人工卵母細(xì)胞激活技術(shù)臨床應(yīng)用的研究進(jìn)展

陳佩琴，孫 翟，傅 悅，肖奇夢(mèng)，柏明珠，張?bào)鸩?/p>

上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院婦產(chǎn)科，上海 201620

卵胞漿內(nèi)單精子顯微注射技術(shù)（intracytoplasmic sperm microinjection， ICSI）是目前治療嚴(yán)重的少、弱、畸精癥甚至無(wú)精癥的主要手段。導(dǎo)致ICSI 失敗的已確定因素是卵母細(xì)胞激活不足（oocyte activation deficiency，OAD）。OAD 通常與精子無(wú)法產(chǎn)生足量磷脂酶C-ζ（phospholipase C-ζ，PLCζ）引起鈣離子（Ca2+）濃度升高，即Ca2+振蕩，從而激活卵母細(xì)胞有關(guān)［1］。為解決這一問(wèn)題，人工卵母細(xì)胞激活（artificial oocyte activation，AOA）的相關(guān)研究越來(lái)越多，胚胎實(shí)驗(yàn)室逐步開(kāi)展針對(duì)天然活化劑（如PLCζ）、人工活化劑（如A23187、離子霉素、氯化鍶），甚至電脈沖激活卵母細(xì)胞的試驗(yàn)。本文主要總結(jié)AOA技術(shù)的原理、方式及安全性。

1 卵母細(xì)胞活化機(jī)制與Ca2+振蕩

卵母細(xì)胞活化是一個(gè)Ca2+濃度升高的過(guò)程。卵母細(xì)胞在蛋白類細(xì)胞因子的作用下，停滯于第二次減數(shù)分裂中期。當(dāng)胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度升高時(shí)，這些對(duì)Ca2+敏感的因子失活，從而誘發(fā)皮質(zhì)反應(yīng)，使卵母細(xì)胞完成減數(shù)分裂并排出第二極體。

精子進(jìn)入卵母細(xì)胞后釋放儲(chǔ)存于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的Ca2+，同時(shí)擴(kuò)散精子釋放的卵母細(xì)胞激活因子（spermatozoonreleased oocyte-activating factors，SOAFs），后者將磷脂酰肌醇4，5-雙磷酸酯（phosphatidylinositol 4，5-bisphosphate，PIP2） 水解為肌醇1，4，5-三磷酸酯（inositol 1，4，5-triphosphate，IP3）和二酰甘油（diacylglycerol，DAG）。分解產(chǎn)生的IP3與特定受體結(jié)合并引起Ca2+的釋放，誘導(dǎo)Ca2+振蕩。Ca2+濃度升高可增強(qiáng)PLCζ 活性，并通過(guò)正反饋機(jī)制刺激Ca2+和IP3的進(jìn)一步釋放，從而活化卵母細(xì)胞［2］。

細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度升高不僅釋放了停滯于減數(shù)分裂中的卵母細(xì)胞，隨后還觸發(fā)了胚胎發(fā)育程序。Ca2+信號(hào)是控制隨后的胚胎分裂必不可少的物質(zhì)。Ca2+振蕩的幅度可能會(huì)通過(guò)激活鈣調(diào)蛋白依賴性蛋白激酶Ⅱ（calcium-CaMdependent protein kinase Ⅱ，CaMK Ⅱ）影響胚胎發(fā)育的早期階段，激發(fā)細(xì)胞周期以及隨后的細(xì)胞分裂的啟動(dòng)。因此，胚胎植入前期發(fā)育潛力可能取決于Ca2+振蕩［3］。

2 卵母細(xì)胞激活劑

Ca2+振蕩是激活卵母細(xì)胞及促進(jìn)胚胎發(fā)育的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。部分ICSI的受精失敗可歸因于精子的異常?；A(chǔ)和臨床研究［4］均表明，推動(dòng)Ca2+振蕩及后續(xù)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和卵母細(xì)胞激活主要依賴于SOAFs。若精子質(zhì)量不佳，無(wú)法產(chǎn)生足量的SOAFs，則會(huì)引起OAD以及ICSI的失敗。OAD定義為精子和卵母細(xì)胞之間質(zhì)膜融合后卵母細(xì)胞未能成功激活［5］。當(dāng)ICSI受精失敗后，AOA技術(shù)也可作為ICSI 4 h內(nèi)發(fā)現(xiàn)受精失敗的一種挽救手段［6］。為了避免OAD 和ICSI失敗，研究人員將目光投向了天然和人工卵母細(xì)胞活化劑，希望能通過(guò)模擬胞內(nèi)Ca2+振蕩從而達(dá)到AOA。

