基于代謝組學(xué)的錳毒性作用機(jī)制分析

陳 健 朱 馴

(鹽城工業(yè)職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇 鹽城 224005)

隨著現(xiàn)代工業(yè)化的迅速發(fā)展，過多排放廢棄物以及重金屬，環(huán)境變得越來越糟糕。金屬(重金屬)因其有毒性和對(duì)環(huán)境具有強(qiáng)烈的生物富集作用而成為最嚴(yán)重的環(huán)境污染物類型之一。金屬離子可以通過不同的途徑緩慢積累在植物和動(dòng)物體內(nèi)，以不同的方式移動(dòng)和循環(huán)，從而影響動(dòng)物的食品安全。且其一旦進(jìn)入人體，就會(huì)傷害人體的健康。人體的健康和公共衛(wèi)生與食品安全有著密切的聯(lián)系。食品安全也一直是政府工作的重心。

以各種化學(xué)狀態(tài)或化學(xué)形態(tài)存在的重金屬在進(jìn)入環(huán)境或生態(tài)系統(tǒng)后會(huì)存留、積累和遷移，造成危害。錳是哺乳動(dòng)物和許多小型生物的必需營養(yǎng)元素，但它進(jìn)入環(huán)境后會(huì)使環(huán)境的正常組成和性質(zhì)發(fā)生變化，直接或間接有害于人類生存或造成自然生態(tài)環(huán)境衰退。長期接觸錳會(huì)直接損害人體內(nèi)的神經(jīng)中樞或?qū)е旅庖呦到y(tǒng)等產(chǎn)生有害因素，并通過周圍循環(huán)進(jìn)入大腦，最終會(huì)導(dǎo)致神經(jīng)出現(xiàn)功能障礙。

錳產(chǎn)生毒性作用有很多原因，其容易感染的人群廣泛。因此錳的毒性作用和慢性低水平錳的暴露問題成為公共衛(wèi)生普遍關(guān)注的問題。在此次的探討中，我們?cè)诤侠斫㈠i中毒模型后，將高通量蛋白質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)分析用于全面分析錳中毒期間人體蛋白質(zhì)和小于500的分子的代謝變化。同時(shí)也對(duì)于代謝通路的改變情況實(shí)施了探討，以期能夠?qū)﹀i中毒進(jìn)行早期判斷和診治，還為動(dòng)態(tài)性檢測的實(shí)施等工作提供更為可靠的理論依據(jù)。

1 基于代謝組學(xué)的錳毒性作用機(jī)制分析

1.1 材料與方法

1.1.1 實(shí)驗(yàn)儀器和試劑

高溫高速離心機(jī)，超高效液相色譜儀5600+質(zhì)譜儀，真空冷凍干燥機(jī)，甲酸色譜柱，乙腈，氟化銨，甲醇。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)方法

實(shí)驗(yàn)選取兩月大、體積為220 g的30只雄性老鼠，并均無特定病原體。把這些老鼠隨機(jī)劃分成兩個(gè)組：試驗(yàn)組和對(duì)照組。其中，在試驗(yàn)組使用2個(gè)重復(fù)性的方式，一個(gè)重復(fù)中用掉10只老鼠。整個(gè)測試周期為5周，建立大鼠錳中毒模型。試驗(yàn)結(jié)束時(shí)，使用抗凝劑從股動(dòng)脈中收集血液，在4 ℃下以2 000 G離心10分鐘，并將血漿迅速儲(chǔ)存在液氮中，最后一起轉(zhuǎn)入-80 ℃的冰箱保存，并用于代謝組學(xué)的分析。從不同的樣本中各取30 μL并將其混合成質(zhì)控樣本。質(zhì)控樣本用來均衡液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用系統(tǒng)及放置樣品前檢查儀器狀態(tài)，以及評(píng)估系統(tǒng)穩(wěn)定性。

