外泌體來源的環(huán)狀RNA在腫瘤診療中的價值

楊文靜， 呂麗華， 姚嘉怡， 王 皓， 張春燕， 王蓓麗， 潘柏申， 郭 瑋

（1.復(fù)旦大學附屬中山醫(yī)院檢驗科，上海 200032；2.復(fù)旦大學附屬中山醫(yī)院廈門醫(yī)院檢驗科，福建 廈門 361015）

外泌體是由多種細胞分泌的、粒徑為30～150 nm的小膜泡，存在于血液、尿液、腦脊液、唾液和乳汁等體液中。外泌體內(nèi)容物廣泛，包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)和核酸[DNA、mRNA、微小RNA（microRNA，miRNA）、環(huán)狀RNA（circular RNA，circRNA）等][1]。circRNA是一類以共價封閉環(huán)為特征，無5'和3'末端頭尾結(jié)構(gòu)，廣泛存在于真核細胞中的特殊RNA分子，與多種人類疾病的發(fā)病機制相關(guān)[2]。LI等[3]的研究結(jié)果顯示，血漿外泌體中穩(wěn)定存在大量circRNA。本文對外泌體來源的circRNA在腫瘤中的生物學功能，及其作為腫瘤早期診斷和預(yù)后評估標志物的潛在應(yīng)用作一綜述。

1 外泌體及其生物學功能

外泌體最早于1983年在綿羊網(wǎng)織紅細胞中被發(fā)現(xiàn)，1989年由Johnstone命名。外泌體的形成是一個連續(xù)性的過程，主要包括內(nèi)吞、融合和外排，即膜內(nèi)陷形成動態(tài)亞細胞結(jié)構(gòu)的多囊體，多囊體有2種結(jié)局：（1）與溶酶體融合，其內(nèi)的管腔狀囊泡發(fā)生降解；（2）與細胞膜融合，其內(nèi)的管腔狀囊泡再次凹陷，以內(nèi)出芽方式形成顆粒狀小囊泡，并被釋放入細胞外環(huán)境，即外泌體[4]。

外泌體的主要功能是在生理和病理條件下通過其內(nèi)容物介導(dǎo)細胞間通信。另外，外泌體在凝血、抗原提呈、免疫調(diào)節(jié)和病毒復(fù)制等方面也發(fā)揮了一定作用。外泌體內(nèi)容物，如蛋白質(zhì)、mRNA、miRNA等被證實可在受體細胞中起作用，從而激活多種信號通路[5]。腫瘤細胞可比正常細胞分泌更多的外泌體，且內(nèi)容物有一定差異，腫瘤細胞來源的外泌體可為腫瘤的發(fā)展提供合適的微環(huán)境，如細胞增殖、血管生成和轉(zhuǎn)移、耐藥及轉(zhuǎn)移前微環(huán)境的形成[6]。

2 circRNA及其生物學功能

circRNA和線性RNA都起源于前體mRNA，但是與經(jīng)典剪接產(chǎn)生的線性RNA相反，circRNA通常是通過反向剪接形成的。circRNA源自基因組的所有區(qū)域，包括基因間、內(nèi)含子、反義和非翻譯區(qū)。根據(jù)其來源，circRNA可分為三大類：外顯子circRNA、外顯子-內(nèi)含子circRNA和環(huán)狀內(nèi)含子RNA。由于circRNA具有共價閉環(huán)的特殊化學結(jié)構(gòu)，因此不易被核酸外切酶降解，比線性RNA更穩(wěn)定[2]。

circRNA起初被認為是由剪接錯誤而產(chǎn)生的無功能的副產(chǎn)物。隨著高通量測序技術(shù)和生物信息學研究的發(fā)展，在哺乳動物細胞中發(fā)現(xiàn)大量circRNA，充分表明其具有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、高度保守、表達量豐富的特征[7]。circRNA的主要生物學功能包括：（1）競爭性結(jié)合miRNA，調(diào)控靶基因表達；（2）與RNA結(jié)合蛋白相互作用，調(diào)控基因表達；（3）調(diào)節(jié)基因轉(zhuǎn)錄或剪接；（4）翻譯蛋白質(zhì)；（5）調(diào)節(jié)表觀遺傳。有研究結(jié)果顯示，circRNA與多種人類疾病的發(fā)病機制相關(guān)，包括神經(jīng)系統(tǒng)疾病、心血管疾病、類風濕性關(guān)節(jié)炎和糖尿病等。circRNA在腫瘤生長、轉(zhuǎn)移、干性和治療抗性中起關(guān)鍵作用，可作為癌癥診斷和預(yù)后的生物標志物[8]。