2.1 PLCζ

PLCζ 是精子激活卵母細(xì)胞的關(guān)鍵蛋白，可作為ICSI后提高受孕率的活化劑或興奮劑，也是目前研究中唯一確定的天然SOAFs［7］。應(yīng)用小鼠卵母細(xì)胞進(jìn)行的實(shí)驗(yàn)中，觀察到應(yīng)用重組人PLCζ 蛋白后，引起類似于受精過(guò)程中Ca2+振蕩，且受精后能發(fā)育到胚泡期。也有實(shí)驗(yàn)［8］表明，將重組人PLCζ 注射到OAD 卵母細(xì)胞后，可記錄到卵母細(xì)胞自然受精激活樣的Ca2+振蕩圖譜，受精后囊胚形成率也升高。

然而，由于人重組PLCζ 尚未推廣應(yīng)用，且目前也不能排除胚泡植入后異常發(fā)育的可能，其使用仍受限制。使用ICSI 失敗的小鼠模型（通過(guò)對(duì)小鼠精子進(jìn)行溫和熱處理），發(fā)現(xiàn)注射重組PLCζ 可以有效地提高小鼠卵母細(xì)胞的激活成功率［9］。精子質(zhì)量與精子DNA 碎片化之間的關(guān)系密切［10］。由于精子必須傳遞完整的基因組才能啟動(dòng)細(xì)胞周期和胚胎分裂，因此染色質(zhì)的完整性至關(guān)重要。由于精子的受精能力取決于PLCζ，不排除DNA碎片化的程度會(huì)影響PLCζ 表達(dá)水平［11］。研究［12］發(fā)現(xiàn)，精子染色質(zhì)狀態(tài)和PLCζ 之間有關(guān)聯(lián)，這提示DNA 的碎片化可能導(dǎo)致OAD 的發(fā)生。因此，精子DNA 碎片化對(duì)ICSI 啟動(dòng)的胚胎發(fā)育具有重要價(jià)值。

2.2 Ca2+載體

Ca2+載體是最常用的人工活化劑，其中包括離子霉素和A23187。它們通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞膜Ca2+的滲透作用使細(xì)胞外Ca2+進(jìn)入卵母細(xì)胞，從而激活卵母細(xì)胞。

Ca2+載體容易獲得且使用簡(jiǎn)單，在臨床上應(yīng)用較廣。1995年報(bào)道了第一例聯(lián)合應(yīng)用A23187和ICSI成功妊娠和分娩的病例［13］。之后，發(fā)現(xiàn)A23187和粒細(xì)胞巨噬細(xì)胞集落刺激因子（granulocyte macrophage colony-stimulating factor，GM-CSF）的聯(lián)合使用可挽救ICSI 后未受精的卵母細(xì)胞［14］。有meta 分析數(shù)據(jù)顯示，ICSI 中應(yīng)用Ca2+載體能促進(jìn)卵母細(xì)胞受精、卵泡分裂、囊胚形成及胚胎著床，同時(shí)胎兒的活產(chǎn)率也得以提高［15］。

2.3 電刺激

電刺激可用于動(dòng)物科學(xué)領(lǐng)域的孤雌生殖研究和胚胎克隆。其原理是直流電產(chǎn)生的電場(chǎng)使細(xì)胞膜脂質(zhì)雙分子層中的帶電蛋白質(zhì)移動(dòng)，從而在膜上形成孔隙。培養(yǎng)液中的細(xì)胞外Ca2+通過(guò)這些孔進(jìn)入卵母細(xì)胞，瞬間升高胞內(nèi)Ca2+濃度，激活卵母細(xì)胞［16］。

重復(fù)電刺激模擬兔卵母細(xì)胞內(nèi)Ca2+振蕩時(shí)，出現(xiàn)孤雌生殖并成功分娩［17］。Mansour等［18］將46例ICSI失敗患者分成使用和不使用電刺激激活2組并分析其受精率，發(fā)現(xiàn)電激活顯著提高了嚴(yán)重少精癥和非阻塞性無(wú)精癥患者的受精率。因需配備專業(yè)的電激活設(shè)備，該技術(shù)實(shí)際應(yīng)用較少。

