MiR-148b-3p通過(guò)調(diào)控CDKN1B表達(dá)影響心肌細(xì)胞增殖及凋亡的分子機(jī)制

王嘉明，郭麗敏，郭艷娟，程國(guó)良

急性心力衰竭等心血管疾病是臨床常見(jiàn)疾病，其發(fā)病率高且患者預(yù)后較差，已嚴(yán)重影響患者生活質(zhì)量，研究表明心肌細(xì)胞凋亡是引發(fā)心血管疾病發(fā)生的主要原因之一[1,2]。因而尋找心肌細(xì)胞凋亡相關(guān)基因或蛋白有助于提高心血管疾病治療效果及改善患者預(yù)后。微小RNA（miRNA）屬于內(nèi)源性非編碼單鏈小RNA分子，其可通過(guò)靶向調(diào)控下游靶基因表達(dá)從而影響細(xì)胞增殖、凋亡等生物學(xué)行為，研究表明miRNA在心肌細(xì)胞中異常表達(dá)并可能調(diào)控細(xì)胞增殖及凋亡等生物學(xué)過(guò)程[3]。相關(guān)報(bào)道指出微小RNA-148b-3p（miR-148b-3p）在缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中表達(dá)上調(diào)并可能參與心肌細(xì)胞損傷過(guò)程[4]。通過(guò)生物信息學(xué)分析顯示細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1B（CDKN1B）可能是miR-148b-3p的靶基因，研究表明CDKN1B表達(dá)下調(diào)并可能參與成纖維細(xì)胞增殖過(guò)程[5]。但miR-148b-3p是否可通過(guò)調(diào)控CDKN1B表達(dá)從而影響心肌細(xì)胞增殖及凋亡過(guò)程尚未可知。既往研究顯示脂多糖（LPS）可誘導(dǎo)心肌細(xì)胞凋亡并可造成心肌細(xì)胞損傷從而促進(jìn)心血管疾病的發(fā)生[6]。因此，本研究采用LPS處理心肌細(xì)胞，探討miR-148b-3p對(duì)LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞增殖及凋亡的影響，分析其對(duì)CDKN1B的靶向調(diào)控作用，旨在為闡明miR-148b-3p在心肌損傷中的作用機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑大鼠心肌細(xì)胞H9c2購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)。杜氏改良培養(yǎng)基（DMEM）、胎牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；LPS購(gòu)自北京百奧萊博科技有限公司；Trizol試劑、Lipofectamine2000、pcDNA3.1購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒與熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司；miR-148b-3p特異性寡核苷酸抑制劑（anti-miR-148b-3p）及其陰性對(duì)照（anti-miR-NC）、miR-148b-3p寡核苷酸模擬物（miR-148b-3p mimics）及陰性對(duì)照mimic NC序列（miR-NC）、CDKN1B小分子干擾RNA（si-CDKN1B）、亂序無(wú)意義陰性序列（si-NC）購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；甲基噻唑基四唑（MTT）購(gòu)自美國(guó)Sigma公司；膜聯(lián)蛋白V（annexin V）-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（PI）細(xì)胞凋亡試劑盒購(gòu)自上海朗智生物科技有限公司；RIPA裂解液與二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量檢測(cè)試劑盒購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；雙熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自美國(guó)Promega公司；兔抗鼠CDKN1B抗體購(gòu)自武漢艾美捷科技有限公司；兔抗鼠細(xì)胞周期蛋白1（CyclinD1）、P21、B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)蛋白（Bax）、B淋巴細(xì)胞瘤-2（Bcl-2）抗體購(gòu)自美國(guó)CST公司；辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購(gòu)自美國(guó)Abcam公司。

