一種可富集Fe3+的含芘熒光探針

王 莎，黃子杰，肖盈希，盧 博，唐 健，馬立軍

(華南師范大學(xué)化學(xué)學(xué)院，廣州 510006)

鐵(Fe)是人體中一種不可缺少的化學(xué)元素，在很多生命活動中扮演重要角色[1-2]. Fe主要以亞鐵離子(Fe2+)的形式存在于血紅蛋白中[3]，結(jié)合并運(yùn)輸血液中的氧(O). 當(dāng)人體內(nèi)Fe含量過低時，會產(chǎn)生貧血癥狀，延緩智力發(fā)育和改變心理活動行為，造成免疫力下降等危害[4-6]. 當(dāng)Fe含量過高時，又會給人體帶來一系列的生理紊亂現(xiàn)象，如在人的肝臟中大量積累時，不僅會誘導(dǎo)肝硬化，還會使脂質(zhì)的過氧化反應(yīng)活性增強(qiáng)，打破人體內(nèi)氧化、抗氧化體系的平衡[7-9]. 因此，檢測和維持人體內(nèi)Fe含量處于相對適宜的范圍，對生理過程的正常進(jìn)行且有重要意義.

目前，檢測Fe3+濃度的方法有電化學(xué)、原子吸收光譜、等離子體發(fā)射光譜、生物和納米傳感及熒光探針等方法[10-12]. 與眾多檢測方法相比，熒光探針法具有高選擇性、高靈敏度、強(qiáng)的抗干擾能力、制樣簡便快捷、可實時原位檢測等優(yōu)點(diǎn)[13-15]. 本文選擇具有高熒光發(fā)射強(qiáng)度的芘作為熒光基團(tuán)，通過生成酰胺鍵，與鄰氨基苯甲酸結(jié)合，獲得一種具有一定親疏水性能的熒光探針芘甲酰鄰氨基苯甲酸(PAA),羧基可提高其水溶性，同時也作為金屬離子的結(jié)合位點(diǎn). 探針與離子結(jié)合后，空間構(gòu)型發(fā)生轉(zhuǎn)變，導(dǎo)致親水性的羧基與離子結(jié)合，整個探針分子疏水性增強(qiáng)，能從水溶液中析出，從而具有富集金屬離子的能力.

1 實驗部分

1.1 實驗儀器和試劑

主要儀器：熒光分光光度計(F-2500，日本島津，溶液樣品所采用的激發(fā)波長均為340 nm)、紫外-可見分光光譜儀(UV-1700，日本島津)、氫核磁共振波譜儀(NMR Systems 400 MHz，美國瓦里安)、液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(LCQ Deca XP MAX,美國安捷倫)、紫外分析儀(ZF5型手提式，金壇市宏華儀器廠)； pH計(PHS-3B，上海精科).

主要試劑：鄰氨基苯甲酸、芘甲醛、石油醚、二氯亞砜(DMSO)、N,N-二甲基甲酰胺(DMF)、乙酸乙酯、無水甲醇、磷酸氫二鈉、碳酸氫鈉、檸檬酸、碳酸鈉、AlCl3、CdCl2、BaCl2、CoCl2、Cr(NO3)3、CuCl2、HgCl2、FeCl3、Pb(NO3)2、NiCl2等，均為分析純，無需進(jìn)一步處理. 實驗用水為去離子水.

1.2 探針的合成與表征

1.2.1 PAA的合成 利用芘甲酸和鄰氨基苯甲酸合成PAA,其合成路線如圖1 所示，分為2個步驟.

圖1 PAA 的合成路線

(1)芘甲酰氯的合成. 將二氯亞砜逐滴加入芘甲酸的二氯甲烷溶液中，加熱至40 ℃，回流攪拌7 h. 將產(chǎn)物通過減壓蒸餾除去溶劑，得到芘甲酰氯.