2.4 氯化鍶

在小鼠模型中，使用氯化鍶可引起Ca2+振蕩并激活卵母細(xì)胞。使用A23187和電刺激僅能使Ca2+濃度在初始瞬時(shí)升高，且無(wú)法模擬生理環(huán)境下的Ca2+振蕩［19］。相比之下，氯化鍶能很好地模擬體內(nèi)卵母細(xì)胞的Ca2+瞬變，但其機(jī)制尚未完全闡明。有學(xué)者認(rèn)為，Sr2+是順濃度梯度進(jìn)入卵母細(xì)胞，并通過(guò)肌醇三磷酸受體使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)釋放Ca2+［20］。

Liu 等［21］比較使用A23187 和氯化鍶后對(duì)體外受精（in-vitrofertilization，IVF）或ICSI 未受精卵母細(xì)胞的激活和胚胎發(fā)育的影響，發(fā)現(xiàn)使用前者的卵母細(xì)胞活化率高于后者，但2種方案在原核形成和胚胎分裂及發(fā)育方面的差異不顯著。

Chen 等［22］指出，ICSI 失敗后用氯化鍶治療可提高受精率和胚胎質(zhì)量。Kim 等［23］對(duì)9 例ICSI 失敗的患者采用ICSI聯(lián)合氯化鍶治療，患者們順利娩出5名健康嬰兒。

3 AOA對(duì)受精率的影響

近年來(lái)，應(yīng)用AOA 技術(shù)解決ICSI 受精失敗或低受精率的研究不斷增多，越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)及臨床數(shù)據(jù)證實(shí)AOA能顯著提高受精率［24］。Ebner等［25］對(duì)嚴(yán)重不育癥患者進(jìn)行AOA 的前瞻性研究，指出Ca2+載體可以提高受精率和胚胎成功植入率。Murugesu 等［15］對(duì)1 521 個(gè)ICSI 周期進(jìn)行meta 分析，以確定Ca2+載體治療作為AOA 方法的價(jià)值。該研究發(fā)現(xiàn)，使用ICSI-AOA 后，受精率、卵裂率、囊胚形成率以及胚胎著床率均升高。

4 AOA對(duì)胚胎發(fā)育潛能的影響

雖然AOA能提高受精率已被廣泛認(rèn)可，但AOA對(duì)胚胎發(fā)育潛能的影響尚未完全闡明。Zhang 等［26］比較用乙醇激活和非激活的卵母細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)AOA 組的優(yōu)質(zhì)胚胎率、囊胚率和優(yōu)質(zhì)囊胚率均高于非AOA 組；而且，只有在新鮮或玻璃化冷凍的未成熟卵母細(xì)胞ICSI 后進(jìn)行AOA，才能發(fā)育出高質(zhì)量的囊胚。該實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，AOA 能顯著提高胚胎的發(fā)育能力。Mizuta 等［27］研究表明AOA組中的囊胚發(fā)育和優(yōu)質(zhì)囊胚率均高于未經(jīng)AOA處理組，但差異不顯著。Economou 等［14］研究表明，聯(lián)合使用A23187 和GM-CSF 可增強(qiáng)胚胎發(fā)育潛能，產(chǎn)生形態(tài)良好的整倍體囊胚。為了正確評(píng)估AOA 使用的安全性，仍需要更大樣本量以及更長(zhǎng)期的研究。

5 AOA的應(yīng)用指征

一項(xiàng)研究［28］指出，使用AOA 后能提高ICSI 后完全受精失?。╰otal failed fertilization，TFF）、卵母細(xì)胞數(shù)量少、精子質(zhì)量差以及冷凍精子患者的胚胎質(zhì)量和妊娠率，這意味著AOA 適用于因上述問(wèn)題導(dǎo)致的不孕癥患者。同時(shí)，因AOA 能增加囊胚形成率、胚胎著床率以及提升胚胎質(zhì)量［15，26］，可推斷其對(duì)因胚胎發(fā)育問(wèn)題引起的復(fù)發(fā)性流產(chǎn)有治療作用，但目前尚無(wú)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。在明確生物安全性之前，應(yīng)限制AOA 使用于圓頭精子癥、反復(fù)受精失敗以及受精率低下、嚴(yán)重少弱畸精癥、極少量精子凍融及單精子凍融、死精癥及不動(dòng)精子癥患者。

