AM真菌共生系統(tǒng)中硝態(tài)氮吸收轉(zhuǎn)運(yùn)途徑及對(duì)寄主生長(zhǎng)的作用*

李夢(mèng)瑤，蔣湘艷，金海如

（浙江師范大學(xué)化學(xué)與生命科學(xué)學(xué)院，浙江金華 321004）

同位素示蹤技術(shù)及酶學(xué)和基因表達(dá)分析至今已證實(shí)AM真菌吸收氮素并轉(zhuǎn)運(yùn)給植物，其能利用無機(jī)態(tài)的銨態(tài)氮、硝態(tài)氮，有機(jī)態(tài)的氨基酸等[1-5]，而且Jin等[5-7]利用AM真菌（Glomus intraradices）與毛根農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化的胡蘿卜根（Ri T-DNA transformed carrotroots）建立的雙重培養(yǎng)系統(tǒng)研究提出了AMF菌絲內(nèi)氮素運(yùn)轉(zhuǎn)模型，即AM真菌也可以從土壤吸收多種不同來源的氮，如NH4+、NO3-和氨基酸，這些不同的氮源通過AM真菌根外菌絲內(nèi)谷氨酰氨合成酶-谷氨酸合成酶（GS-GOGAT）途徑被吸收利用，而吸收的氮大都整合入精氨酸（Arg）分子，合成的精氨酸可以被AM真菌根外菌絲完整地運(yùn)轉(zhuǎn)至根內(nèi)菌絲，而且可以在菌絲體內(nèi)雙向運(yùn)轉(zhuǎn)，再將被輸送的精氨酸通過尿素循環(huán)（urea cycle）釋放出N，以形式傳遞給植物寄主。這為進(jìn)一步研究AM真菌對(duì)氮素的吸收和傳遞特點(diǎn)提供了理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 離體培養(yǎng)菌根

采用分隔培養(yǎng)皿方法將毛根農(nóng)桿菌質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化的胡蘿卜根（Ri T-DNA trans-formed carrot roots）（Daucus carotaL.）于24℃培養(yǎng)在含有4 g·L-1植物膠的改進(jìn)型M培養(yǎng)基中[5]。菌根室的培養(yǎng)基依照J(rèn)in等[5]方法改進(jìn)后限制氮濃度。

1.2 對(duì)不同碳、氮源的吸收和13C/15N的標(biāo)記

氮素吸收和15N標(biāo)記實(shí)驗(yàn)在經(jīng)改良不含葡萄糖的 液 體M培 養(yǎng) 基 中 進(jìn) 行[18]。用180 mg·L-1CaCl2·2H2O代替288 mg·L-1Ca（NO3）2·4H2O，標(biāo)記的15N底物為氮素唯一來源。13C/15N標(biāo)記的底物（98%）為：[15N，98%]KNO3+13C1，2乙酸鹽或13C6-葡 萄 糖、[15N]KNO3（4 mmol·L-1）、15NH4NO3（4 mmol·L-1）、NH415NO3（4 mmol·L-1）和[15N，98%]15NH4SO4。標(biāo)記物溶液過濾消毒后加至60 mm滅菌培養(yǎng)皿中培養(yǎng)，不加其他氮源。配好培養(yǎng)基后調(diào)節(jié)pH至6.0。每種氮源重復(fù)處理6個(gè)培養(yǎng)皿，作為3個(gè)重復(fù)。

1.3 游離氨基酸提取

培養(yǎng)1天、3天、1周、3周和6周后，用38 μm網(wǎng)狀篩收集菌根和菌絲及孢子，去離子水清洗。樣品冷凍干燥后加入少許酸洗過的沙用研缽研磨，用4℃ NH4HCO3緩沖液（pH = 8，含0.2% NaN3）提取。提取液在40 mL NH4HCO3緩沖液中于4℃透析24 h，透析膜允許分子量2 000的分子透過。收集滲透液，冷凍干燥后-20℃儲(chǔ)存。然后溶解于2 mL 0.01 mol·L-1HCl，裝入陽離子交換柱（0.3 mL的DOWEX 50 X 8-200-陽離子型），柱先用2 mol·L-1NH4OH、2 mol·L-1HCl和去離子水潤(rùn)洗，再用去離子水洗至流出液為中性。用5 mL去離子水洗下柱的中性復(fù)合物，再用2 mL 1 mol·L-1的NH4OH洗脫收集游離氨基酸。洗提液收集后冷凍干燥用于GC-MS和HPLC分析。孢子中游離氨基酸提取和分析時(shí)用外標(biāo)法計(jì)算各種氨基酸的濃度，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.4 AM真菌菌根中可溶性蛋白質(zhì)的酶水解

