腸道菌群與腸道免疫相關(guān)研究進展

孫炘宸，趙晶晶，薛珊珊，吳擁軍*

(1.南京中醫(yī)藥大學，江蘇 南京 210029；2.南京中醫(yī)藥大學附屬醫(yī)院，江蘇 南京 210029)

0 引言

腸道菌群是寄居在腸道內(nèi)微生物群落的總稱，其種類豐富數(shù)量眾多，據(jù)統(tǒng)計定居于成年個體內(nèi)的微生物約有1014個，是自身細胞數(shù)的10倍左右[1]。由于其具有消化、代謝、免疫等多種功能，被諸多學者稱為虛擬器官。早在上世紀六十年代，GF(Germ-free)級動物模型的建立使得人們發(fā)現(xiàn)了腸道菌群有促進腸相關(guān)淋巴組織(gut-associated lymphoid tissues，GALTs)發(fā)生及成熟的作用[2,3]。腸道作為體內(nèi)最大的免疫器官，產(chǎn)生了全身近80%的抗體，大量研究表明腸道菌群失調(diào)與諸多疾病發(fā)病相關(guān)，而免疫系統(tǒng)則是重要的中間環(huán)節(jié)。探討腸道菌群和免疫系統(tǒng)的相互作用能解釋眾多生理和病理機制。近年來，腸道菌群與腸道免疫系統(tǒng)的研究取得了一定進展，現(xiàn)總結(jié)如下。

1 腸道菌群與腸道免疫系統(tǒng)發(fā)育的相關(guān)性

過去，學者多認為胎兒消化道處于無菌狀態(tài)，與外界接觸后微生物逐漸定植，至三個月左右逐漸形成一個較穩(wěn)定的群體[4]。近來有研究表明這一過程可能源于出生之前[5,6]，胎兒的菌群組成與羊水群落相似[7]。菌群對腸道免疫系統(tǒng)發(fā)育的影響主要體現(xiàn)在形成合適的腸道環(huán)境與促進GALTs發(fā)生及成熟兩個方面。嬰兒出生后的幾小時內(nèi)，大量需氧菌與兼性厭氧菌定植，影響腸道CD4+、CD8+T細胞的數(shù)量與活化狀態(tài)，改變了CD4亞群分布與腸道微結(jié)構(gòu)，并與母乳中的免疫球蛋白共同幫助嬰兒適應外界復雜的抗原環(huán)境[8]。同時創(chuàng)造相對無氧的環(huán)境，為厭氧菌的定植做好鋪墊[9]。出生后的1-7天，大量厭氧菌定植，腸道菌群數(shù)量呈爆炸式增長，在菌群的影響下，單核細胞與巨噬細胞不斷發(fā)育直至成熟，中性粒細胞數(shù)目到達峰值[10]。腸道菌群在多個方面影響著免疫系統(tǒng)的發(fā)育：如嬰兒斷乳后，在缺乏外來分泌性免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A，SIgA)的情況下，大腸埃希菌、雙歧桿菌等促進B細胞的成熟與免疫球蛋白的分泌[11,12]；某些微生物信號促進了調(diào)節(jié)性T細胞(regulatory T cell，Treg)及自然殺傷T淋巴細胞的發(fā)育[13]；腸道菌群通過誘導淋巴組織誘導細胞(lymphoid tissue inducers，LTi)，協(xié)助派伊爾結(jié)(Peyer's Patch，PP)、孤立淋巴濾泡、闌尾及腸系膜淋巴結(jié)的形成[14]等。有學者推斷，腸道菌群對于GALTs的正常發(fā)育一定程度上依賴其病原相關(guān)模式分子(pathogen-associated molecular patterns，PAMPs)與相應的模式識別受體(pattern recognition receptor，PRRs)結(jié)合并激活下游的信號通路，但具體機制尚不明了[15]。

