東方百合‘Vivian’高效離體快繁體系的建立

任君芳, 張利, 劉建霞, 單鳳嬌, 劉千里*, 李昌玉

1. 阿壩州林業(yè)和草原科學(xué)技術(shù)研究所，四川 汶川 623000；

2. 阿壩州林業(yè)和草原局，四川 馬爾康 624000；

3. 汶川縣林業(yè)和草原局，四川 汶川 623000

百合是百合科百合屬多年生球根花卉，是世界重要的切花，具有極高的觀賞價值和經(jīng)濟(jì)價值。近些年來，東方百合‘Vivian’憑借其花大色艷，深受消費(fèi)者喜歡，種植面積逐年提高，市場對其種球的需求也與日俱增。

分球繁殖和鱗片扦插是百合種球生產(chǎn)的常見方式，但普遍存在繁殖系數(shù)較低[1-3]以及病毒（CMV、LMoV 和LSV 等）、真細(xì)菌性病害（灰霉病、枯萎病等）和蟲害（蚜蟲、線蟲等）發(fā)生嚴(yán)重導(dǎo)致種性退化等問題[4-6]。離體快繁技術(shù)因其繁殖系數(shù)高，而且通過莖尖脫毒可以獲得無病毒植株等優(yōu)點(diǎn)[7-9]，已成功應(yīng)用于百合‘黃天霸’、‘水晶布蘭卡’和‘Strawberry and Cream’等品種的種球繁育[10-15]、歐洲百合、金黃花滇百合、宜昌百合和新疆百合等野生百合資源保存[2-4,16]以及百合新品種培育研究中。本研究以東方百合‘Vivian’的鱗片為外植體，在本實(shí)驗(yàn)室已有的離體快繁體系的基礎(chǔ)，對不定芽的誘導(dǎo)、增殖、小鱗莖膨大、生根等步驟進(jìn)行系統(tǒng)研究，旨在建立更為高效的東方百合‘Vivian’離體快繁體系，為其種球的規(guī)模化生產(chǎn)提供技術(shù)保障。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

東方百合‘Vivian’無菌組培苗為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2 試驗(yàn)條件

基本培養(yǎng)基為MS 或1/2 MS 培養(yǎng)基。所有培養(yǎng)基的pH 為6.0，瓊脂濃度為6.0 g·L?1，121 ℃高壓滅菌20 min 冷卻備用，培養(yǎng)溫度為25 ℃。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 不定芽的誘導(dǎo)

基于實(shí)驗(yàn)室前期的不定芽誘導(dǎo)配方（MS+0.5 mg·L?16-BA+0.1 mg·L?1NAA+30 g·L?1蔗 糖+6.0 g·L?1瓊脂，pH 值=6.0）設(shè)置不同激素和濃度組合 6-BA（ 0.5、 1.0、 1.5 mg·L?1）、 NAA（ 0.1、0.2 mg·L?1）的不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基。將鱗片切成1 cm×1 cm 的方塊接種在各個不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基上進(jìn)行不定芽誘導(dǎo)。45 d 后觀察統(tǒng)計(jì)不定芽誘導(dǎo)情況。每個處理30 個鱗片，生物重復(fù)3 次。

1.3.2 不定芽的增殖

基于實(shí)驗(yàn)室前期的增殖培養(yǎng)基配方（MS+1.0 mg·L?16-BA+0.1 mg·L?1NAA+60 g·L?1蔗 糖+6.0 g·L?1瓊脂，pH 值=6.0）設(shè)置不同激素和濃度組合 6-BA（ 0.8、 1.0、 1.2 mg·L?1）、 NAA（ 0.1、0.15 mg·L?1）的增殖培養(yǎng)基。待誘導(dǎo)出的不定芽長至直徑1 cm 左右后，將不定芽分別接種至不同的增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖。45 d 后觀察統(tǒng)計(jì)不定芽增殖情況。每個處理30 個不定芽，生物重復(fù)3 次。

1.3.3 小鱗莖的膨大

將直徑1 cm 左右的小鱗莖轉(zhuǎn)接至表3 不同濃度蔗糖的培養(yǎng)基中進(jìn)行小鱗莖的膨大培養(yǎng)，30 d 轉(zhuǎn)接一次，60 d 后統(tǒng)計(jì)鱗莖的直徑。

