細(xì)胞外囊泡檢測技術(shù)及其臨床應(yīng)用進(jìn)展

劉春辰， 林慧嫻， 鄭 磊

（南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院檢驗科，廣東 廣州 510515）

細(xì)胞外囊泡（extracellular vesicle，EV）是細(xì)胞分泌至胞外的一種含脂質(zhì)雙分子層的膜性囊泡，依據(jù)其形成機制與直徑差異，可分為外泌體、微囊泡與凋亡小體三大亞群，EV內(nèi)含特異性蛋白質(zhì)、活性核酸和脂質(zhì)，有望成為揭示疾病發(fā)生機制和應(yīng)用于臨床診療領(lǐng)域的一種新型標(biāo)志物[1]。在機體中，EV以非均一膜性囊泡的結(jié)構(gòu)廣泛散在于各類體液中，包括血漿、血清、唾液、乳汁和尿液等[2]。作為“液體活檢”的后起之秀，EV豐度遠(yuǎn)高于循環(huán)腫瘤細(xì)胞，且受膜形式的保護，其內(nèi)容物穩(wěn)定性較好，克服了體液樣本中ctDNA易降解等弊端[3]。相對于組織病理檢查，基于血液等樣本的EV檢測具有無創(chuàng)、取樣簡便等優(yōu)勢，患者依從性更高，便于病情監(jiān)測，易于及時調(diào)整治療方案；與傳統(tǒng)血清游離核酸與蛋白標(biāo)志物檢測相比，EV檢測具有靶向性顯著、信息量更豐富、檢測基質(zhì)干擾小等優(yōu)勢[4-5]。因此，EV對疾病的早期診斷和療效監(jiān)測有重要的臨床價值。本文對目前常用的EV分離富集和鑒定技術(shù)，以及EV不同內(nèi)容物的檢測技術(shù)的優(yōu)缺點和臨床應(yīng)用進(jìn)行綜述。

1 EV分離富集技術(shù)與檢測

基于EV大小、密度等物理性質(zhì)及其特有的蛋白質(zhì)生物學(xué)特性，去除體液樣本中雜質(zhì)蛋白、脂質(zhì)等復(fù)雜成分的干擾，實現(xiàn)EV的分離富集，是其內(nèi)容物準(zhǔn)確分析的前提。EV分離富集的回收率、純度及其活性直接影響著EV后續(xù)鑒定與內(nèi)容物檢測。目前EV常用的分離富集技術(shù)及其優(yōu)缺點見表1。超速離心法是目前被廣泛認(rèn)可的EV分離富集的金標(biāo)準(zhǔn)。TIAN等[6]對包括超速離心法在內(nèi)的尺寸排阻色譜法等6種EV分離富集技術(shù)進(jìn)行了EV純度與分離效率的綜合評估，證實超速離心法分離所得的EV純度最高，可有效用于后續(xù)內(nèi)容物的檢測和分析。

2 EV鑒定分析技術(shù)與檢測

鑒于體液樣本成分的復(fù)雜性，體液樣本中存在許多干擾EV檢測的物質(zhì)，包括某些蛋白質(zhì)和顆粒性組分，且部分雜質(zhì)在大小與密度上與EV存在重疊，如脂蛋白等，可能會與EV共分離。為保證EV的準(zhǔn)確檢測，同時也為了保證不同研究結(jié)果的可信度與可重復(fù)性，有必要對分離出的EV進(jìn)行鑒定。依照國際細(xì)胞外囊泡協(xié)會（the International Society for Extracellular Vesicles，ISEV）發(fā)布的EV研究最低要求國際研究指南的要求，應(yīng)對EV進(jìn)行形態(tài)學(xué)特征、濃度、粒徑等非特異性鑒定和特定蛋白質(zhì)分子的特異性鑒定，可累加EV內(nèi)組分的拓?fù)滂b定[7]，為后續(xù)EV的準(zhǔn)確檢測提供必要保障。具體鑒定技術(shù)見表1。

表1 EV常用的分離富集與鑒定技術(shù)及其優(yōu)缺點

3 EV內(nèi)容物檢測技術(shù)

EV可選擇性包裹活性核酸、蛋白質(zhì)和脂質(zhì)，運載眾多信號分子，經(jīng)胞膜直接融合、配體-受體特異性結(jié)合以及胞吞等方式與靶細(xì)胞結(jié)合，通過釋放其內(nèi)容物發(fā)揮特定的生物學(xué)作用。因此，EV內(nèi)容物的檢測和分析是剖析EV功能的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，對揭示EV在疾病中的具體作用機制及EV的臨床應(yīng)用具有重要意義。目前，基于EV的臨床診斷技術(shù)的開發(fā)也大多聚焦于不同亞群特異性內(nèi)容物的檢測，主要包括核酸、蛋白質(zhì)，以及以脂質(zhì)為代表的代謝分子三大領(lǐng)域。