2 腸道菌群與腸道免疫細胞的相互作用

2.1 T淋巴細胞

多種腸道菌群均可刺激T淋巴細胞產(chǎn)生免疫應答，協(xié)助其增殖與分化，并促進各細胞亞群分泌不同的細胞因子。腸道菌群對T淋巴細胞的影響主要體現(xiàn)在Treg和輔助T細胞(T helper cells,Th)兩方面，如梭狀芽孢桿菌促進Treg的增殖分化[16]，分節(jié)絲狀菌促進Th17的增殖分化[17]。此外菌群代謝生成的短鏈脂肪酸(SCFAs)，也可以促進Treg的形成[18]。Treg的主要作用是維持免疫耐受，防止對腸道菌群的過度免疫。多種腸道菌群均可增加Foxp3在CD4+Treg和CD25+Treg中的表達、促進IL-10生成，抑制髓系細胞和Th17的異?；罨乐惯^度免疫[19]。大鼠腸道菌群缺失會導致體內(nèi)RORγt+Treg細胞缺如。與菌群相關(guān)的Th亞群中以Th17的研究較多。研究表明，分節(jié)絲狀菌介導Th17的產(chǎn)生與分化是通過腸上皮細胞、ILC3和單核細胞等多種途徑互相作用實現(xiàn)的[20]。Th17主要功能是介導炎癥反應，分泌IL-17、IL-22等促炎癥因子[21]。Treg與Th17的功能相互制衡，二者的平衡對于維持腸道穩(wěn)態(tài)意義重大，腸道菌群在其中起到了一定的作用。

2.2 B淋巴細胞

腸道菌群對B細胞免疫的影響主要體現(xiàn)在其分泌免疫球蛋白的過程中。早年即有研究表明，腸道菌群缺乏會導致PPs發(fā)育不成熟，外周SIgA、SIgM水平降低[3]。此后研究發(fā)現(xiàn)其與B淋巴細胞相關(guān)。目前對此的研究大部分聚焦在SIgA上。菌群通過兩種途徑影響B(tài)淋巴細胞分泌SIgA：(1)T細胞依賴型主要發(fā)生在PPs中，多由致病菌引發(fā)。M細胞提呈微生物抗原至樹突狀細胞(Dendritic cells,DCs)，后者促使T淋巴細胞分化為濾泡輔助性T細胞(follicular helper T cell, Tfh)亞群。Tfh通過表達CD40L和IL-21，誘導B細胞表達胞嘧啶核苷脫氨酶并促進IgA的抗體類別轉(zhuǎn)換，產(chǎn)生高親和力SIgA[22-24]。(2)非T細胞依賴型主要發(fā)生在固有層與孤立淋巴濾泡，腸道菌群多激活此途徑。DCs通過Toll樣受體(Toll-like receptors，TLRs)感知菌群后產(chǎn)生B細胞激活因子與增殖誘導配體，誘導B細胞胞嘧啶核苷脫氨酶的表達，產(chǎn)生低親和力SIgA[22-24]。但機體如何識別不同細菌的機制仍未被發(fā)現(xiàn)。SIgA對菌群的影響表現(xiàn)在物理隔絕與調(diào)節(jié)免疫兩個方面：如隔絕微生物、保護免疫球蛋白、中和腸酶腸毒素；及激活局部免疫、抑制變態(tài)反應、形成免疫耐受等[25]。近年發(fā)現(xiàn)SIgA尚能直接調(diào)控細菌的基因表達[26]與影響菌群分布[27]。此外，亦有學者發(fā)現(xiàn)SIgM在致耐受的過程中也起到了重要的作用，其部分功能與SIgA相重合且其免疫效力要強于SIgA[28]。

2.3 DCs與巨噬細胞

二者均為髓系細胞。DCs是一種重要的抗原遞呈細胞，而巨噬細胞除了抗原遞呈作用外，還具有吞噬功能。過去，學者已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其表面的PRRs(主要是TLRs)能起到識別作用[29]。近年研究發(fā)現(xiàn)，DCs通過PRRs能夠識別腸道菌群中的微生物，激活MyD88和TRAM-TRIF信號通路[30]或通過上皮細胞NOD2蛋白激活NF-κB信號通路，分泌相關(guān)的細胞因子促進Treg的分化[31]。SCFAs則能夠上調(diào)DCs H3K4的三甲基化狀態(tài)，并誘導IL-6和IFN-β1的分泌從而激活自然殺傷(cNK)細胞[32]。腸道菌群還能通過影響CD103+DC，從而影響腸歸巢受體CCR9和整合素α4β7(α4β7-integrin)[33]。亦有研究發(fā)現(xiàn)，菌群通過DCs激發(fā)Mincle-Syk軸，幫助PPs中的細胞生成IL-17與IL-22[34]。