1.3.4 鱗莖的生根培養(yǎng)

將直徑2～3 cm 的鱗莖轉(zhuǎn)接至表4 的不同生根培養(yǎng)基中（蔗糖濃度為60 g·L?1），20 d 后觀察統(tǒng)計(jì)根系生長情況。

1.3.5 煉苗與移栽

待鱗莖根長到2 cm 左右，在溫室中開瓶煉苗3～5 d，將組培苗從瓶中移出，洗凈根系附著的瓊脂，移入表5 不同草炭與蛭石比例的基質(zhì)中，保持70～75%左右濕度，60 d 后觀察生長情況并統(tǒng)計(jì)成活率。

2 結(jié)果與分析

2.1 不定芽的誘導(dǎo)培養(yǎng)

外植體在分化培養(yǎng)基上大概6～8 d 開始進(jìn)行分化，鱗片表面出現(xiàn)凸起，20 d 左右逐漸分化出不定芽，隨后逐漸發(fā)育成小鱗莖，如表1 和圖1A 可知，當(dāng)NAA 的濃度不變時，不定芽誘導(dǎo)系數(shù)隨著6-BA的濃度的升高呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢，當(dāng)6-BA為1.0 mg·L?1、NAA 為0.1 mg·L?1時，不定芽分化的誘導(dǎo)系數(shù)為3.65，比實(shí)驗(yàn)室已有的不定芽誘導(dǎo)體系（6-BA 為0.5 mg·L?1、NAA 為0.1 mg·L?1）的誘導(dǎo)系數(shù)1.01 高出了2.64，此濃度組合的誘導(dǎo)率最高并且不定芽健壯，因此，此激素濃度組合的培養(yǎng)基為最佳不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基。

表 1 不同濃度6-BA、NAA 對不定芽誘導(dǎo)的影響Tab. 1 Effects of different concentrations of 6-BA and NAA on adventitious bud induction

2.2 不定芽的增殖培養(yǎng)

將不定芽轉(zhuǎn)接到不同增殖培養(yǎng)基后約7～9 d，在鱗莖基部出現(xiàn)不同數(shù)量的小的不定芽，隨后逐漸長成新的小鱗莖。由表2 和圖1B 可知，不同激素組合培養(yǎng)基中，不定芽的增殖情況差異較大，當(dāng)6-BA為0.8 mg·L?1、NAA 為0.1 mg·L?1時，增殖系數(shù)為1.21，增殖情況最差；當(dāng)6-BA 為1.0 mg·L?1、NAA為0.15 mg·L?1時，增殖效果最好，增殖系數(shù)為4.63，比比實(shí)驗(yàn)室已有的不定芽增殖體系（6-BA 為0.5 mg·L?1、NAA 為0.1 mg·L?1）的誘導(dǎo)系數(shù)3.21 高出了1.42，因此，此激素濃度組合的培養(yǎng)基為最佳不定芽增殖激素培養(yǎng)基。

2.3 鱗莖的膨大培養(yǎng)

如表3 和圖1C 所示，在蔗糖濃度為30～90 mg·L?1時，隨著蔗糖濃度的不斷提高，不定芽的膨大的越明顯。當(dāng)蔗糖濃度為90 mg·L?1時，鱗莖膨大最明顯，而當(dāng)蔗糖濃度為120 mg·L?1時，不定芽的膨大速度開始下降。

2.4 鱗莖的生根培養(yǎng)

將鱗莖接種至不同濃度的生根培養(yǎng)基中3 d 左右開始從鱗莖基本生長出根。如表4 和圖1D 所示，呈現(xiàn)出低濃度NAA 促進(jìn)根的發(fā)生而高濃度NAA 抑制根發(fā)生。在NAA 濃度為0.0～0.3 mg·L?1時，隨著濃度的不斷提高，生根系數(shù)不斷提高，NAA 濃度為0.3 mg·L?1時，生根系數(shù)最高，達(dá)4.63；而當(dāng)NAA濃度為0.4 mg·L?1，生根系數(shù)開始下降。