1.2 LPS處理與實(shí)驗(yàn)分組心肌細(xì)胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、100 U/ml青霉素與100 μg/ml鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基，培養(yǎng)條件：37 ℃、體積分?jǐn)?shù)5%CO2，待細(xì)胞生長(zhǎng)至80%融合度時(shí)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期心肌細(xì)胞，0.25%胰蛋白酶消化，加入培養(yǎng)基終止消化，制備細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞密度為1×105個(gè)/ml，接種于96孔板（100 μl/孔），繼續(xù)培養(yǎng)24 h，使用含有10 μg/ml的LPS處理H9c2細(xì)胞24 h，記作LPS組[7]。同時(shí)將正常培養(yǎng)的心肌細(xì)胞作為Con組。分別將antimiR-NC、anti-miR-148b-3p、pcDNA、pcDNACDKN1B、anti-miR-NC與si-NC、anti-miR-148b-3p與si-CDKN1B轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞48 h，使用含有10 μg/ml的LPS處理H9c2細(xì)胞24 h，分別記作LPS+anti-miR-NC組、LPS+anti-miR-148b-3p組、LPS+pcDNA組、LPS+pcDNA-CDKN1B組、LPS+anti-miR-NC+si-NC組、LPS+anti-miR-148b-3p+si-CDKN1B組。轉(zhuǎn)染方法參照Lipofectamine2000試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）檢測(cè)細(xì)胞中miR-148b-3p、CDKN1B mRNA的表達(dá)水平采用Trizol法提取各組心肌細(xì)胞中的總RNA，應(yīng)用紫外分光光度計(jì)測(cè)定RNA濃度。參照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，miR-148b-3p正向引物5’-GCGTCAGTGCATCACAGAA CTTTGT-3’，

反向引物5’-CGAATTCTAGAGCTCGAGGCA GGCGACA-3’；

CDKN1B正向引物5’-CAGACCCGGGAGAA AGATGT-3’，

反向引物5’-CCAAGTCCCGGGTTAACTCT-3’；

U6正向引物5’-ATTGGAACGATA CAGAGAAGATT-3’，

反向引物5’-GGAACGCTTCACGAATTTG-3’；

GAPDH正向引物5’-AACGGATTTGGTCGTA TTG-3’，

反向引物5’-GGAAGATGGTGATGGGATT-3’，引物均由上海生工生物工程股份有限公司合成。以cDNA為模板進(jìn)行qRT-PCR反應(yīng)，反應(yīng)體系：10×PCR Buffer 2.5 μl，MgSO4 2.5 μl，dNTPs 2.5 μl，正反向引物各0.5 μl，cDNA 2 μl，RNase-Free ddH2O補(bǔ)足體系至25 μl；反應(yīng)條件：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s，72 ℃30 s，共40次循環(huán)。miR-148b-3p以U6為內(nèi)參，CDKN1B以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算miR-148b-3p、CDKN1B mRNA的相對(duì)表達(dá)量。

1.4 MTT檢測(cè)細(xì)胞存活率收集各組對(duì)數(shù)期心肌細(xì)胞接種于96孔板（3×104個(gè)/孔），每孔中加入20 μl MTT，置于37 ℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)4 h，4 ℃條件下經(jīng)3000 r/min離心15 min，棄上清，每孔加入150 μl二甲基亞砜（DMSO），應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔在波長(zhǎng)為490 nm處的相對(duì)吸光度值（OD），計(jì)算細(xì)胞存活率（%）=（各實(shí)驗(yàn)組OD值-空白對(duì)照組OD值）/（正常對(duì)照組OD值-空白對(duì)照組OD值）×100%。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率收集各組對(duì)數(shù)期心肌細(xì)胞，預(yù)冷PBS洗滌，4 ℃條件下經(jīng)3000 r/min離心15 min，棄上清，PBS再次洗滌，相同條件下離心，棄上清，加入5 μl Annexin V-FITC，充分混勻，加入5 μl PI，充分混勻，室溫避光孵育10 min，應(yīng)用FACS Calibur流式細(xì)胞儀及Cellauest軟件檢測(cè)各組細(xì)胞凋亡率。

1.6 雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)miR-148b-3p的靶基因TarBase v.8預(yù)測(cè)顯示miR-148b-3p與CDKN1B的3’UTR區(qū)存在結(jié)合位點(diǎn)，利用基因技術(shù)將結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行突變，分別將含有結(jié)合位點(diǎn)及突變位點(diǎn)的CDKN1B的3’UTR插入熒光素酶報(bào)告基因載體構(gòu)建野生型載體WT-CDKN1B、突變型載體MUT-CDKN1B，分別將miR-NC、miR-148b-3p mimics與WT-CDKN1B、MUT-CDKN1B共轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞，參照Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑說(shuō)明書(shū)進(jìn)行轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，按照熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)各組熒光素酶活性。