3 外泌體circRNA在腫瘤中的生物學功能

外泌體參與了腫瘤轉(zhuǎn)移前微環(huán)境和腫瘤微環(huán)境的形成。另外，通過介導(dǎo)免疫抑制和免疫監(jiān)視，外泌體與腫瘤復(fù)發(fā)和腫瘤細胞的存活相關(guān)[9]。LI等[3]發(fā)現(xiàn)多種癌細胞系（結(jié)腸癌、肺癌、胃癌、乳腺癌和宮頸癌）衍生的外泌體中穩(wěn)定存在著大量circRNA，并可在患者血清、尿液和腫瘤組織中被檢測到。已有大量研究證實circRNA可能與惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)，可調(diào)控細胞增殖、腫瘤轉(zhuǎn)移以及化療藥物耐藥，見表1。

3.1 調(diào)控腫瘤細胞增殖

增殖失調(diào)是腫瘤轉(zhuǎn)化中重要的因素之一，因此細胞周期的調(diào)控機制日益受到關(guān)注。近年來，越來越多的外泌體circRNA在各類癌癥中調(diào)控腫瘤細胞增殖的作用被揭示。如：外泌體來源的circRASSF2可促進喉鱗狀細胞癌的進展，與對照組相比，在腫瘤組織中circRASSF2的表達顯著且持續(xù)增加，下調(diào)外泌體circRASSF2通過miRNA-302b-3p/IGF-1R軸可顯著抑制細胞增殖[10]。

長期暴露于亞砷酸鹽會誘導(dǎo)人肝上皮細胞（L-02）發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化，并引起circ_100284過度表達，circ_100284可能會通過外泌體從轉(zhuǎn)化的L-02細胞轉(zhuǎn)移到正常細胞中。在正常細胞中，外泌體circ_100284通過與miRNA-217相互作用，加速了細胞周期并促進細胞增殖。這表明外泌體circRNA在細胞間的通信中起信使的作用，并提示了亞砷酸鹽誘導(dǎo)的致癌機制[32]。外泌體circDB在高體脂率的肝細胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）患者中上調(diào)，脂肪細胞分泌的外泌體circDB可通過抑制miRNA-34a并激活USP7/Cyclin A2信號通路，調(diào)節(jié)HCC中的去泛素化，從而促進細胞生長并減少DNA損傷[11]。

在結(jié)直腸癌中，circIFT80通過進入外泌體促進結(jié)直腸癌的發(fā)展，通過miRNA-1236-3p/HOXB7軸，促進DNA合成和抑制細胞凋亡[12]。結(jié)直腸癌患者血清外泌體中circFMN2呈高表達并與miRNA-1182水平呈負相關(guān)，circFMN2與miRNA-1182結(jié)合可顯著促進結(jié)直腸癌細胞增殖，這提示外泌體circFMN2在促進結(jié)直腸癌腫瘤生長中起重要作用[13]。

此外，外泌體來源的circNRIP1作為miRNA-149-5p的海綿，可影響AKT1/mTOR信號通路，并促進胃癌細胞增殖[14]；外泌體來源的circ_0044516作為miRNA-29a-3p海綿，可促進前 列腺癌細胞增殖[15]。

表1 外泌體來源的circRNA在腫瘤中的生物學功能

3.2 調(diào)控腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移

外泌體可介導(dǎo)原發(fā)性腫瘤部位和遠處轉(zhuǎn)移部位之間的分子通訊及物質(zhì)轉(zhuǎn)移，通過調(diào)節(jié)包括上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）在內(nèi)的一系列細胞活動，外泌體在腫瘤細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲中起重要作用[33]。