2.5 練苗與移栽

組培苗鱗莖移栽至消毒完全的不同基質(zhì)中，10 d左右出現(xiàn)鱗片葉，同時有新根產(chǎn)生。由表5 可知，在草炭與蛭石比例為1∶1 的基質(zhì)中的組培苗移栽苗長勢健壯且成活率最高達(dá)95.31%。

圖 1 東方百合‘Vivian’組織培養(yǎng)再生體系Fig. 1 In vitro propagation of Oriental hybrid lily cultivar ‘Vivian’

表 2 不同濃度6-BA、NAA 對不定芽增殖的影響Tab. 2 Effects of different concentrations of 6-BA and NAA on adventitious bud proliferation

表 3 不同濃度蔗糖對鱗莖膨大的影響Tab. 3 Effecdts of different concentrations of sucrose on bulblet enlargement

表 4 不同濃度NAA 對生根的影響Tab. 4 Effecdts of different concentrations of NAA on rooting

表 5 不同基質(zhì)對試管苗移栽的影晌Tab. 5 Effecdts of different media on the survival of plantlets

3 結(jié)論與討論

在百合組培快繁技術(shù)中，培養(yǎng)基中激素的種類及不同激素濃度配比是核心[17-18]。研究表明，以MS 為基本培養(yǎng)基，用6-BA 和NAA 兩種激素可以實(shí)現(xiàn)東方百合‘Vivian’的不定芽誘導(dǎo)、增殖、小鱗莖膨大及生根培養(yǎng)。最佳不定芽誘導(dǎo)培養(yǎng)基為MS+1.0 mg·L?16-BA+0.1 mg·L?1NAA+30 g·L?1蔗糖；最佳不定芽增殖培養(yǎng)基為MS+1.0 mg·L?16-BA+0.1 mg·L?1NAA+60 g·L?1蔗糖；最佳小鱗莖膨大培養(yǎng)基為MS+90 g·L?1蔗糖；最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.1 mg·L?1NAA+60 g·L?1蔗糖。

圖 2 移栽成活的組培苗Fig. 2 Survival plantlets after transplanting

蔗糖濃度對百合鱗莖的膨大起著重要作用。錢劍林等（2004）研究表明當(dāng)培養(yǎng)基中蔗糖含量為75 g·L?1時，東方百合‘Sorbonne’小鱗莖的體積膨大系數(shù)最大[20]。張延龍等（2006）以‘Siberia’小鱗莖為試材，研究了不同蔗糖含量對組培苗的影響，發(fā)現(xiàn)蔗糖含量大于50 g·L?1時，鱗莖體積開始增大，到90 g·L?1時直徑能夠達(dá)到最大1.59 cm[21]。李雪艷等（2016）對蔗糖濃度對東方百合‘Tiger Woods’小鱗莖膨大的研究表明，當(dāng)MS 基本培養(yǎng)基中加入75 g·L?1的蔗糖時，能有效促進(jìn)試管小鱗莖直徑的增加[22]。本研究表明，MS 基本培養(yǎng)基含90 g·L?1的蔗糖最有利于東方百合‘Vivian’小鱗莖的膨大，蔗糖含量繼續(xù)升高則小鱗莖體積不會繼續(xù)增大，而且發(fā)生部分小鱗莖產(chǎn)生褐死現(xiàn)象，原因可能是培養(yǎng)基中過高濃度蔗糖使培養(yǎng)基滲透壓過大，對小鱗莖產(chǎn)生了脅迫，從而不利于其膨大。綜上所述，不同百合品種由于遺傳差異，適合各自小鱗莖膨大的最適蔗糖濃度有所不同，所以，在對新品種小鱗莖膨大培養(yǎng)過程中，對其蔗糖濃度進(jìn)行優(yōu)化至關(guān)重要。

本研究建立的東方百合‘Vivian’的不定芽誘導(dǎo)、不定芽增殖、鱗莖膨大、鱗莖生根等過程的組織培養(yǎng)快繁體系，可為其種球規(guī)?；a(chǎn)提供技術(shù)保障。