1.7 蛋白免疫印跡（Western blot）檢測(cè)CDKN1B、CyclinD1、P21、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)收集各組對(duì)數(shù)期心肌細(xì)胞，加入400 μl RIPA，冰上裂解30 min，4 ℃條件下經(jīng)12 000 r/min離心10 min，提取細(xì)胞總蛋白。采用BCA法檢測(cè)蛋白濃度，嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作。蛋白樣品中加入上樣緩沖液，沸水煮10 min，蛋白變性。采用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白，將分離的蛋白凝膠轉(zhuǎn)移至PVDF膜，室溫條件下使用5%脫脂奶粉封閉2 h，加入目的蛋白與內(nèi)參GAPDH蛋白一抗稀釋液（1:1000），4 ℃孵育24 h，加入二抗稀釋液（1:5000），TBST洗膜，滴加ECL，暗室內(nèi)曝光顯影，應(yīng)用Quantityone軟件檢測(cè)條帶灰度值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示，兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)，多組間均數(shù)的比較采用單因素方差分析。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 心肌細(xì)胞中miR-148b-3p與CDKN1B的表達(dá)量比較與Con組比較，LPS組心肌細(xì)胞中miR-148b-3p的表達(dá)水平顯著升高（P＜0.05），CDKN1B mRNA及蛋白水平顯著降低（P＜0.05）（圖1、表1）。

2.2 抑制miR-148b-3p表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞增殖及凋亡的影響與Con組比較，LPS組心肌細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），CyclinD1、Bcl-2蛋白水平顯著降低（P＜0.05），P21、Bax蛋白水平顯著升高（P＜0.05）；與LPS+anti-miR-NC組比較，LPS+anti-miR-148b-3p組心肌細(xì)胞存活率顯著升高（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05），CyclinD1、Bcl-2蛋白水平顯著升高（P＜0.05），P21、Bax蛋白水平顯著降低（P＜0.05）（圖2、表2）。

圖1 Western blot法檢測(cè)心肌細(xì)胞中CDKN1B蛋白表達(dá)

表1 心肌細(xì)胞中miR-148b-3p與CDKN1B的表達(dá)量比較（，n=9）

表1 心肌細(xì)胞中miR-148b-3p與CDKN1B的表達(dá)量比較（，n=9）

注：CDKN1B：細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1B

指標(biāo) Con組 LPS組 P值miR-148b-3p 1.00±0.12 2.58±0.23* ＜0.001 CDKN1B mRNA 1.02±0.16 0.35±0.08* ＜0.001 CDKN1B蛋白 0.85±0.10 0.42±0.11* ＜0.001

2.3 CDKN1B過(guò)表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞增殖及凋亡的影響與LPS+pcDNA組比較，LPS+pcDNA-CDKN1B組心肌細(xì)胞存活率顯著升高（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率顯著降低（P＜0.05），CyclinD1、Bcl-2蛋白水平顯著升高（P＜0.05），P21、Bax蛋白水平顯著降低（P＜0.05）（圖3、表3）。

圖2 抑制miR-148b-3p表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞增殖及凋亡的影響（A：流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；B：Western blot法檢測(cè)細(xì)胞增殖及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

2.4 miR-148b-3p靶向調(diào)控CDKN1B的表達(dá)TarBase v.8預(yù)測(cè)顯示CDKN1B的3’UTR中含有與miR-148b-3p互補(bǔ)的核苷酸序列（圖4）。雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，共轉(zhuǎn)染野生型載體WT-CDKN1B的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，與miR-NC組比較，miR-148b-3p組熒光素酶活性顯著降低（P＜0.05）；共轉(zhuǎn)染突變型載體MUT-CDKN1B的細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，miR-148b-3p組熒光素酶活性與miRNC組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）（表4）。與miR-NC組比較，miR-148b-3p組細(xì)胞中CDKN1B蛋白水平顯著降低（P＜0.05）；與antimiR-NC組比較，anti-miR-148b-3p組細(xì)胞中CDKN1B蛋白水平顯著升高（P＜0.05）（圖5、表5）。

2.5 沉默CDKN1B可減弱抑制miR-148b-3p表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞增殖及凋亡的作用與LPS+anti-miRNC+si-NC組比較，LPS+anti-miR-148b-3p+si-CDKN1B組細(xì)胞存活率顯著降低（P＜0.05），細(xì)胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），CyclinD1、Bcl-2蛋白水平顯著降低（P＜0.05），P21、Bax蛋白水平顯著升高（P＜0.05）（圖6、表6）。