WANG等[16]發(fā)現(xiàn)外泌體circPTGR1有助于HCC的轉(zhuǎn)移，circPTGR1的高表達與臨床分期和預(yù)后有關(guān)，敲除外泌體circPTGR1的表達顯著抑制了腫瘤在非轉(zhuǎn)移和低轉(zhuǎn)移細胞系中的侵襲和轉(zhuǎn)移。外泌體circPTGR1還可與MET相互作用，靶向競爭miRNA449a，從而導(dǎo)致腫瘤微環(huán)境失調(diào)，并促進HCC的發(fā)展。外泌體circ_100338參與了HCC中血管生成和轉(zhuǎn)移的調(diào)控，與HCC的進展密切相關(guān)[17]。此外，過表達circCdr1as的HCC細胞可通過外泌體的傳遞加速周圍正常細胞的增殖和轉(zhuǎn)移能力[18]。

外泌體circRNA與胃癌的相關(guān)研究結(jié)果顯示，circNRIP1可通過外泌體在胃癌細胞之間傳遞，并作為miRNA-149-5p海綿影響Akt1/mTOR信號通路，從而促進胃癌細胞轉(zhuǎn)移[14]。circRanGAP1在胃癌患者癌組織和血漿外泌體中均顯著上調(diào)，該分子通過miRNA-877-3p/VEGFA軸可增強胃癌細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲能力[19]。最新的研究結(jié)果[20]顯示，來自胃癌細胞的外泌體將ciRS-133傳遞到前脂肪細胞中，通過激活PRDM16和抑制miRNA-133來促進前脂肪細胞向褐色樣細胞分化；進一步敲低ciRS-133可使小鼠的癌癥惡病質(zhì)明顯減少，提示外泌體傳遞的ciRS-133參與了白色脂肪組織褐變并在癌癥相關(guān)惡病質(zhì)中起關(guān)鍵作用。

某些外泌體circRNA的表達在胰腺癌的進展和轉(zhuǎn)移中起重要作用。LI等[21]發(fā)現(xiàn)外泌體circPED8A在胰腺癌組織中呈高表達，且與淋巴管浸潤、TNM分期和低生存率有關(guān)，circPDE8A可通過上調(diào)MET（上皮性腫瘤的關(guān)鍵癌基因之一）來促進腫瘤細胞的生長。此外，腫瘤細胞分泌的circPDE8A可通過外泌體被釋放到血液循環(huán)中，作為miRNA-338海綿調(diào)節(jié)MACC1，并通過MET/絲裂原活化蛋白激酶1（mitogenactivated protein kinase 1，MAPK1）或蛋白激酶B途徑促進侵襲性轉(zhuǎn)移。此外，還有學者[22]發(fā)現(xiàn)由胰腺癌細胞分泌的外泌體中的circIARS在胰腺癌組織中廣泛表達，其表達水平與肝轉(zhuǎn)移、血管侵犯和TNM分期呈正相關(guān)（肝轉(zhuǎn)移：P=0.011；血管侵犯：P=0.020；TNM：P=0.023）。CircIARS可通過衍生自胰腺癌細胞的外泌體進入人微血管靜脈內(nèi)皮細胞，下調(diào)miRNA-122和緊密連接蛋白-1（zonula occludens 1，ZO-1）的水平，上調(diào)RhoA和RhoA-GTP的水平，增加F-肌動蛋白的表達和黏著斑，使內(nèi)皮單層通透性增加，促進腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移。

CHEN等[23]分離了膀胱尿路上皮癌患者血清和尿液中的外泌體，結(jié)果顯示，這些外泌體中的circPRMT5均顯著上調(diào)，circPRMT5可充當miRNA-30c海綿，通過circPRMT5/miRNA-30c/SNAIL1/E-鈣黏蛋白1途徑促進EMT。有研究結(jié)果顯示，血清和尿液外泌體中高表達的circPRMT5與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和晚期腫瘤進展呈正相關(guān)（P＜0.05）。在卵巢癌中，外泌體通過轉(zhuǎn)移circPUM1和circWHSC1，作用于腹膜間皮細胞，從而促進腫瘤轉(zhuǎn)移[24-25]。除此之外，結(jié)直腸癌[12，26]、膽管癌[27]相關(guān)研究也發(fā)現(xiàn)了外泌體circRNA促進腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的作用。