2.4 固有淋巴細胞(innate lymphoid cell,ILC)

ILC是呈現(xiàn)淋巴樣形態(tài)但無基因重排的抗原受體樣細胞[35]，分為ILC1、ILC2、ILC3三個亞群。其中cNK細胞、LTi細胞分屬ILC1與ILC3[36,37]。三類的功能分別與Th1、Th2、Th17有所類似[38]。其細胞毒與分泌細胞因子的功能需依賴于腸道菌群并受其調(diào)控[39]。菌群代謝物如視黃酸(RA)能夠幫助ILC1與ILC3從CCR7轉(zhuǎn)變?yōu)镃CR9進而遷移至腸道[40]。但具體的作用機制尚存在爭論，是近來的研究熱點。近來研究發(fā)現(xiàn)ILC3具備呈遞菌群相關(guān)抗原的能力并能夠抑制相應T細胞的活性[41]。說明ILC3的功能除了通過分泌相關(guān)細胞因子直接影響菌群，也可以通過適應性免疫系統(tǒng)促使菌群形成免疫耐受。

2.5 潘氏細胞

潘氏細胞是消化道特有的免疫細胞，能通過TLRs-MyD88信號通路直接感受菌群刺激，釋放防御素[42,43]。潘氏細胞被刪除的小鼠不能控制腸道共生菌與致病菌的侵入，說明潘氏細胞對于控制腸道菌群穩(wěn)態(tài)有著重要作用[44]。同時，腸道菌群通過表達去磷酸酶以去除細菌表面的負電荷，從而抵御防御素等陽離子抗菌類多肽的殺傷[45]，形成平衡。

3 腸道菌群對腸道屏障的作用

3.1 腸道菌群對腸道粘膜機械屏障的作用

腸道菌群與腸道上皮黏附形成生物性機械屏障。菌群通過競爭生存空間，占據(jù)結(jié)合位點來抑制致病菌，某些特定菌群還能產(chǎn)生細菌素等直接抑制或殺滅致病菌[46]。例如乳酸桿菌可通過分泌抗菌物質(zhì)、調(diào)節(jié)腸道pH等途徑抑制某些病原菌的定植[47]。腸道上皮表面亦有PRRs存在，當普通小鼠腸上皮受到損傷時，腸道菌群能夠快速識別TLRs，阻止腸上皮細胞受損并促進其分化增殖，其速率遠高于無菌小鼠[3,48]。菌群通過TLR2信號途徑能夠加固腸上皮連接，改變其通透性從而加強屏障功能[49]。此外，菌群還可根據(jù)腸道位置影響腸上皮細胞miRNA的表達[50]。

3.2 腸道菌群對腸道粘膜免疫屏障的作用

腸上皮細胞表面覆蓋著由杯狀細胞產(chǎn)生的黏液，這些黏液形成保護屏障，隔絕大部分細菌與腸道上皮的直接接觸[51]。不同部位黏液層的組成有一定差異，但其主要成分均為黏蛋白與抗菌物質(zhì)[52]。菌群通過PAMPs促進黏液分泌[53]。無菌小鼠[54]與抗生素暴露小鼠[55]腸道的杯狀細胞數(shù)量明顯減少，并且黏液層缺乏重要免疫分子，表明腸道菌群對黏液層的形成具有重要作用。腸道菌群代謝產(chǎn)生的SCFAs在低濃度下對黏液的分泌與黏蛋白MUCs2的表達起促進作用，在高濃度下起抑制作用[56]。