(2)PAA的合成. 將新制芘甲酰氯和鄰氨基苯甲酸分別溶解于二氯甲烷中，利用恒壓漏斗，將芘甲酰氯溶液逐滴加入到鄰氨基苯甲酸溶液中，在室溫下攪拌24 h. 用去離子水洗滌3次，得到粗產(chǎn)物，分離有機(jī)相并用無水硫酸鎂進(jìn)行干燥，減壓過濾得到濾液. 旋干濾液后，用二氯甲烷和乙酸乙酯(體積比為1∶1)作洗脫劑，采用硅膠柱層析進(jìn)一步分離提純，最終得到PAA.

1.2.2 PAA的表征 如圖2A所示，PAA的1H NMR圖譜(500 MHz，DMSO-d6)的化學(xué)位移和對應(yīng)的質(zhì)子類型歸屬：13.68 (s,1H,-COOH-),8.17～7.28 (m,4H,12.05 (s,1H,-CONH-),8.80～8.29 (m,9H,pyrene(H)),benzene(H)). ESI-MS(甲醇做溶劑)：分子式C24H15NO3，理論計算的相對分子質(zhì)量為365.11，實驗測試結(jié)果為364.00(圖2B).

圖2 PAA 的1H NMR及質(zhì)譜圖

2 結(jié)果與討論

2.1 PAA識別Fe3+的光譜變化

圖3A為PAA溶液(20.0 μmol/L)的紫外-可見吸收光譜，在波長分別為277 nm和345 nm附近有2個強(qiáng)的吸收峰，這是芘的特征吸收峰. 隨著滴加Fe3+濃度的逐漸增大，PAA溶液的2個吸收峰強(qiáng)度明顯減弱，這說明Fe3+與PAA發(fā)生了相互作用.

在激發(fā)波長340 nm、pH 4.00條件下，含DMSO體積分?jǐn)?shù)為5%的PAA水溶液(20.0 μmol/L)在波長495 nm處有1個強(qiáng)的熒光發(fā)射峰(圖3B). 根據(jù)文獻(xiàn)[16]，該峰是芘的聚集發(fā)射峰. 向PAA水溶液中加入不同濃度的Fe3+溶液，發(fā)現(xiàn)波長為495 nm處的聚集發(fā)射峰強(qiáng)度隨著Fe3+濃度的增大而降低，這表明PAA與Fe3+之間發(fā)生了結(jié)合，具有熒光識別的響應(yīng)特性. 與此同時，還觀察到白色絮狀沉淀從溶液中析出，在波長為365 nm的紫外燈下，溶液從綠色逐漸變成無色(圖3B插圖a、b). Fe3+的存在使探針?biāo)芤喊l(fā)生了熒光猝滅現(xiàn)象，并且Fe3+可以與PAA結(jié)合形成沉淀，從而達(dá)到富集Fe3+的目的. 因此，PAA對Fe3+具有檢測、富集雙重功能.

圖3 PAA溶液中加入不同濃度Fe3+時的紫外-可見吸收光譜和熒光發(fā)射光譜

2.2 PAA識別Fe3+的選擇性和抗干擾性能

在相同條件下，向PAA水溶液中分別加入濃度為30.0、60.0、90.0、120.0 μmol/L的Cd2+、Co2+、Cu2+、Ni2+、Ba2+、Pb2+、Fe2+等7種常見重金屬離子溶液后，測試激發(fā)波長為495 nm時的熒光發(fā)射光譜(圖4A). 以熒光強(qiáng)度的相對變化值(I-I0)/I0作為參考指標(biāo)，只有滴加Fe3+時才能使PAA溶液的熒光發(fā)射峰強(qiáng)度產(chǎn)生明顯變化，而對于其他離子，即使?jié)舛容^高，也不會產(chǎn)生白色絮狀沉淀物，只出現(xiàn)相當(dāng)微弱的熒光猝滅. 該現(xiàn)象進(jìn)一步說明了PAA對Fe3+具有高選擇性的富集能力和熒光識別響應(yīng)，因此，PAA可作為Fe3+的熒光探針.