3.3 調(diào)控腫瘤化療耐藥

對化療藥物耐藥是腫瘤治療的巨大障礙。有研究結(jié)果顯示，外泌體可在癌細胞之間傳遞耐藥性[34]，其內(nèi)容物circRNA在化療耐藥傳遞中的重要作用也逐漸被揭示。LI等[28]的研究結(jié)果顯示，與對照組相比，小細胞肺癌組血清外泌體FLI1外顯子circRNA（FECR1）異常上調(diào)，且與患者低生存率相關(guān)。circCdr1as參與了卵巢癌順鉑耐藥的形成，作為miRNA海綿下調(diào)miRNA-1270，而SCAI是miRNA-1270的靶基因，可增強卵巢癌細胞對順鉑的敏感性。順鉑耐藥組的血清外泌體circCdr1as與順鉑敏感組相比異常下調(diào)，且circCdr1as的表達水平與miRNA-1270的表達水平呈顯著負相關(guān)（r=-0.679，P=0.000）[29]。由此可見，外泌體circRNA失調(diào)與化療藥物耐藥之間可能存在一定的聯(lián)系。

外泌體circRNA在調(diào)節(jié)化療藥物耐藥中發(fā)揮著重要作用。circ_0000338是來自FCHSD2基因的circRNA，該基因參與編碼內(nèi)吞作用和膜受體內(nèi)在化的蛋白質(zhì)。circ_0000338通過耐奧沙利鉑HCT116細胞系（HCT116-R）分泌的外泌體選擇性轉(zhuǎn)移到共培養(yǎng)的親本HCT116細胞系（HCT116-P）后，與對照細胞相比，HCT116-P細胞在藥物治療中的生存力顯著提高[30]。外泌體中circ_0000338上調(diào)可作為早期預(yù)測結(jié)直腸癌化療藥物耐藥性的潛在生物標志物[30]。

惡性腫瘤通常依靠有氧糖酵解來產(chǎn)生三磷酸腺苷，以實現(xiàn)快速生長和化療藥物的耐藥性。M2-PK在催化糖酵解中起關(guān)鍵作用。有研究結(jié)果顯示，M2-PK在結(jié)直腸癌細胞中的表達有異質(zhì)性，即在耐奧沙利鉑的結(jié)直腸癌細胞中較高，在奧沙利鉑敏感的細胞中相對較低。miRNA-122與化學抗性呈正相關(guān)，耐奧沙利鉑細胞的外泌體將ciRS-122傳遞至敏感細胞，通過吸附miRNA-122和上調(diào)M2-PK來促進糖酵解和耐藥性，這種細胞間的信號傳遞可提示潛在的新型治療靶點，并為外泌體在耐藥性結(jié)直腸癌中的臨床應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)[31]。

4 外泌體circRNA在腫瘤診斷及預(yù)后評估中的價值

circRNA在外泌體中富集并具有良好的穩(wěn)定性，可從人血清、尿液等體液中檢測到。腫瘤患者體內(nèi)外泌體circRNA的表達譜與健康人群有一定區(qū)別[9]。因此，外泌體circRNA具有極大的潛力作為某些腫瘤非侵入性早期診斷和預(yù)后評估的分子標志物。

與含有野生型和G13D突變體KRAS等位基因細胞系（DLD-1）和K-ras突變型結(jié)直腸癌細胞（DKO-1）相比，K-ras野生型結(jié)直腸癌細胞DKs-8中外泌體circRNA水平顯著上調(diào)，提示外泌體circRNA或可作為結(jié)直腸癌的生物標志物[35]。有研究結(jié)果顯示，與對照組相比，不同TNM分期的結(jié)直腸癌患者血清外泌體circ_0004771均顯著上調(diào)（P=0.017），circ_0004771診斷結(jié)直腸癌的曲線下面積（area under curve，AUC）為0.88，敏感性為80.91%，特異性為82.86%；Ⅰ～Ⅱ期結(jié)直腸癌患者血清外泌體circ_0004771顯著高于正常對照組（P＜0.001），且診斷Ⅰ～Ⅱ期結(jié)直腸癌的AUC為0.86，敏感性為81.43%，特異性為80.00%[36]。BARBAGALLO等[37]發(fā)現(xiàn)，結(jié)直腸癌患者血清外泌體circHIPK3顯著上調(diào)，診斷結(jié)直腸癌的AUC為0.771，敏感性為71%，特異性為80%。SHAO等[38]發(fā)現(xiàn)，早期胃癌（early gastric cancer，EGC）患者血漿外泌體circ_0065149顯著低于健康對照者（P＜0.001），篩查EGC的AUC為0.64，敏感性（48.7%）和特異性（90.2%）均高于傳統(tǒng)的腫瘤標志物（癌胚抗原、糖類抗原19-9和糖類抗原125）。另外，外泌體來源的circ_0051443表達在HCC患者血漿中下調(diào)，可抑制HCC的進展，其診斷HCC的AUC為0.808 9[39]。

