Musashi-1和Wnt/β-catenin信號通路與卵巢子宮內膜異位癥的相關性研究

于聰祥 ，李躍飛

(1.內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，內蒙古 呼和浩特；2.內蒙古自治區(qū)婦幼保健院婦產(chǎn)科，內蒙古 呼和浩特)

0 引言

卵巢子宮內膜異位癥( ovarian endometriosis) 主要發(fā)生于女性生殖系統(tǒng)，發(fā)病率呈逐年上升趨勢[1]。雖為良性疾病，但具有無限生長、侵襲及遠處轉移等惡性腫瘤的特性，故有“良性癌”之稱。目前對于卵巢子宮內膜異位癥發(fā)病機制尚未清晰。細胞凋亡(apoptosis)又稱為細胞程序性死亡，機體通過調節(jié)細胞數(shù)量，進而維持組織細胞的動態(tài)平衡，是維持細胞穩(wěn)態(tài)的重要方式之一。細胞凋亡異常與多種腫瘤的發(fā)生密切相關[2-3]。Mushasi-1及Wnt/β-catenin信號轉導通路通過抑制細胞凋亡促進癌細胞增殖是近年來的研究熱點[4]。因此，本研究通過檢測Mushasi-1、β-catenin在卵巢子宮內膜異位癥患者月經(jīng)第一天脫落子宮內膜及未脫落子宮內膜的表達情況，探討細胞凋亡與卵巢子宮內膜異位癥的相關性。

1 對象與方法

1.1 對象

采集2012年5月至2015年9月內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院患者標本，實驗組為：病理證實卵巢子宮內膜異位癥志愿者子宮內膜標本36份，收集經(jīng)血及使用內膜取樣器各獲得18份。對照組為：選擇因輸卵管因素不孕或宮頸病變住院手術志愿者的子宮內膜標本40份，收集經(jīng)血及使用內膜取樣器各獲得20份。標本采集得到了內蒙古醫(yī)科大學附屬醫(yī)院醫(yī)學倫理委員會同意，并取得了患者本人授權。

入選標準：①年齡20-30歲；②無子宮肌瘤，無生殖器結核及惡性腫瘤病史，無剖宮產(chǎn)及子宮肌瘤剔除術史；③術前3個月未用激素類藥物，未用抗生素及GnRHa；④未放置宮內節(jié)育器；⑤無高血壓、糖尿病、腎病等病史；⑥病理證實無子宮內膜病變。

1.2 方法

1.2.1 標本采集及處理

術前一個月經(jīng)周期收集標本，于月經(jīng)第一天經(jīng)血量較多時收集陰道內的經(jīng)血獲取脫落子宮內膜，常規(guī)消毒陰道及宮頸，使用內膜取樣器輕輕刮取，獲得未脫落子宮內膜，并分別用4℃生理鹽水迅速沖洗，獲得內膜組織標本，迅速置于無菌無酶的凍存管、液氮罐中保存，用于Real-Time PCR實驗。

1.2.2 Real-Time PCR實驗

Trizol、逆轉錄和Real-Time PCR試劑盒購于北京天根公司，引物購于上海生工。Trizol法提取組織Total RNA，通過瓊脂糖電泳檢測符合Real-Time PCR實驗的要求。引物序列：Musashi-1上游5’-ATTTCCCCTCCTTTACCCTTTC-3’，下游 5’-GGGCTTCACATTCACAAACCTA-3’；β-catenin 上游 5’-TGACCTGAGACTGGATGTAGAAA-3’，下游 5’-GCTGGAATGACAACTGGA TAAAC-3’；β-actin上游 5’-TGACGTGGACATCCGCAAAG-3’，下游5’-CTGGAAGGTGGACAGCGAGG-3’，逆轉錄合成cDNA：42℃ 50min，95℃ 5min，PCR 擴增 cDNA：95℃ 15 min預變性，PCR 反應 95℃ 10sec，60℃ 20sec，72℃ 31sec，45Cyele。融解曲線分析 95℃ 10 sec，65℃ 15 sec，95℃ 10sec。ABI7300熒光定量PCR儀測定反應終產(chǎn)物，采取相對定量法，參照β-actin對各組目的基因表達的強度進行校正(△Ct = Ct目的基因- Ctβ-actin基因)。相對表達量差值，即2-△△Ct表示各組Musashi-1、β-catenin的表達差異。

表1 實驗組、對照組Musashi-1/β-actin和β-catenin /β-actin的相對表達量比較()

表1 實驗組、對照組Musashi-1/β-actin和β-catenin /β-actin的相對表達量比較()

組別 例數(shù)(n) 2-△△Ct Musashi-1β-catenin對照組(40例) 脫落內膜 20未脫落內膜 20 3.10 33.36實驗組(36例) 脫落內膜 18 9.51 3.07 107.63 3.23未脫落內膜 18 11.31 3.66 1.19 164.28 4.92 1.53 F值 59.450 433.975 P值 0.0000 0.0000