圖4 不同金屬離子濃度對PAA熒光發(fā)射峰強(qiáng)度的影響及其干擾性

為了證明PAA具有特異性識別Fe3+的應(yīng)用潛力，考察實際水樣中當(dāng)其他金屬離子存在時，PAA對Fe3+的識別和富集是否受到干擾，即同時向PAA水溶液中加入Fe3+與其他金屬離子. 當(dāng)其他金屬離子的濃度為Fe3+濃度(30.0 μmol/L)的5倍時，只有Cr3+和Cd2+能夠使探針溶液的熒光發(fā)射峰強(qiáng)度發(fā)生極其微弱的增強(qiáng)，對其他金屬離子(如Cu2+、Mn2+、Ni2+等)幾乎沒有任何影響(圖4B). 這說明PAA在水溶液中對Fe3+的識別具有很強(qiáng)的抗干擾能力.

2.3 PAA與Fe3+的結(jié)合比和結(jié)合常數(shù)

為了探究Fe3+與PAA的結(jié)合模式，進(jìn)行滴定實驗. 控制PAA與Fe3+的總濃度為20.0 μmol/L，調(diào)節(jié)PAA與Fe3+的濃度之比并測試熒光強(qiáng)度，計算波長為495 nm的熒光強(qiáng)度在Fe3+加入前后的差值(I0-I)對Fe3+所占濃度比c(Fe3+)/[c(Fe3+)+c(PAA)]作圖，即得Job’s plot圖(圖5A)，由圖中最大值對應(yīng)的橫坐標(biāo)0.3可近似測算，PAA與Fe3+形成穩(wěn)定螯合物時PAA與Fe3+的最佳結(jié)合比(物質(zhì)的量之比)為2∶1,即2個PAA分子可結(jié)合1個Fe3+形成穩(wěn)定的絡(luò)合物.

圖5 不同離子探針比例對PAA熒光發(fā)射峰強(qiáng)度的影響及其在最佳結(jié)合模式下的擬合曲線

結(jié)合文獻(xiàn)的方法，利用Levenberg-Marquardt algorithm[17]進(jìn)行曲線擬合，以波長為495 nm 處熒光強(qiáng)度的差值比(I-I0)/(Imin-I0) 表示PAA的殘余濃度，利用反應(yīng)式和公式

(1)

(2)

進(jìn)行非線性擬合，其中G代表Fe3+，H代表PAA，a為常數(shù)，K21是PAA與Fe3+的擬合常數(shù). 通過擬合結(jié)果計算得到PAA與Fe3+的結(jié)合常數(shù)K21高達(dá)3.075×1012(圖5B)，說明探針分子PAA和Fe3+之間的結(jié)合非常穩(wěn)定.

以上結(jié)果表明：1個Fe3+離子能夠與2個PAA分子結(jié)合形成沉淀. 該結(jié)果與實驗預(yù)期一致，都顯示了探針分子上唯一的結(jié)合位點(diǎn)——鄰氨基苯甲酸上的羧基與Fe3+的結(jié)合作用產(chǎn)生了沉淀，1個Fe3+與2個探針分子中極性較大的羧基結(jié)合，提高了Fe3+-探針復(fù)合物的疏水性能，從溶液體系中析出，產(chǎn)生熒光猝滅現(xiàn)象，即熒光識別響應(yīng).

3 結(jié)論

以芘為熒光發(fā)射基團(tuán)、鄰氨基苯甲酸基為識別基團(tuán)，合成了一種對Fe3+具有高選擇性熒光識別作用的水溶性熒光探針——芘甲酰鄰氨基苯甲酸. 在含DMSO體積分?jǐn)?shù)為5%的水溶液中，對Fe3+表現(xiàn)出熒光猝滅現(xiàn)象，且產(chǎn)生絮狀沉淀，實現(xiàn)了同時對目標(biāo)離子產(chǎn)生熒光識別響應(yīng)和富集作用. 該探針表現(xiàn)出高靈敏性、高選擇性、強(qiáng)抗干擾能力和多功能性，具有一定的應(yīng)用潛力.