1.3中透析膜內(nèi)物質(zhì)離心后，上層含有可溶性蛋白質(zhì)，冷凍干燥后重新懸浮在600 μL 20 mmol·L-1的NH4HCO3緩沖液中（pH = 8，含0.2% NaN3）。加入新鮮溶解蛋白酶（2 μL氨肽酶M，2 μL鏈霉蛋白酶E，2 μL羧肽酶Y），30℃振蕩培養(yǎng)6 h。加入新鮮的酶繼續(xù)培養(yǎng)6 h，4℃ 10 000 r·min-1轉(zhuǎn)下離心10 min，上層清液冷凍干燥并重新懸浮于2 mL水中，隨后冷凍干燥懸浮于1 mL水中。所得可溶性蛋白氨基酸按照1.3步驟純化，用MS進(jìn)行15N的測(cè)定。

1.5 自由氨基酸的同位素分析

用GC-MS分析標(biāo)記氨基酸[5]。從組織中提取的氨基酸進(jìn)行衍生化反應(yīng)。先加入10～20 μL的N，N-二甲基甲酰胺（DMF），根據(jù)樣品量加30～50 μL的N-甲基-N-特丁基二甲基硅烷-三氟乙酰胺（MTBSTFA），110℃電爐上加熱30 min。

甲硅烷基化的提取物注射入Finnigan Trace MS 2000設(shè)備，0.25 μm厚的石英毛細(xì)管柱（直徑0.25 mm，長(zhǎng)30 m，RTX-5MS，Restek Inc.Flemington，NJ），此柱連接到質(zhì)譜儀的四極質(zhì)量檢測(cè)器（Thermo Electron，Madison WI）上，He作為載氣，流速1 mL·min-1。程序升溫：110℃ 2 min，10℃·min-1升溫至260℃，維持5 min。電子沖擊離子化能量70 eV，檢測(cè)器掃描質(zhì)量范圍150～600 m·z-1，時(shí)間0.5 s，與20種標(biāo)準(zhǔn)氨基酸比較，鑒定樣品中的氨基酸。除Arg外，Orn和其他氨基酸通過N-（特丁基二甲基硅）-N-甲基三氟乙酰胺（MTBSTFA）衍生化后測(cè)定M-57離子確定。

1.6 HPLC分析氨基酸的含量

根據(jù)Endres和Mercier[19]的方法用WatersTM（Milford，MA）717HPLC系統(tǒng)測(cè)定各種氨基酸含量。設(shè)備包括Waters510自動(dòng)取樣器和泵，一個(gè)Waters可調(diào)吸收檢測(cè)器和Millenium數(shù)據(jù)處理軟件。提取的氨基酸溶解于500 μL 0.1 mol·L-1HCl，Pico-Tag工作臺(tái)上真空干燥，加入乙醇、水和三乙胺（體積比2︰2︰1）后真空干燥。隨后加入乙醇、水、三乙胺和異硫氰酸苯酯（體積比7︰1︰1︰1）室溫放置20 min，進(jìn)行氨基酸衍生反應(yīng)，衍生物真空干燥后備用。每個(gè)樣品取20 μL注射至反相C18柱（3.9 mm內(nèi)徑× 150 mm長(zhǎng)）。38 mL的Pico-Tag洗脫液A和B作為流動(dòng)相；洗脫液流速為1 mL·min-1，其中洗脫液B比例逐漸上升。檢測(cè)波長(zhǎng)254 nm。測(cè)定前所有溶液真空條件除氣1 min。與已知標(biāo)準(zhǔn)氨基酸的峰值和保留時(shí)間比較，計(jì)算樣品中各種氨基酸的含量。

1.7 AM真菌不同無機(jī)態(tài)氮吸收利用對(duì)寄主植物甜玉米生長(zhǎng)的實(shí)驗(yàn)

在特制培養(yǎng)盒中加入適量滅菌的沙土。選取飽滿的新鮮甜玉米種子，消毒后播種。接種 AM 真菌根內(nèi)球囊霉（G. intraradices），每隔一周，施加改良的霍格蘭德營(yíng)養(yǎng)液 50 mL補(bǔ)充營(yíng)養(yǎng)，培養(yǎng)一段時(shí)間后移栽入大田中。繼續(xù)施加改良的霍格蘭德營(yíng)養(yǎng)液，共施加5次，同時(shí)補(bǔ)充不同氮素（尿素、尿素+有機(jī)肥、硝酸鉀、硝酸鈣和硫酸銨）。氮濃度為 4 mmol·L-1的無機(jī)氮源。此外，分別施加濃度為0.15 g·L-1（高磷）和 0.05 g·L-1（低磷）的磷酸二氫鉀溶液，每次100 mL。實(shí)驗(yàn)玉米共生長(zhǎng)60 d后回收分析其株重。甜玉米試驗(yàn)每種氮源重復(fù)處理15株。