表2 實驗組、對照組Musashi-1/β-actin和β-catenin /β-actin相對表達量的相關性

1.3 統(tǒng)計學處理

2 結果

2.1 Musashi-1相對表達量的方差分析

Musashi-1在實驗組未脫落內膜的相對表達量較脫落內膜高1.19倍，而且比對照組脫落內膜及對照組未脫落內膜分別高11.31倍及3.66倍。Musashi-1在實驗組脫落內膜的相對表達量比對照組脫落內膜及對照組未脫落內膜分別高9.51倍和3.07倍。Musashi-1在對照組未脫落內膜的相對表達量較脫落內膜高3.10倍。單因素方差分析結果顯示，Musashi-1在實驗組未脫落內膜的相對表達量高于對照組脫落內膜及對照組未脫落內膜，差異有統(tǒng)計學意義(Mean Diference=-3.4901，P=0.0000；Mean Diference=-1.8561，P=0.0000)；并且Musashi-1在實驗組脫落內膜的相對表達量也較對照組脫落內膜及對照組未脫落內膜高，差異均有 統(tǒng) 計 學 意 義 (Mean Diference=-3.2479，P=0.0000；Mean Diference=-1.6139，P=0.0000)。Musashi-1在實驗組脫落內膜仍高表達，與實驗組未脫落內膜組相比，差異無統(tǒng)計學意義 (Mean Diference=0.2422，P=0.4322)。 而 Musashi-1 在 對照組脫落內膜的相對表達量低于對照組未脫落內膜，差異具有統(tǒng)計學意義(Mean Diference=1.6340，P=0.0000)(見表1)。

2.2 β-catenin相對表達量的方差分析

β-catenin在實驗組未脫落內膜的相對表達量比脫落內膜高1.53倍，比對照組脫落內膜及對照組未脫落內膜分別高164.28倍和4.92倍。β-catenin在實驗組脫落內膜的相對表達量比對照組脫落內膜及對照組未脫落內膜分別高107.63倍和3.23倍。β-catenin在對照組未脫落內膜的相對表達量比脫落內膜高33.36倍。單因素方差分析結果顯示，β-catenin在實驗組未脫落內膜的相對表達量較其脫落內膜和對照組脫落內膜、對照組未脫落內膜均高，差異均具有 統(tǒng) 計 學 意 義 (Mean Diference=-0.6111，P=0.0114；Mean Diference=-7.3625，P=0.0000；Mean Diference=-2.3050，P=0.0000)。β-catenin在實驗組脫落內膜的相對表達量較對照組脫落內膜及對照組未脫落內膜高，差異具有統(tǒng) 計 學 意 義 (Mean Diference=-6.7514，P=0.0000；Mean Diference=-1.6939，P=0.0000)。β-catenin在對照組未脫落內膜的相對表達量較脫落內膜高，差異有統(tǒng)計學意義(Mean Diference=-5.058，P=0.0113)(見表 1)。

2.3 Musashi-1與β-catenin相對表達量的Pearson直線相關分析

Musashi-1與β-catenin在實驗組未脫落內膜及脫落內膜組中呈正相關，但對照組未脫落內膜及脫落內膜中二者無相關 (見表 2)。

3 討論

卵巢子宮內膜異位癥目前有“在位內膜決定論”、“經(jīng)血逆流學說”、免疫等學說，卻尚無一理論可解釋其發(fā)病機制。隨著分子生物學的發(fā)展，卵巢子宮內膜異位癥發(fā)病機制的研究也已深入至分子水平。細胞凋亡是機體發(fā)育、動態(tài)平衡及免疫調節(jié)的重要過程，受多種基因調控的細胞自主且有序地程序性死亡[5]。月經(jīng)增殖期時，增殖的新生細胞可以彌補損失的衰老細胞；然而月經(jīng)期時，子宮內膜功能層卻通過細胞凋亡機制清除衰老細胞。然而，研究發(fā)現(xiàn)子宮內膜異位癥患者細胞凋亡比例明顯降低，但上皮細胞活性增強[6]。