3 討論

心血管疾病、癌癥等多種疾病發(fā)生及發(fā)展均可能受到miRNA的調(diào)控，研究表明miRNA可參與調(diào)控心血管疾病氧化損傷過(guò)程，還可影響心肌細(xì)胞凋亡[8-10]。但仍有部分miRNA在心肌細(xì)胞損傷過(guò)程中的調(diào)控機(jī)制尚未闡明。因而本研究積極探尋新型miRNA并分析其在心肌細(xì)胞損傷過(guò)程中的作用機(jī)制。

miR-148b-3p表達(dá)上調(diào)可通過(guò)抑制靶基因DNMT1表達(dá)從而影響關(guān)節(jié)炎的發(fā)生[11]。研究表明miR-148b-3p可能作為診斷急性缺血性卒中、心力衰竭等心血管疾病的潛在生物標(biāo)志物[12,13]。本研究結(jié)果顯示LPS處理后心肌細(xì)胞中miR-148b-3p的表達(dá)水平顯著升高，提示miR-148b-3p在心肌細(xì)胞損傷過(guò)程中發(fā)揮重要調(diào)控作用。細(xì)胞增殖與凋亡失衡可引發(fā)多種疾病發(fā)生及發(fā)展，研究表明細(xì)胞增殖與細(xì)胞周期密切相關(guān)，CyclinD1可正向調(diào)控細(xì)胞周期，促進(jìn)細(xì)胞增殖，而P21可負(fù)向調(diào)控細(xì)胞周期，抑制細(xì)胞增殖[14]。細(xì)胞凋亡過(guò)程受到細(xì)胞內(nèi)抗凋亡蛋白與促凋亡蛋白的調(diào)控，Bcl-2屬于抗細(xì)胞凋亡蛋白，Bax屬于促細(xì)胞凋亡蛋白，并可通過(guò)線粒體途徑從而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[15]。本研究結(jié)果顯示LPS處理后心肌細(xì)胞存活率顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，CyclinD1、Bcl-2表達(dá)下調(diào)，P21、Bax表達(dá)上調(diào)，而抑制miR-148b-3p表達(dá)后可明顯減弱LPS對(duì)心肌細(xì)胞增殖及凋亡的作用。提示抑制miR-148b-3p表達(dá)可抑制LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡并促進(jìn)細(xì)胞存活。

表2 抑制miR-148b-3p表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞增殖及凋亡的影響（，n=9）

表2 抑制miR-148b-3p表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞增殖及凋亡的影響（，n=9）

注：CyclinD1：細(xì)胞周期蛋白1；Bax：B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)蛋白；Bcl-2：B淋巴細(xì)胞瘤-2；與Con組比較，aP＜0.05；與LPS+anti-miR-NC組比較，bP＜0.05

項(xiàng)目 Con組 LPS組 LPS+anti-miR-NC組 LPS+anti-miR-148b-3p組 P值miR-148b-3p 1.01±0.13 2.57±0.16a 2.53±0.18 1.13±0.11b ＜0.001細(xì)胞存活率（%） 100.32±13.25 56.48±6.57a 57.65±8.54 87.65±10.03b ＜0.001細(xì)胞凋亡率（%） 7.79±0.25 25.64±1.25a 26.54±3.21 10.03±2.15b ＜0.001 CyclinD1 0.87±0.11 0.45±0.08a 0.43±0.10 0.75±0.13b ＜0.001 P21 0.40±0.09 0.89±0.13a 0.90±0.16 0.52±0.11b ＜0.001 Bax 0.46±0.11 0.95±0.18a 0.92±0.17 0.53±0.12b ＜0.001 Bcl-2 0.92±0.16 0.40±0.11a 0.41±0.13 0.82±0.15b ＜0.001

表3 CDKN1B過(guò)表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞增殖及凋亡的影響（，n=9）

表3 CDKN1B過(guò)表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞增殖及凋亡的影響（，n=9）

注：CyclinD1：細(xì)胞周期蛋白1；Bax：B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)蛋白；Bcl-2：B淋巴細(xì)胞瘤-2

項(xiàng)目 LPS+pcDNA組 LPS+pcDNA-CDKN1B組 P值CDKN1B蛋白 0.45±0.13 0.96±0.15* ＜0.001細(xì)胞存活率（%） 58.67±10.36 89.67±11.32* ＜0.001細(xì)胞凋亡率（%） 25.47±3.16 8.95±1.13* ＜0.001 CyclinD1 0.46±0.11 0.80±0.20* ＜0.001 P21 0.91±0.18 0.42±0.09* ＜0.001 Bax 0.90±0.13 0.42±0.08* ＜0.001 Bcl-2 0.43±0.15 0.85±0.17* ＜0.001