3.1 核酸檢測

EV的核酸內(nèi)容物包括RNA[mRNA、微小RNA（microRNA，miRNA）和其他非編碼RNA等]及DNA[21]，目前以RNA類的研究居多，主要反映EV實行具體功能的轉(zhuǎn)錄及其調(diào)控層面的信息。

針對RNA類內(nèi)容物，傳統(tǒng)的檢測技術(shù)包括瓊脂糖凝膠電泳、免疫印跡法、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）（熒光定量PCR[22]、液滴式數(shù)字PCR[23]）以及芯片技術(shù)、二代測序技術(shù)[22]等。其中芯片技術(shù)與測序技術(shù)適用于對樣本的RNA進(jìn)行高通量檢測，主要用于疾病特異性標(biāo)志物的篩選。PCR的靈敏度高，但易發(fā)生偏性擴增，應(yīng)避免因污染而產(chǎn)生的假陽性現(xiàn)象；同時，受引物合成技術(shù)的限制，PCR只能對已知序列的特定RNA進(jìn)行分析。

近年來，一系列針對EV的RNA內(nèi)容物的新型檢測平臺被開發(fā)出來，檢測原理呈多樣化趨勢，其中以熒光探針類研究居多，融合了納米技術(shù)、微流控技術(shù)，以及仿生學(xué)等不同學(xué)科的技術(shù)優(yōu)勢?；诙嗌珶晒釶CR的EV-lncRNA分析芯片[24]和功能化金納米熒光探針[25]均可通過熒光直接實現(xiàn)對靶RNA的高效檢測；其中功能化金納米熒光探針可實現(xiàn)外泌體miRNA-1246的原位檢測，可區(qū)分乳腺癌人群與健康人群。部分平臺則先通過疾病相關(guān)的特異性蛋白分子對靶外泌體實現(xiàn)捕獲，再檢測其RNA內(nèi)容物，進(jìn)一步提高特異性。YANG等[26]設(shè)計的免疫生物芯片通過靜電作用將含分子信標(biāo)的陽離子脂質(zhì)體與捕獲的外泌體融合，隨著分子信標(biāo)的注入實現(xiàn)miRNA-21和TTF-1 mRNA的高效檢測，可用于肺癌診斷。近期有研究報道的匯集了仿生學(xué)優(yōu)勢的微流控芯片——NanoVilli芯片，可有效提升肺癌EV中RNA的檢測靈敏度和特異性[27]。以上EV核酸檢測技術(shù)的總結(jié)與應(yīng)用見表2。

3.2 蛋白質(zhì)檢測

EV富含蛋白質(zhì)類標(biāo)志物，如熱休克蛋白、膜聯(lián)蛋白、整合蛋白、黏附分子、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子等[21]。蛋白質(zhì)作為生物學(xué)功能的主要執(zhí)行者，其攜帶的翻譯后分子水平信息，相對于核酸攜帶的轉(zhuǎn)錄水平信息，更契合EV的功能狀態(tài)，并可更直接地反映這一狀態(tài)。

傳統(tǒng)的檢測方法，如免疫印跡法[28]、ELISA[29]、流式細(xì)胞術(shù)[30]及質(zhì)譜[31]等可對EV中的蛋白質(zhì)類內(nèi)容物進(jìn)行定性和/或定量檢測。免疫印跡法和ELISA基于抗原-抗體特異性結(jié)合的原理，特異性好，但其受抗體制備技術(shù)的限制，且針對的僅是樣本總蛋白層面的特定蛋白分子；傳統(tǒng)的流式細(xì)胞術(shù)無法對小于200 nm的粒子進(jìn)行分析，限制了流式分析的在EV檢測中的應(yīng)用。近年來，傳統(tǒng)流式細(xì)胞術(shù)的改進(jìn)[32]和高敏流式細(xì)胞術(shù)[33]的出現(xiàn)，大大提高了儀器的檢測性能，使單個EV水平的多參數(shù)分析成為可能。質(zhì)譜[20]作為一種高通量技術(shù)，可同時檢測EV的多種蛋白質(zhì)標(biāo)志物，具有靈敏度高、分析速度快等優(yōu)勢。