1.1.3 樣本預(yù)處理

從每個(gè)樣本中各取100 μL，再添加提前預(yù)冷的甲醇或者乙腈，并且來回?fù)u晃均勻，在-20 ℃條件下放置10 min；然后采用4 ℃ 2 000 G的條件下進(jìn)行10 min 的離心處理，再抽取380 μL的上清液，通過原位真空凍干獲得凍干粉末，并儲(chǔ)存用于隨后的分析。如上所述準(zhǔn)備質(zhì)量控制樣品，用來評(píng)估系統(tǒng)在整個(gè)試驗(yàn)過程中的穩(wěn)定性。抽取乙腈水溶液100 μL加入制備的凍干粉樣本中，來回?fù)u晃，進(jìn)行復(fù)溶，離心后(4 ℃，14 000 G，15 min)，收集上清液用于測量離子質(zhì)荷比的分析。

1.1.4 色譜-質(zhì)譜(LC-MS)分析

隨著年齡增長，自然老化或光老化都會(huì)造成皮膚生物黃色素的堆積，其中年齡與脂褐素含量的關(guān)系早有報(bào)道[20]。隨著年齡增長，脂褐素會(huì)在人體細(xì)胞內(nèi)逐漸沉積，不僅影響皮膚顏色，而且能夠通過擠占細(xì)胞空間位置，影響細(xì)胞正常功能。隨著年齡增長，對(duì)脂褐素的清除能力降低，進(jìn)一步造成脂褐素沉積。

1.1.4.1 色譜條件

色譜條件是：進(jìn)樣量2 μL、流速300 μL/min、柱溫25 ℃，借助于反相UHPLC對(duì)樣本實(shí)施進(jìn)一步的分離處理。正離子模式的流動(dòng)相組成(HSS T3色譜柱)為A液：0.1%formic acid+99.9%water，B液：0.1% formic acid+99.9% ACN；負(fù)離子模式流動(dòng)相組成A液：0.5mM ammonium fluoride+water，B液：CAN。

為了防止儀器出現(xiàn)問題，順機(jī)持續(xù)分析放在4 ℃的自動(dòng)進(jìn)樣器中的樣本，為了提高數(shù)據(jù)測試中的可靠性，在分析樣品的過程中，每5個(gè)樣品中放一次質(zhì)量控制樣品，它的主要的作用是用來評(píng)價(jià)和檢驗(yàn)系統(tǒng)的穩(wěn)定

1.1.4.2 質(zhì)譜條件

使用分離儀器處理樣品后，在質(zhì)譜儀上使用電噴霧，正電和負(fù)離子模式條件進(jìn)行質(zhì)譜分析。在通過全掃描獲取主要質(zhì)譜圖的同時(shí)，使用依賴于數(shù)據(jù)的采集模式和高靈敏度模式獲取次要質(zhì)譜圖。

為了防止儀器出現(xiàn)問題，順機(jī)持續(xù)分析放在4 ℃的自動(dòng)進(jìn)樣器中的樣本，為了提高數(shù)據(jù)測試中的可靠性，在分析樣品的過程中在每5個(gè)樣品中放一次質(zhì)量控制樣品，它的主要的作用是用來評(píng)價(jià)和檢驗(yàn)系統(tǒng)的穩(wěn)定性。

1.1.5 數(shù)據(jù)處理

使用XCMS程序可以有效地提取原始數(shù)據(jù)的相應(yīng)峰面積，并將其轉(zhuǎn)換格式，同時(shí)保留時(shí)間校正和峰對(duì)齊；此外，如何以準(zhǔn)確的質(zhì)量匹配二次光譜取決于代謝物。排除并歸一化該組中丟失的離子峰，然后使用多統(tǒng)計(jì)分析(例如，監(jiān)督主成分分析)，并使用各種一維統(tǒng)計(jì)分析方法。例如，借助軟件編程語言，可以進(jìn)行火山圖分析和變分多元分析。最后，查到與錳的有毒性有關(guān)的對(duì)機(jī)體穩(wěn)態(tài)平衡產(chǎn)生干擾的代謝產(chǎn)物。