Musashi-1高表達于腫瘤組織，且具有促進腫瘤細胞生長及抑制腫瘤細胞凋亡的功能[7]。研究發(fā)現(xiàn)Musashi-1在惡性腫瘤組織的表達率明顯高于良性病變組織，敲除Musashi-1 RNA結合蛋白后，發(fā)現(xiàn)腫瘤生長停滯，且細胞凋亡增加，增殖降低[8-9]。本研究結果顯示，Musashi-1在實驗組未脫落內膜的相對表達量高于對照組脫落內膜及對照組未脫落內膜，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.0000，P=0.0000)，Musashi-1在實驗組脫落內膜的相對表達量也較對照組脫落內膜、對照組未脫落內膜高，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.0000，P=0.0000)。提示卵巢子宮內膜異位癥患者未脫落子宮內膜、脫落子宮內膜組織比正常對照組中細胞凋亡要明顯減少，這意味著卵巢子宮內膜異位癥患者未脫落子宮內膜、脫落子宮內膜組織很可能仍具有較強的增殖能力，與Zhao[10]提出的細胞凋亡異常參與了子宮內膜異位癥的結論相符。張連鎖[11]等研究發(fā)現(xiàn)下調程序性細胞死亡因子5(programmed cell death 5，PDCD5)的表達，可以引起細胞凋亡減少，生存能力增強，促使異位的內膜細胞種植生長，進而形成卵巢子宮內膜異位癥。本研究實驗結果提示，Musashi-1在實驗組脫落內膜仍高表達，與實驗組未脫落內膜相比差異無統(tǒng)計學意義(P=0.4322)。而Musashi-1在對照組脫落內膜的相對表達量低于對照組未脫落內膜，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.0000)。從而進一步論證了正常對照組子宮內膜組織發(fā)生了細胞凋亡，而卵巢子宮內膜異位癥患者的未脫落子宮內膜、脫落子宮內膜組織細胞過度存活，可能仍然具有較強的增殖能力，如果異位于適當?shù)哪[瘤微環(huán)境便可能形成子宮內膜異位病灶。提示抑制Musashi-1的表達可能是卵巢子宮內膜異位癥基因治療的手段之一。

Wnt/β-catenin信號轉導通路對細胞凋亡的調控作用與腫瘤細胞的增殖相關[12]。β-catenin作為 Wnt/β-catenin信號轉導通路的關鍵信號因子，在腫瘤的發(fā)生發(fā)展過程中起重要調控作用，通過抑制細胞凋亡過程，激活下游促增殖蛋白轉錄從而促進腫瘤細胞的增殖、存活及轉移[13]。本研究結果顯示β-catenin在實驗組未脫落內膜的相對表達量高于對照組脫落內膜及對照組未脫落內膜，差異具有統(tǒng)計學意義 (P=0.0114，P=0.0000，P=0.0000)。β-catenin 在實驗組脫落內膜的相對表達量高于對照組脫落內膜及對照組未脫落內膜，差異具有統(tǒng)計學意義(P=0.0000，P=0.0000)。β-catenin在對照組未脫落內膜的相對表達量高于脫落內膜，差異有統(tǒng)計學意義。意味著正常對照組的子宮內膜組織發(fā)生了細胞凋亡，屬于子宮內膜周期性變化，而卵巢子宮內膜異位癥患者，脫落子宮內膜和未脫落子宮內膜組織凋亡異常，細胞凋亡明顯減低，意味著卵巢子宮內膜異位癥患者脫落子宮內膜和未脫落子宮內膜組織可能仍具有較強的增殖分化活性。提示W(wǎng)nt/β-catenin信號轉導通路的激活可能抑制了子宮內膜細胞凋亡的發(fā)生，并參與卵巢子宮內膜異位癥的發(fā)生及發(fā)展。學者提出Wnt/β-catenin信號轉導通路是藥物干預治療胃癌的重要靶點[13]。因此，推測抑制Wnt/β-catenin信號轉導通路可能是治療卵巢子宮內膜異位癥的潛在靶點。

Musashi-1主要通過調節(jié) Wnt/β-catenin、Notch等信號轉導通路參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展進程[12]。Wang[14]等研究證實Musashi-1可以通過激活Wnt/β-catenin信號轉導通路促進乳腺癌的發(fā)生發(fā)展。趙明明[15]等提出Wnt/β-catenin信號轉導通路一旦被激活后，便可抑制星形膠質細胞發(fā)生細胞凋亡。本研究發(fā)現(xiàn)Musashi-1和β-catenin在實驗組未脫落內膜、脫落內膜組中呈正相關性，而對照組未脫落內膜及脫落內膜中二者無相關性。提示Musashi-1有可能通過激活Wnt/β-catenin信號轉導通路及其下游靶基因，抑制細胞凋亡，從而增強組織細胞的增殖分化侵襲能力，參與卵巢子宮內膜異位癥的形成。通過調節(jié)Wnt/β-catenin信號轉導通路，可能是卵巢子宮內膜異位癥基因治療的手段，有望成為卵巢子宮內膜異位癥新的治療途徑。

綜上所述，Musashi-1可能通過激活Wnt/β-catenin信號轉導通路參與抑制子宮內膜細胞發(fā)生凋亡，從而增強組織細胞的增殖分化侵襲能力，參與卵巢子宮內膜異位癥的形成。但仍存在不足之處：β-catenin通過激活了哪些下游靶基因從而降低卵巢子宮內膜異位癥患者脫落子宮內膜和未脫落子宮內膜組織凋亡的，還有待課題組進一步實驗揭示。課題組將進一步擴大樣本量，體外培養(yǎng)卵巢子宮內膜異位癥細胞，通過調節(jié)Musashi-1及Wnt/β-catenin信號轉導通路的相關上游及下游靶基因，進一步探討其致病機制，為臨床治療提供理論依據(jù)。