6 AOA的安全性

AOA 的基本原理為利用人工激活劑使卵母細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增高從而引起Ca2+振蕩，并激發(fā)受精時(shí)的卵母細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)的生理變化。目前，已開(kāi)展了有多項(xiàng)關(guān)于在常規(guī)ICSI后應(yīng)用AOA 解決受精失敗或低受精率的問(wèn)題的研究［18，22，29-30］。ICSI 受精失敗后使用AOA，常能使患者成功妊娠。但由于患者的個(gè)體差異性大，且調(diào)查研究包含的患者數(shù)量少，以及使用的活化劑不同，很難合理比較不同的病例。報(bào)道的病例中，受精率和妊娠率差別較大。最合理的解釋是不同患者基線特征差異較大，而且在大多數(shù)研究中，沒(méi)有事先進(jìn)行診斷測(cè)試，所使用的活化劑的差異可能也是導(dǎo)致結(jié)果不同的原因。鑒于此，許多研究者對(duì)其安全性持保留意見(jiàn)。

研究員通常用鼠卵母細(xì)胞研究人的卵母細(xì)胞活化過(guò)程并評(píng)估其安全性。Heytens 等［31］對(duì)小鼠合子植入前后的發(fā)育情況進(jìn)行觀察，發(fā)現(xiàn)用Ca2+通道載體處理的合子植入前后均正常發(fā)育。Vanden Meerschaut等［32］在小鼠模型中發(fā)現(xiàn)Ca2+通道載體、電脈沖或氯化鍶激活劑均能有效激活卵母細(xì)胞。就受精率和胚胎發(fā)育情況而言，氯化鍶與電刺激的聯(lián)合使用比離子霉素效果更佳。該研究得出的結(jié)論是，所有激活因子均不會(huì)導(dǎo)致子代任何畸形，表明應(yīng)用AOA損害新生兒健康的可能性較低。盡管AOA越來(lái)越多地應(yīng)用于人工輔助生殖，但大多數(shù)實(shí)驗(yàn)都是在動(dòng)物模型上進(jìn)行，必須謹(jǐn)慎地將研究結(jié)果應(yīng)用于人類［33］。

盡管越來(lái)越多的輔助生殖中心應(yīng)用AOA 技術(shù)，但至今仍無(wú)相關(guān)的隨機(jī)對(duì)照試驗(yàn)證明其的使用安全性。AOA在臨床中最常用的活比劑為即用型Ca2+離子載體A23187，針對(duì)其使用安全性的研究較多?；仡櫺躁?duì)列研究［34］顯示，單胎和雙胎ICSI 和ICSI-Ca2+在出生缺陷率（染色體畸變、結(jié)構(gòu)畸形、畸形類型）上沒(méi)有差異；這提示在ICSI受精失敗或受精率低的情況下，用Ca2+離子載體激活卵母細(xì)胞是可行措施。Capalbo 等［35］通過(guò)觀察分析Ca2+通道載體激活和正常激活的卵母細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)兩者發(fā)生減數(shù)分裂Ⅱ型錯(cuò)誤概率無(wú)明顯差異，即Ca2+通道載體不會(huì)影響卵母細(xì)胞分裂后形成非整倍體。但即便如此，該研究者仍不建議將AOA 作為體外受精的常規(guī)做法，并認(rèn)為需要更多的數(shù)據(jù)支撐AOA 的使用安全性。在AOA 過(guò)程中，雖然Ca2+載體暴露時(shí)間短且僅限于精卵融合階段，但由于使用Ca2+載體不會(huì)引起生理水平的釋放，甚至可能使Ca2+濃度低于生理水平，所以可能影響Ca2+振蕩驅(qū)動(dòng)的下游事件，即可能產(chǎn)生基因表達(dá)模式的差異，甚至有導(dǎo)致表觀遺傳缺陷的風(fēng)險(xiǎn)。有隨訪研究［36］結(jié)果顯示，使用Ca2+載體進(jìn)行AOA 出生的嬰兒中，男嬰多于女嬰，但兩者差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與該國(guó)新生兒數(shù)據(jù)相比，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用AOA后出生的嬰兒在身長(zhǎng)、體質(zhì)量方面與應(yīng)用ICSI 出生的嬰兒比較，無(wú)明顯差異。然而，由于該研究只有13例樣本，尚不能完全確定Ca2+載體使用的整體安全性。另外，Vanden Meerschaut 等［37］的隊(duì)列研究顯示，應(yīng)用AOA 技術(shù)出生的21 名嬰兒在3～10 歲時(shí)并沒(méi)有出現(xiàn)任何神經(jīng)發(fā)育問(wèn)題，其體質(zhì)量、智力發(fā)育、社會(huì)行為與常規(guī)應(yīng)用ICSI出生的嬰兒無(wú)明顯差異。但是，由于上述研究規(guī)模較小，得出的結(jié)論并不能讓人完全信服。Miller 等［34］針對(duì)83 例ICSI-AOA 嬰兒的出生缺陷做了8 年的回顧性研究，結(jié)果顯示在單胎和雙胎分娩中，應(yīng)用Ca2+載體的AOA 嬰兒的出生缺陷比例及類型并未增加。Li 等［38］進(jìn)行了6 年回顧性研究，結(jié)果顯示接受常規(guī)ICSI和ICSI-AOA的患者在胎兒出生體質(zhì)量、胎齡、性別方面沒(méi)有顯著差異。目前的臨床數(shù)據(jù)支持使用Ca2+載體的AOA，但仍需謹(jǐn)慎操作。