1.1.6 代謝物鑒定和通路分析

根據(jù)檢測所有帶電離子的質(zhì)荷比和強(qiáng)度，以及分析所形成的子離子的質(zhì)荷比和強(qiáng)度。使用METLIN數(shù)據(jù)庫來識(shí)別不容易發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞生長增殖有關(guān)的標(biāo)志物。通過搜索METLIN，KEGG，HMDB，LIPIDMAPS，MassBank和Chemspider來搜索難以找到的生物體征。使用更準(zhǔn)確的分子量或MS片段模式數(shù)據(jù)和文獻(xiàn)來搜索確定影響的代謝途徑，從而進(jìn)行準(zhǔn)確的生物學(xué)解釋。

2 結(jié)果與分析

2.1 各組血漿樣本的典型代謝譜圖

代謝組學(xué)數(shù)據(jù)在對(duì)分析方式的穩(wěn)定中起著非常重要的作用。在該實(shí)驗(yàn)中，使用了混合均勻的質(zhì)控樣品。質(zhì)控樣品作為真實(shí)樣品處理，質(zhì)控樣品在正的負(fù)的離子批處理過程中每5個(gè)樣品插入一次，用來評(píng)價(jià)和檢驗(yàn)系統(tǒng)的穩(wěn)定。質(zhì)控樣品應(yīng)包括相似的色譜峰形狀，分離度，保留時(shí)間和響應(yīng)強(qiáng)度分布。比較了檢測過程中質(zhì)控樣品的UHPLC-Q-TOF MS總離子流色譜圖。圖1顯示色譜峰的保留時(shí)間和響應(yīng)強(qiáng)度是一致的，并且峰基本重疊在一起的。它很穩(wěn)定，幾乎沒有因設(shè)備引起的錯(cuò)誤。

圖1 QC樣品正(a)、負(fù)(b)離子模式TIC重疊圖譜

使用XCMS軟件提取代謝物離子峰，一共有17 917 個(gè)離子峰，其中陽離子的模式提取到了12 793個(gè)離子，陰離子的模式提取了5 120個(gè)。這主要用于進(jìn)一步處理從每個(gè)樣品中提取的峰，分析后可以得出結(jié)論，樣品a屬于緊密簇(見圖2)。這反映出儀器分析系統(tǒng)的高度穩(wěn)定性以及有效解釋樣品之間生物學(xué)差異的能力。

本研究應(yīng)用非靶向代謝組學(xué)研究慢性錳暴露對(duì)血漿代謝的影響。與常規(guī)高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用相比，它擁有更高的靈敏度、峰值和分離度，因此適合代謝組學(xué)研究。分析給出了每個(gè)樣品的典型圖，相關(guān)情況如圖3所示。根據(jù)實(shí)驗(yàn)條件，對(duì)照樣品和實(shí)驗(yàn)樣品的光譜基本相似，峰形良好，峰彼此分離。這表明在這項(xiàng)研究中使用的色譜和質(zhì)譜條件適合確定樣品。

圖2 正離子(a)、負(fù)離子(b)模式下樣本的PCA得分圖

圖3 對(duì)照組和錳處理組中血漿樣品的正離子(a)、負(fù)離子(b)模式 TIC 譜

2.2 歸一化處理

歸一化過程可確保代謝組學(xué)數(shù)據(jù)的精確和完整，并降低系統(tǒng)上或技術(shù)上的錯(cuò)誤概率。同樣，代謝物的濃度通常在數(shù)量級(jí)上，這可能導(dǎo)致對(duì)代謝物的錯(cuò)誤識(shí)別，并發(fā)生很大的變化，我們除去代謝產(chǎn)物超過了50%的缺失值；對(duì)數(shù)轉(zhuǎn)換后通過Pareto標(biāo)準(zhǔn)化代謝物表達(dá)水平，應(yīng)用縮放方法篩選具有生物學(xué)和統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的重要代謝物。歸一化后，每組樣品的正離子和負(fù)離子模式數(shù)據(jù)均顯示正態(tài)分布(圖4)。

(a)

2.2.1 主成分剖析(PCA)