圖3 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞增殖及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

圖4 TarBase v.8預(yù)測(cè)miR-148b-3p與CDKN1B結(jié)合示意圖

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)（，n=9）

表4 雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)（，n=9）

注： WT-CDKN1B：野生型載體，MUT-CDKN1B：突變型載體

項(xiàng)目 miR-NC組 miR-148b-3p組 P值WT-CDKN1B 1.02±0.13 0.43±0.10* ＜0.001 MUT-CDKN1B 1.08±0.16 1.10±0.18 0.806

圖5 Western blot法檢測(cè)CDKN1B蛋白表達(dá)

CDKN1B在肝細(xì)胞癌、骨肉瘤等多種癌癥中表達(dá)異常并可參與腫瘤細(xì)胞增殖、遷移及侵襲等生物學(xué)過(guò)程[16-18]。本研究結(jié)果顯示LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中CDKN1B的表達(dá)下調(diào)，進(jìn)一步分析顯示CDKN1B過(guò)表達(dá)后可明顯抑制LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，并可提高細(xì)胞存活率，提示CDKN1B過(guò)表達(dá)可促進(jìn)心肌細(xì)胞存活及抑制細(xì)胞凋亡。本研究通過(guò)雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)與Western blot實(shí)驗(yàn)證實(shí)miR-148b-3p可靶向結(jié)合CDKN1B并可負(fù)向調(diào)控CDKN1B的表達(dá)，提示miR-148b-3p可能通過(guò)靶向CDKN1B促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡及抑制細(xì)胞增殖。為探討miR-148b-3p是否可通過(guò)調(diào)控CDKN1B表達(dá)從而影響心肌細(xì)胞增殖及凋亡，本研究將anti-miR-148b-3p與si-CDKN1B共轉(zhuǎn)染至心肌細(xì)胞，結(jié)果顯示細(xì)胞存活率顯著降低，細(xì)胞凋亡率顯著升高，CyclinD1、Bcl-2蛋白水平降低，P21、Bax蛋白水平升高，提示抑制miR-148b-3p表達(dá)可能通過(guò)上調(diào)CDKN1B表達(dá)從而促進(jìn)心肌細(xì)胞增殖及抑制細(xì)胞凋亡。

表5 miR-148b-3p調(diào)控CDKN1B的表達(dá)（，n=9）

表5 miR-148b-3p調(diào)控CDKN1B的表達(dá)（，n=9）

注：CDKN1B：細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1B；與miR-NC組比較，aP＜0.05；與anti-miR-NC組比較，bP＜0.05

項(xiàng)目 miR-NC組 miR-148b-3p組 anti-miR-NC組 anti-miR-148b-3p組 P值CDKN1B蛋白 0.75±0.16 0.32±0.05a 0.71±0.11 0.98±0.10b ＜0.001

圖6 Western blot法檢測(cè)細(xì)胞增殖及凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

表6 沉默CDKN1B可減弱抑制miR-148b-3p表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞增殖及凋亡的作用（，n=9）

表6 沉默CDKN1B可減弱抑制miR-148b-3p表達(dá)對(duì)心肌細(xì)胞增殖及凋亡的作用（，n=9）

注：CyclinD1：細(xì)胞周期蛋白1；Bax：B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)蛋白；Bcl-2：B淋巴細(xì)胞瘤-2

項(xiàng)目 LPS+anti-miRNC+si-NC組LPS+anti-miR-148b-3p+si-CDKN1B組P值CDKN1B蛋白 0.97±0.12 0.41±0.10* ＜0.001細(xì)胞存活率（%） 86.65±11.25 43.25±10.03* ＜0.001細(xì)胞凋亡率（%） 10.16±1.58 26.57±2.16* ＜0.001 CyclinD1 0.83±0.16 0.44±0.12* ＜0.001 P21 0.52±0.11 0.97±0.13* ＜0.001 Bax 0.53±0.12 0.96±0.18* ＜0.001 Bcl-2 0.78±0.15 0.42±0.11* ＜0.001

綜上所述，LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞中miR-148b-3p呈高表達(dá)，CDKN1B呈低表達(dá)，抑制miR-148b-3p表達(dá)可能上調(diào)CDKN1B表達(dá)從而抑制LPS誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞增殖，其作用機(jī)制可能與調(diào)控CyclinD1、P21、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)有關(guān)，miR-148b-3p可能成為診斷及治療心血管疾病的潛在靶點(diǎn)。