除了黏液的分泌外，腸上皮細胞在持續(xù)與微生物或其產(chǎn)物接觸后，也能直接產(chǎn)生多種抗菌肽[57]。菌群與上皮的黏附作用能夠刺激上皮細胞產(chǎn)生TNF-α，并激活腸上皮的TLRs和NODs[58]；同時誘導腸上皮細胞上調(diào)血清淀粉樣蛋白A的合成，激活固有層的DC細胞[59]。SCFAs刺激腸上皮細胞以GPR41和GPR43依賴性方式，激活ERK1/2和p38MAPK信號通路，從而產(chǎn)生炎性因子和趨化因子[60]。

4 中藥干預對于腸道菌群及免疫功能的影響

以往大量研究都已證明中藥有調(diào)控腸道菌群的功能，口服的中藥制劑能直接與腸道菌群接觸并發(fā)揮所用。近來研究進一步深入，發(fā)現(xiàn)除了直接作用外，中藥還能夠通過影響免疫系統(tǒng)間接調(diào)控菌群，從不同層面共同起到調(diào)節(jié)腸道菌群結(jié)構(gòu)、阻止腸道菌群移位、改善腸道菌群功能的作用[61,62]。鄭彥懿等[63]發(fā)現(xiàn)大黃牡丹湯通過抑制腸道菌群SCFAs的分泌調(diào)整腸道菌群平衡。孫必強等[64-66]發(fā)現(xiàn)七味白術(shù)散能迅速增加小鼠腸道中特定菌群菌量、改善腸組織微結(jié)構(gòu)并影響SIgA、TNF和IL含量。吳佳偉[67]證實大黃酸通過改變小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)、降低腸道內(nèi)尿酸水平、提高SCFAs的產(chǎn)生來保護腸道黏膜屏障。劉錦等[68]證實大黃附子湯加味可調(diào)節(jié)膿毒癥胃腸功能障礙的腸道菌群與腸道免疫異常，發(fā)揮治療膿毒癥的作用。除了局部疾病，許多研究也證實了中藥具有通過腸道菌群影響免疫系統(tǒng)進而治療其他系統(tǒng)疾病的功能，如以鱉甲煎丸治療非酒精性脂肪肝[69]、理肺湯干預慢阻肺[70]等。同時中藥的作用也與腸道菌群密不可分，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)腸道菌群能促進許多中藥成分如黃芩苷等的代謝與吸收[71]。

5 總結(jié)

腸道菌群與腸道免疫之間的作用機制的在近年取得了一定的進展，為諸多疾病，尤其是免疫性疾病的發(fā)病機制填補了一些空白，并為治療提供了新的思路。對腸道菌群與免疫的研究，也為研究中醫(yī)藥提供了新的落腳點與思路。目前研究中藥復方被廣泛采用的血清藥理學，即是日本學者在研究腸道菌群的過程中提出的，以黑箱理論的形式避開復雜的內(nèi)部成分，直接研究藥物的總體效應，證明了中醫(yī)藥的有效性[72]。此外，隨著腦腸軸、肝腸軸、肺腸軸、黏膜共同免疫等概念的提出，對于機體各系統(tǒng)之間聯(lián)系研究的深入，很多現(xiàn)有結(jié)論與中醫(yī)的傳統(tǒng)理論相呼應。一方面從微觀角度解釋了經(jīng)典理論的內(nèi)在機理。另一方面提示我們是否能繼續(xù)從一些經(jīng)過臨床驗證的經(jīng)典理論入手，指導科研的探索，做到推陳出新。

盡管目前在各個方面已經(jīng)取得了很多成果，仍有一些問題亟須解決：(1)16SrRNA基因測序受制于從樣本中獲得的DNA及其PCR效果，考慮到腸道菌群群落的繁雜，當下對于腸道菌群的認識仍十分有限；(2)大部分研究成果來自于實驗動物，不同物種間的腸道菌群具有差異，其機制是否與人體一致仍需進一步證實；(3)中藥目前仍是以復方作為主要的治療手段，血清藥理學雖然證明了其有效性與整體的作用機制，對于黑箱中具體機理的研究仍不夠深入。但隨著相關(guān)學科的進步與實驗方法的改進，相信這些問題能得到妥善解決。屆時，分析菌群對協(xié)助疾病的診斷治療與推進中醫(yī)藥現(xiàn)代化將具有重大意義。