中含有大量的不飽和碳-碳雙鍵，可以在一定條件下對其進行逐步硫化，工業(yè)上可充分利用杜仲膠獨有的硫化過程這一特性對杜仲膠進行加工利用[6]。

圖1 杜仲膠與天然橡膠化學(xué)結(jié)構(gòu)單元Fig.1 Structural units of E. ulmoides gum and India rubber

杜仲不同部位的細胞合成杜仲膠的能力不同。杜仲的含膠細胞是一種體積較小、絲狀的、兩端膨大的單細胞，在其內(nèi)完成了杜仲膠的生物合成和貯存[7]，且廣泛存在于杜仲樹皮的韌皮部、各級葉脈的韌皮部、部分薄壁組織以及葉片的海綿組織中[8]。含膠細胞完成杜仲膠的生物合成后，由于細胞內(nèi)空間狹小，新合成的杜仲膠分子只能在細胞內(nèi)整齊、密集而緊湊的排列在一起，沒有交織卷曲現(xiàn)象，形成多個結(jié)晶區(qū)。含膠細胞內(nèi)杜仲膠大分子鏈之間存在著低范德華力，膠絲互不干涉交織，沒有水濕潤性以及黏性，可以在拉伸和彎曲時自由運動、獨立伸長。杜仲膠的聚合量與杜仲細胞的的生長具有一致性，杜仲膠的聚合度會隨著杜仲植物體的生長發(fā)育、杜仲分泌細胞的延長而不斷升高，分子量可達30萬以上。

2 杜仲膠生物合成機制

杜仲膠的分子結(jié)構(gòu)為反式聚異戊二烯(Trans-1,4-polyisoprene，TPI)，杜仲細胞通過2-C-甲基-D-蘚醇-4-磷酸(2-C-Methyl-D-erythritol-4-phosphate，MEP)途徑或甲羥戊酸(Mevalonate，MVA)途徑生成前體物質(zhì)異戊烯焦磷酸(Ispentenyldiphosphate，IPP)。部分IPP 在異戊烯基焦磷酸異構(gòu)酶(Isopentenyl diphosphate isomerase，IDI)的作用下轉(zhuǎn)化為其同分異構(gòu)體DMAPP。不同分子數(shù)的IPP與DMAPP在異戊烯轉(zhuǎn)移酶(Prenyltransferase)的作用下聚合縮合生成起始物香葉基二磷酸(Geranyl diphosphate，GPP)、法呢基二磷酸(Farnesyl diphosphate，F(xiàn)PP)、香葉基香葉基二磷酸(Geranylgeranyl diphosphate，GGPP)[9]。這些起始物在萜類合酶(Terpenesynthases，TPS)的作用下生成TPI，但是起始物到TPI的具體生物合成步驟尚不明確。TPI在細胞質(zhì)中以顆粒狀態(tài)積累，并且顆粒之間形成有膜狀物，最后TPI顆?；ハ嘟蝗冢w粒間的膜狀物消失，直到整個含膠細胞被TPI充滿，形成纖維狀的TPI，即為杜仲膠[10]。

2.1 前體物IPP的生物合成

MVA途徑(圖2)以2個乙酰輔酶A分子(Acetyl-CoA)為起始底物，利用乙酰輔酶A-乙?；D(zhuǎn)移酶(Acetyl-CoA-C-acetyltransferase，AACT)、羥甲基戊二酸輔酶A(Hydroxymethylglutaryl-CoA synthase，HMGS)、羥甲基戊二酸輔酶A還原酶(Hydroxymethylglutaryl-CoA reductase，HMGR)、甲羥戊酸激酶(Mevalonate-kinase，MK)、5-磷酸甲羥戊酸激酶(5-Phosphomevalonate kinase，PMK)、4-羥基-3-甲基-2-苯基二磷酸還原酶(4-Hydroxy-3-methylbut-2-enyldiphosphate reductase，HDR)等酶進行一系列生化反應(yīng)生成IPP。

MEP途徑(圖2)以丙酮酸和甘油醛-3-磷酸為起始底物，利用1- 脫氧-D-木酮糖-5-磷酸合酶(1-Deoxy-D-xylulose-5-phosphate synthase，DXS)、脫氧木酮糖磷酸鹽還原異構(gòu)酶(1-Deoxy-D-lxylulose-5-phosphate reductoisomerase，DXR)、2-C-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸胞苷基轉(zhuǎn)移酶(2-C-Methyl-D-erythritol-4-phosphate cytidylyltransferase，MCT)、4-二磷酸胞苷-2-C-甲基赤蘚糖激酶(4- Diphosphocytidyl-2-C-methyl-D-erythritolkinase，CMK)、2-甲基赤蘚糖-2,4-環(huán)二磷酸合酶(2-C-Methyl-D-erythritol 2,4-cyclodiphosphate synthase，MCS)、1-羥基-2-甲基-2-(E)-丁烯基-4-二磷酸合酶【1-Hydroxy-2- methyl-2-(E)-butenyl-4-diphosphate synthase，HDS】，異戊烯基單磷酸激酶(Isopentenyl monophosphate kinase，IPK)等酶進行一系列生化反應(yīng)生成IPP。