為了確定兩組血漿的代謝產(chǎn)物譜中是否存在任何特定差異，采用無監(jiān)督方法在兩種離子模式下評(píng)估了實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組的分辨率。處理所有代謝物后，我們觀察了所有樣品總體上的分布趨勢，從組內(nèi)外之間的區(qū)別，并線性組合以查找可能的離散點(diǎn)。在PC1和PC2尺寸上，正離子模式的變異性的指數(shù)為31.9%(圖5a)，負(fù)離子模式的變異性的總體指數(shù)為26%(圖5b)。在2D評(píng)分圖中，兩組之間的分離趨勢略微但微不足道。這表明對(duì)照組與血漿譜有著很大的變化，無明顯變化。

(a)

2.2.2 偏最小二乘判別分析

為了用于區(qū)分對(duì)照組和錳處理組的離子峰，本研究構(gòu)建了用于監(jiān)督的偏最小二乘判別分析模型。與模型實(shí)現(xiàn)相比，模型更加關(guān)注實(shí)際的分類差異。這是一種用于監(jiān)控判別分析的統(tǒng)計(jì)技術(shù)。主成分分析的思想主要是將高維數(shù)據(jù)降為低維數(shù)據(jù)，俗稱“降維”。以最大化不同組之間的分離，然后進(jìn)行監(jiān)督分析，以最大化代謝物的分離和鑒別，可以預(yù)測樣品的相應(yīng)類別。通常，可變的投影重要性被用作幫助篩選標(biāo)記代謝物的標(biāo)準(zhǔn)。從得分表可以得出結(jié)論，錳處理組和對(duì)照組在正離子和負(fù)離子兩種成分模式下存在明顯差異。這可以反映出該模型是非?？煽亢涂深A(yù)測的。兩個(gè)得分圖顯示，正離子和負(fù)離子模式傾向于將對(duì)照組和錳處理組分開，并且錳暴露改變了有些代謝產(chǎn)物的水準(zhǔn)(圖6)。

(a)

2.2.3 單變量統(tǒng)計(jì)分析

單變量分析經(jīng)常使用的方式是T檢驗(yàn)和分析圖；該方法通常篩選FC>2.0和P<0.05的潛在標(biāo)記代謝物。圖7顯示了對(duì)照組和錳處理組的正離子和負(fù)離子形式的相關(guān)數(shù)據(jù)的火山圖?；尹c(diǎn)代表通過單變量統(tǒng)計(jì)分析選擇的差異性代謝產(chǎn)物。

(a)

3 結(jié)論

由UHPLC-Q-TOF/MS為基礎(chǔ)的非靶向代謝組學(xué)技術(shù)為探究錳誘導(dǎo)的代謝變化給出了不一樣的視角。確定了三十幾種與錳暴露相關(guān)聯(lián)的血漿代謝產(chǎn)物，其中十幾個(gè)表現(xiàn)出明顯上調(diào)的變化，而其他的二十幾種表現(xiàn)出明顯的下調(diào)。這些代謝產(chǎn)物通常涉及嘌呤，不同RCHNH2COOH和脂肪酸的代謝。錳如果暴露就會(huì)損害RCHNH2COOH、脂肪酸的代謝。

綜合上面所描述的，錳的神經(jīng)毒性機(jī)理為：錳是一種微量金屬，在維持正常的細(xì)胞功能和新陳代謝中起著重要的作用。但是，錳的過度積累會(huì)引起腦功能的退化，由此引起的神經(jīng)系統(tǒng)疾病稱為錳中毒。錳的毒性對(duì)氧化應(yīng)激，線粒體損傷，多巴胺能神經(jīng)元損傷和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激等方面都是有害的；錳進(jìn)入人體后會(huì)激活周圍的免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致周圍組織產(chǎn)生促炎因子信號(hào)。具有炎性的細(xì)胞因子通過轉(zhuǎn)運(yùn)和其他方法穿過血腦屏障，然后再進(jìn)入神經(jīng)系統(tǒng)，并引起神經(jīng)出現(xiàn)炎癥；錳暴露可直接在循環(huán)系統(tǒng)中產(chǎn)生ROS，破壞血漿與腦細(xì)胞之間的屏障和由脈絡(luò)叢形成的血漿和腦脊液之間的屏障，產(chǎn)生更多的Aβ；錳進(jìn)入腦中會(huì)引起大腦功能紊亂。除此之外，錳還可以在肝臟中富集，這可能會(huì)導(dǎo)致肝臟受損。