1.8 統(tǒng)計(jì)分析

對(duì)重復(fù)樣品分析得到的結(jié)果采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行相關(guān)統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié) 果

2.1 AM真菌對(duì)不同無機(jī)態(tài)氮素的吸收特征

圖1 AM真菌共生系統(tǒng)中菌絲室用15NH4NO3或NH415NO3處理6天時(shí)其根外菌絲（a）和菌根組織（b）自由氨基酸的15N標(biāo)記Fig. 1 15N labelling of free amino acids in extraradical mycelium（ERM）（a）and mycerrhizal tissues（b）in the hypha compartment of the AM fungi symbiosis treated with 15NH4NO3，NH415NO3 or 15NH4 for 6 days

2.2 AM真菌共生系統(tǒng)中外源碳和氮源對(duì)菌絲合成精氨酸的影響

AM真菌根外菌絲加13C6-葡萄糖培養(yǎng)6周后，菌根組織的精氨酸和蛋白質(zhì)中均未發(fā)現(xiàn)13C（表1），說明其根外菌絲不能利用葡萄糖。而無侵染的根組織培養(yǎng)于13C6-葡萄糖6周后，根組織中的自由精氨酸13C豐度為22.8%±1.8%，根蛋白質(zhì)中13C豐度為17.7%±1.0%，表明根組織可以吸收利用葡萄糖合成精氨酸，其自由精氨酸濃度為10.9%±4.8%，菌根蛋白質(zhì)中精氨酸濃度為10.2%±0.5%。菌絲室加13C1，2-乙酸鈉后，菌根組織的精氨酸和蛋白質(zhì)中都發(fā)現(xiàn)有13C標(biāo)記，分別為8.5%±2.3%和7.6%±0.7%，說明其根外菌絲能吸收利用乙酸鹽中的碳素，此時(shí)其自由精氨酸濃度為10.3%±0.3%，菌根蛋白質(zhì)中精氨酸濃度為8.3%±0.8%。

表1 外源碳和氮源對(duì)菌根組織及其蛋白質(zhì)中精氨酸濃度和同位素豐度的影響Table 1 Effect of exogenous carbon and nitrogen input on formation and 13C/15N labelling of Arg in mrcorrhizal tissues and protein

菌絲室加13C1，2乙酸鈉+15NO3后，隨著氮源的增加，其自由精氨酸濃度提高為54.2%±19.3%，菌根蛋白質(zhì)中精氨酸濃度變化不大，為8.0%±0.7%；同時(shí)菌根組織的精氨酸和蛋白質(zhì)中C/N同位素標(biāo)記豐度大大提高，分別為57.4%±4.8%和50.3%±2.8%。說明菌絲室增加可利用碳源乙酸和氮源，可以提高精氨酸的合成。

2.3 AM真菌吸收利用不同無機(jī)態(tài)氮對(duì)寄主植物甜玉米生長(zhǎng)的影響

大田試驗(yàn)中（如圖2），在低磷條件下，接種AM真菌并添加硝酸鉀菌根化玉米莖葉重明顯提高，相對(duì)無菌根化低磷條件下的甜玉米提高了12.28%，其次硝酸鈣也有提高作用，可提高2.94%；硫酸銨則不如硝酸鉀對(duì)AM真菌菌根化甜玉米株重的促進(jìn)作用，反而是降低了其生物量8.19%，尿素則降低了13.02%，但尿素和有機(jī)肥則緩解這種生物量抑制作用。

圖2 不同氮素形態(tài)在高磷和低磷下對(duì)甜玉米株重的影響Fig. 2 Effect of form of applied nitrogen on per-plant weight of sweet corn cultured in soil high/low in P concentration

在高磷條件下，接種AM真菌并添加硝酸鉀菌根化玉米穗重顯著提高，相對(duì)無菌高磷提高達(dá)31.75%，其次硝酸鈣提高2.43%；硫酸銨則不如硝酸鉀，只有1.32%，尿素在高磷下則減少其生物量11.97%，施加尿素和有機(jī)肥則緩解抑制作用，反而提高3.52%。