2.2 杜仲膠的縮合聚合

IPP與DMAPP形成之后，不同分子數(shù)的IPP與DMAPP進行縮合聚合。1分子IPP與1分子DMAPP在香葉基二磷酸合酶(Geranyl diphosphate synthase，GPPS/GPS)的作用下經(jīng)過縮合生成GPP。2 分子 IPP 和 1 分子DMAPP 在法呢基二磷酸合酶(Farnesyl diphosphate synthase，F(xiàn)PPS/FPS)的作用下生成FPP。3分子IPP 和1分子 D M A P P在香葉基香葉基二磷酸合酶(Geranylgeranyl diphosphate synthase，GGPPS/GGPS)的作用下生成GGPP。

杜仲膠生物合成過程如圖2。

圖2 杜仲膠生物合成過程Fig. 2 Biosynthesis process of E. ulmoides gum

2.3 杜仲膠生物合成的關(guān)鍵酶

HMGR：HMGR為MVA 途徑中的第一個限速酶。杜仲HMGR蛋白定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上，該酶控制的反應(yīng)為不可逆反應(yīng)，具有調(diào)控靶點的重要作用[11]。荊騰認為HMGR的過量表達利于異戊二烯的積累且對GGPS、FPS、GPS等基因的表達具有幫助作用[12]。

FPPS：FPPS是杜仲膠生物合成途徑分支點的關(guān)鍵酶，F(xiàn)PS催化生成的FPP為重要中間產(chǎn)物[13]。王淋提出杜仲Ⅱ類FPS基因在杜仲膠的合成中起重要作用[14]。Suzuki等通過特定實驗證明FPS2和FPS4基因是具有FPS功能的，可能是短鏈合成相關(guān)的基因，即FPS2、FPS4對短鏈TPI的合成具有重要作用[15]。趙丹通過試驗證明轉(zhuǎn)杜仲FPS基因的含膠細胞含膠量多于對照組[16]。

SRPP：小顆粒橡膠蛋白(Small particle rubber protein，SRPP)。Nawamawat等認為橡膠顆粒的膜表面帶有負電荷，互相排斥，橡膠顆?？梢匀诤显谝黄鹗且驗镾RPP起到穩(wěn)定的作用[17]。然而，劉惠敏認為杜仲橡膠顆粒并不會相排斥，SRPP起到參與杜仲膠合成的作用，并且SRPP與杜仲膠合成酶FPS2共同合成杜仲膠[18]，這與Wu-Yun等的發(fā)現(xiàn)一致[19]。

REF：橡膠延伸因子(Rubber elongation factor，REF)天然橡膠合成過程中發(fā)揮著重要作用。Jin等認為REF3可能參與了杜仲橡膠顆粒膜的穩(wěn)定性[20]。楊署光等發(fā)現(xiàn)巴西橡膠REF的表達水平與膠產(chǎn)量呈現(xiàn)高相關(guān)性，這為杜仲REF在杜仲膠生物合成中的相關(guān)性研究提供借鑒[21]。

3 展 望

杜仲膠生物合成過程較為復(fù)雜，研究發(fā)現(xiàn)至少有10余種酶類參與了這一過程，目前對研究較多、功能較為明晰的幾個關(guān)鍵酶及其相應(yīng)編碼基因的研究進展進行了回顧。此外，有相關(guān)研究推測ACCT2、DXS2、GGPS6等基因?qū)Χ胖倌z生物合成亦有重要作用。杜仲膠生物合成的過程中miRNA的調(diào)控作用也必不可少，葉靖等[22]證明了杜仲n-eu-miR15對其靶基因GGPS6的負調(diào)控作用。種種跡象表明杜仲膠生物合成并不是單一的直鏈過程，而是由多種途徑以及相關(guān)因子共同作用的結(jié)果。

研究發(fā)現(xiàn)，包括微生物在內(nèi)的很多物種體內(nèi)都存在著完全或不完全的合成杜仲膠的重要中間產(chǎn)物IPP的次級代謝途徑，本課題組曾從多株海洋來源的鏈霉菌基因組中發(fā)現(xiàn)了參與XIAMYCIN生物合成的XIA基因簇可以通過MEP途徑產(chǎn)生IPP[23]。隨著轉(zhuǎn)基因技術(shù)水平的提高，研究人員對杜仲膠生物合成的過程了解的更為透徹，從而使我們更加全面地達到調(diào)控杜仲膠合成的目的。例如可以考慮將XIA基因簇導(dǎo)入杜仲膠合成細胞，通過植物細胞工程技術(shù)，可望實現(xiàn)工廠化體外杜仲膠的生物合成。同樣的，將杜仲膠合成細胞中合成IPP下游的基因?qū)牒蠭PP合成的上游基因的微生物體內(nèi)也有望實現(xiàn)杜仲膠的體外工廠化生產(chǎn)。此外，利用基因組編輯技術(shù)，定點敲除杜仲膠合成負調(diào)控基因，高表達其限速反應(yīng)的關(guān)鍵基因等也促進杜仲膠產(chǎn)量的提高。總之，隨著科學(xué)研究的進一步深入以及以現(xiàn)代組學(xué)為代表的次級代謝相關(guān)技術(shù)的不斷提高，杜仲膠的生物合成機制終會被研究的更加透徹，從而可能實現(xiàn)工廠化大規(guī)模的杜仲膠生產(chǎn)。