蛋白質(zhì)標(biāo)志物作為剖析EV功能的重要組分，對其檢測的靈敏度、特異性及臨床有效性要求日益提升。近年來，不同原理的新技術(shù)平臺逐漸被應(yīng)用于EV的蛋白質(zhì)檢測中，并逐步用于臨床疾病的診療、病情監(jiān)測及預(yù)后評估等。陳賢華等[34]構(gòu)建的外泌體雙膜蛋白共表達(dá)檢測平臺，先用修飾有CD63抗體的磁珠實現(xiàn)外泌體的捕獲，再聯(lián)合適配體特異性結(jié)合與發(fā)夾催化自組裝信號放大技術(shù)（catalytic hairpin assembly，CHA）實現(xiàn)外泌體膜上的CD63和上皮細(xì)胞黏附分子（epithelial cell adhesion molecule，EpCAM）2種蛋白質(zhì)標(biāo)志物的同時檢測，可用于區(qū)分乳腺癌來源和正常乳腺上皮來源的外泌體。LIU等[35]報道了一種新技術(shù)——液滴數(shù)字外泌體酶聯(lián)免疫吸附試驗（exosome-counting enzyme-linked immunosobent assay，ExoELISA），該技術(shù)通過抗原-抗體特異性結(jié)合原理捕獲表達(dá)磷脂?；嫉鞍拙厶?1（glypican-1，GPC-1）的外泌體，并形成酶促分子標(biāo)記的ELISA夾心復(fù)合物，固定于磁性微珠上，最后將其包裹進(jìn)液滴中，實現(xiàn)了對靶外泌體的絕對定量。此外，集適體結(jié)合與滾環(huán)擴增技術(shù)于一體的熒光生物傳感平臺[36]、融合了聲學(xué)傳感優(yōu)勢的納米金標(biāo)記放大表面聲波（surface acoustic wave，SAW）傳感器[37]，以及電化學(xué)領(lǐng)域的Aptasensor[38]、微流控領(lǐng)域的Exodisc-B/P[39]等技術(shù)，在檢測EV的靈敏度與特異性方面均有明顯提升，部分檢測平臺已可用于疾病的診斷、預(yù)后評估等。以上新技術(shù)的總結(jié)見表2。

3.3 脂質(zhì)檢測

除活性核酸與蛋白質(zhì)外，EV中還含有以脂質(zhì)為代表的一系列代謝分子，包括膽固醇、神經(jīng)酰胺、磷脂酰絲氨酸（phosphatidylserine，PS）等[21]。目前，針對脂質(zhì)的檢測方法相對較少，主要為脂質(zhì)組學(xué)和代謝組學(xué)方法，如全反射傅里葉變換紅外光譜[40]、熒光測定法（使用DiR等親脂性熒光染料）[41]、薄層色譜法、高效液相色譜法及高通量質(zhì)譜[42]等。SMITH等[43]利用拉曼光譜以及主成分分析技術(shù)發(fā)現(xiàn)癌性與非癌性細(xì)胞系衍生的外泌體在膽固醇與磷脂的相對表達(dá)上存在差異，提示外泌體中的脂質(zhì)有成為腫瘤標(biāo)志物的潛力[43]。還有研究者通過高通量質(zhì)譜技術(shù)對前列腺癌患者及健康人尿液樣本中的外泌體脂質(zhì)進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)PS（18：1/18：1）與乳糖神經(jīng)酰胺（lactosylceramide，LacCer）（d18：1/16：0）等9種脂質(zhì)水平存在差異，其中LacCer（d18：1/16：0） /PS（18：1/18：1）比值與PS（18：0-18：2）/PS（18：1/18：1）比值聯(lián)合檢測區(qū)分前列腺癌患者與健康人的敏感性為93%、特異性為100%[42]。相關(guān)檢測技術(shù)及其應(yīng)用見表2。

表2 EV內(nèi)容物檢測新技術(shù)

4 總結(jié)和展望

EV作為一種蘊含豐富生物信息的循環(huán)標(biāo)志物，廣泛散布于各類體液中，且受脂質(zhì)雙分子膜的保護，內(nèi)容物穩(wěn)定，因此在豐度以及穩(wěn)定性上具有明顯優(yōu)勢，在疾病的早期診斷、病情動態(tài)監(jiān)測及預(yù)后評估等方面均具有巨大的應(yīng)用前景。近年來，各類新型檢測平臺的不斷被開發(fā)出來，在靈敏度、特異性及檢測時間上的性能均明顯提升，對EV內(nèi)容物（核酸、蛋白質(zhì)與脂質(zhì)等）有了更深入的研究，并開始關(guān)注單個EV水平的檢測，突出其異質(zhì)性，這有利于對EV進(jìn)行更深入、更精準(zhǔn)的功能分析，進(jìn)一步推動EV的臨床應(yīng)用進(jìn)程。然而，目前仍存在許多復(fù)雜因素，使EV檢測應(yīng)用于臨床疾病的精準(zhǔn)診療面臨諸多挑戰(zhàn)，如EV在樣本采集及保存過程中是否存在影響其檢測結(jié)果的因素尚不得而知，檢測的靈敏度、特異性、經(jīng)濟成本等方面如何平衡亦值得思考。此外，EV檢測技術(shù)尚缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)操作指南，臨床統(tǒng)一的參考區(qū)間仍處于空白，質(zhì)量控制體系亦不完善，各平臺的檢測結(jié)果難以進(jìn)行橫向比對，結(jié)果溯源鏈缺乏，這些問題均限制了EV的臨床應(yīng)用。未來，研究者們應(yīng)致力于充分發(fā)揮聲學(xué)、光學(xué)、電磁學(xué)、機械自動化以及納米技術(shù)等多學(xué)科優(yōu)勢，促進(jìn)EV檢測平臺向微型化、自動化和便捷化發(fā)展，同時完善EV的質(zhì)量控制體系，加快相應(yīng)參考區(qū)間的建立，以加速推進(jìn)EV檢測的臨床應(yīng)用進(jìn)程。