除了Ca2+通道載體外，也有學(xué)者研究其他人工激活劑對(duì)嬰兒生長(zhǎng)發(fā)育的影響。Takisawa 等［39］跟蹤隨訪了應(yīng)用AOA 技術(shù)出生的22 名嬰兒，其中有10 名在A23187 暴露后出生、12 名在氯化鍶治療后出生，且這2 種通過(guò)AOA方案分娩的嬰兒出生時(shí)的生長(zhǎng)和健康狀況沒(méi)有差異。

另外，有學(xué)者指出，在AOA 過(guò)程中使用的培養(yǎng)基也可能存在導(dǎo)致表觀遺傳缺陷的風(fēng)險(xiǎn)［40］。培養(yǎng)基的基本參數(shù)，如含氧量、溫度以及滲透壓等，可能通過(guò)形態(tài)學(xué)、發(fā)育動(dòng)力學(xué)、生理學(xué)和代謝等方面影響從受精到著床的基因組表達(dá)，甚至可能對(duì)其發(fā)育和后代表型產(chǎn)生負(fù)面影響。在植入胚胎前的這個(gè)敏感時(shí)期，任何變化都可能對(duì)后代產(chǎn)生巨大影響，如有必要可通過(guò)表觀遺傳修飾微調(diào)胚胎發(fā)育。

7 展望

卵母細(xì)胞激活是人類發(fā)育的最早事件。毫無(wú)疑問(wèn)，在這一關(guān)鍵階段，任何輕微或重大的不良事件都可能對(duì)單個(gè)器官或人體功能產(chǎn)生長(zhǎng)期、持久影響。Silveira等［41］研究表明，如果在身體發(fā)育初始階段受到不良影響，則患上慢性疾?。ㄈ绶逝职Y、糖尿病和心血管疾病）的風(fēng)險(xiǎn)更大。這一結(jié)論也適用于AOA 和隨后的受精過(guò)程。目前，尚未明確AOA 和受精過(guò)程中的人為干預(yù)是否會(huì)對(duì)未來(lái)健康產(chǎn)生影響，因此相關(guān)研究結(jié)論對(duì)指導(dǎo)臨床應(yīng)用意義重大。

近年AOA 應(yīng)用越來(lái)越多，以A23187 為主要成分的Ca2+激活劑已經(jīng)投入臨床使用。此外，盡管回顧性研究顯示應(yīng)用AOA 后的兒童生長(zhǎng)發(fā)育與常規(guī)使用ICSI無(wú)明顯差異，且全世界有經(jīng)驗(yàn)的生育中心應(yīng)用AOA 成功率很高，但仍不應(yīng)被視為常規(guī)做法。為了確保安全和避免過(guò)度使用AOA，應(yīng)明確其適應(yīng)證。另外，應(yīng)鼓勵(lì)患者在ICSI 受精失敗后進(jìn)行診斷性檢測(cè)，為能否實(shí)施AOA 提供明確的指示。為了使AOA 的使用更合理、規(guī)范、安全，國(guó)際上應(yīng)盡快確立AOA相關(guān)的臨床共識(shí)和指南。