LI等[28]發(fā)現(xiàn)，小細胞肺癌患者血清外泌體FECR1異常上調(diào)，發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移的患者外泌體FECR1表達水平更高，且血清FECR1水平與小細胞肺癌患者的化療反應(yīng)密切相關(guān)。因此，F(xiàn)ECR1可作為評估小細胞肺癌進展的生物標志物。WANG等[40]發(fā)現(xiàn)肺腺癌患者血清外泌體circ_002178顯著上調(diào)，通過吸附miRNA-34和miRNA-28-5p增強細胞程序性死亡配體1（programmed cell death ligand 1，PDL1）表達，circ_002178可作為肺腺癌的非侵入性診斷標志物，其AUC為0.996 7。CHEN等[41]全面分析了肺腺癌組和健康對照組血漿外泌體circRNA的表達譜，發(fā)現(xiàn)circ_0001492和circ_0001346的表達水平在早期肺腺癌中上調(diào)，但在健康對照組的血漿外泌體中幾乎檢測不到，這提示circ_0001492和circ_0001346或可作為新型肺腺癌早期候選診斷標志物。

有學者采用生物信息學分析和實時熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)技術(shù)發(fā)現(xiàn)circ_00005795和circ_0088088可能起競爭內(nèi)源性RNA的作用，通過對比乳腺癌患者和健康對照者血清外泌體circRNA的表達，2種circRNA對乳腺癌均具有重要的診斷價值，為預(yù)測乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移提供了理論基礎(chǔ)[42-43]。除此之外，外泌體來源的circRNA對前列腺癌[15]、胰腺癌[21-22]、膀胱尿路上皮癌[23]、膽管癌[27]、子宮內(nèi)膜癌[44]、甲狀腺癌[45]、食管鱗狀細胞癌[46]等惡性腫瘤也有重要的診斷價值。這為尋找針對不同腫瘤的強有力的診斷標志物提供了新的方向。盡管外泌體circRNA成為新型腫瘤標志物的潛力巨大，但目前對外泌體circRNA的了解仍處于起步階段，而且大部分研究只是提出了新思路，這些分子是否可以成為腫瘤標志物仍需要進一步研究驗證。circRNA在不同腫瘤中的應(yīng)用見表2。

表2 外泌體來源的circRNA在不同腫瘤中的應(yīng)用

續(xù)表2

5 結(jié)論

外泌體circRNA可調(diào)節(jié)腫瘤細胞的增殖、轉(zhuǎn)移和耐藥，是腫瘤研究的新熱點。更重要的是，circRNA具有高度保守的特征和組織/發(fā)育特異性表達模式，可在外泌體中富集，能從體液中檢測到。因此，除了揭示腫瘤的發(fā)病機制外，探索外泌體和circRNA的聯(lián)系還有助于尋找新的潛在的腫瘤生物標志物或治療靶點。目前，僅有少數(shù)circRNA具有確定的功能或臨床應(yīng)用價值。與mRNA和miRNA相比，我們對外泌體circRNA的認識還是有限的：大量的外泌體circRNA及其作用機制尚未被發(fā)現(xiàn)和揭示；在現(xiàn)有的一些研究中，外泌體circRNA對不同腫瘤的診斷價值尚缺乏實驗驗證；與循環(huán)游離circRNA相比，外泌體circRNA的優(yōu)勢也尚未被驗證。因此，外泌體circRNA作為未來研究的熱點之一，其臨床應(yīng)用價值還需要有足夠的理論研究結(jié)果來支持。