3 討 論

3.1 AM真菌吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)無機(jī)態(tài)氮素的模式差異

3.2 外源碳和氮素對(duì)AM真菌合成精氨酸的影響

精氨酸是AM真菌菌絲轉(zhuǎn)運(yùn)氮素的載體。在菌絲和菌根組織中的精氨酸濃度反映了其合成、轉(zhuǎn)運(yùn)及分解的平衡結(jié)果。Jin等[5]用HPLC分析了AM菌絲吸收利用合成精氨酸的濃度，是菌絲中自由氨基酸的主要成分。本研究發(fā)現(xiàn)AM真菌根外菌絲加13C6-葡萄糖，培養(yǎng)6周后，菌根組織的精氨酸和蛋白質(zhì)均未發(fā)現(xiàn)13C，說明其根外菌絲不能利用葡萄糖。菌絲室加13C1，2乙酸鈉后，菌根組織的精氨酸和蛋白質(zhì)中均發(fā)現(xiàn)13C，說明其根外菌絲能吸收利用乙酸鹽中的碳素；菌絲室加13C1，2乙酸鈉+15NO3后，隨著氮源的增加，其自由精氨酸濃度提高為54.2%±19.3%，菌根蛋白質(zhì)中精氨酸濃度變化不大；同時(shí)菌根組織的精氨酸和蛋白質(zhì)中C/N同位素標(biāo)記豐度大大提高。說明菌絲室增加可利用碳源乙酸和氮源，可以提高精氨酸的合成，但是不清楚精氨酸合成是在根內(nèi)菌絲還是寄主根內(nèi)合成為主。在AM真菌共生系統(tǒng)施加有機(jī)質(zhì)，可以部分分解為氨基酸和有機(jī)酸（乙酸等）等再被菌絲吸收利用，減少?gòu)募闹魑仗妓衔?，從而緩解AM真菌對(duì)寄主生物量的抑制作用。

3.3 AM真菌吸收不同氮素對(duì)寄主植物生長(zhǎng)的影響

大田試驗(yàn)中，本研究發(fā)現(xiàn)在低磷條件下，接種AM真菌并添加硝酸鉀后，菌根化玉米莖葉重明顯提高。硫酸銨則不如硝酸鉀對(duì)AM真菌菌根化甜玉米株重的促進(jìn)作用，尿素則降低了13.02%，但是尿素再加有機(jī)肥則可以緩解這種生物量抑制作用。Thirkell等[27]也報(bào)道了AM真菌菌絲接觸有機(jī)質(zhì)后可以提高寄主植物氮和磷水平，同時(shí)也提高了寄主生物量。

在高磷條件下，接種AM真菌并添加硝酸鉀后，菌根化玉米穗重明顯提高；硫酸銨則不如硝酸鉀，尿素在高磷下則減少其生物量11.97%，施加有機(jī)肥則緩解抑制作用，反而提高3.52%。相比較，國(guó)內(nèi)鄧胤等[14]研究了不同氮磷水平對(duì)玉米生長(zhǎng)的影響，以NH4NO3為氮源，在高濃度外界氮和磷下，接種AM真菌對(duì)玉米營(yíng)養(yǎng)無貢獻(xiàn)，只有在正常氮濃度2 mol·L-1時(shí)，顯著提高生物量。顯然，該作者沒有區(qū)別AM真菌對(duì)不同無機(jī)態(tài)氮素的吸收差別。冉瓊和鐘章成[28]則發(fā)現(xiàn)AM真菌能夠通過促進(jìn)玉米幼苗N、P吸收及葉綠素含量增加，光化學(xué)效率、氣孔導(dǎo)度增大，從而提高玉米幼苗光合作用能力促進(jìn)生長(zhǎng)。

4 結(jié) 論

AM真菌對(duì)銨和硝態(tài)氮的吸收和轉(zhuǎn)運(yùn)有兩種不同模式，對(duì)于銨態(tài)氮（和尿素），AM真菌通過根外菌絲內(nèi)谷氨酰氨合成酶-谷氨酸合成酶（GS-GOGAT）途徑被吸收利用的，而吸收的氮大都整合入精氨酸（Arg）分子，合成的精氨酸可以被AM真菌根外菌絲完整地運(yùn)轉(zhuǎn)至根內(nèi)菌絲，而且可以在菌絲體內(nèi)雙向運(yùn)轉(zhuǎn)，再將被輸送的精氨酸通過尿素循環(huán)（urea cycle）釋放出N，以形式傳遞給植物寄主。對(duì)于硝態(tài)氮?jiǎng)t除了小部分被ERM吸收還原為進(jìn)入尿素循環(huán)，大部分則是通過根外菌絲轉(zhuǎn)運(yùn)（可以排除菌絲擴(kuò)散作用，經(jīng)檢測(cè)培養(yǎng)基中濃度很低，數(shù)據(jù)未發(fā)表）至IRM的叢枝結(jié)構(gòu)（檢測(cè)菌根組織中積累了數(shù)據(jù)未發(fā)表），進(jìn)而推測(cè)在硝酸鹽還原酶（Nitrate reductase）和亞硝酸鹽還原酶作用下形成銨，再傳遞給寄主植物利用（硝酸還原酶基因表達(dá)數(shù)據(jù)；宿主植物受到AM真菌誘導(dǎo)的銨吸收轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因的表達(dá)數(shù)據(jù)在后續(xù)文章中發(fā)表）。這個(gè)新模式是首次報(bào)道了硝態(tài)氮轉(zhuǎn)運(yùn)吸收途徑。