液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)在中藥質(zhì)量研究中的應(yīng)用

陳明曦，李艷梅，孫 婷，于治國(guó)，王東凱

（沈陽藥科大學(xué) 藥學(xué)院，遼寧 沈陽 110016）

中藥以副作用小、療效確切、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)，在我國(guó)幾千年歷史中被廣泛應(yīng)用于各類疾病的防治。與傳統(tǒng)藥物相同，中藥同樣需要采用可靠的手段來證明其安全性和有效性，因此實(shí)現(xiàn)中藥現(xiàn)代化亟需新方法和先進(jìn)的分析技術(shù)手段。近年來，液相色譜與各類型質(zhì)譜的聯(lián)用技術(shù)（liquid chromatograph/mass spectrometer，LC/MS）憑借在分離復(fù)雜樣品、測(cè)定化合物結(jié)構(gòu)以及定性和定量分析等方面的獨(dú)特優(yōu)勢(shì)[1]，成為中藥質(zhì)量研究的有力工具。

1 液相色譜與質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)

目前已有多種類型質(zhì)譜被用來分析氣態(tài)離子質(zhì)荷比，常見的有基于離子飛行速度和飛行距離進(jìn)行分離的飛行時(shí)間質(zhì)譜（time of flight mass spectrometer，TOF），通過電勢(shì)場(chǎng)進(jìn)行傳輸?shù)乃臉O桿質(zhì)譜（quadrupole mass spectrometer，QMS）和磁場(chǎng)或電場(chǎng)周期性運(yùn)動(dòng)的離子阱質(zhì)譜（ion trap mass spectrometer，ITMS）[2-3]。為獲取更高分辨力、準(zhǔn)確性、靈敏度和更快的分析速度等優(yōu)質(zhì)性能，分析技術(shù)由單一質(zhì)量分析器快速向混合質(zhì)量分析器發(fā)展，出現(xiàn)了不同類型質(zhì)譜組合與色譜聯(lián)用的現(xiàn)代分析技術(shù)[4]。此外，超臨界流體色譜[5-6]、二維色譜[7-8]、離子淌度質(zhì)譜[9-10]等先進(jìn)的色譜與質(zhì)譜技術(shù)也被快速應(yīng)用于液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)，為中藥質(zhì)量研究提供了更多的可能。

1.1 液相色譜與四極桿質(zhì)譜聯(lián)用

四極桿質(zhì)譜常用電噴霧離子化（electrospray ionization，ESI）和大氣壓化學(xué)離子化（atmospheric chemical ionization，APCI）作為液質(zhì)聯(lián)用接口技術(shù)，具有成本低、操作簡(jiǎn)單、體積相對(duì)較小等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于色譜與質(zhì)譜聯(lián)用?；谝患?jí)質(zhì)譜的單離子檢測(cè)（single ion monitor，SIM）通常用作已知化合物的定量分析，通過只掃描一個(gè)離子以提高目標(biāo)離子的靈敏度，排除其它離子干擾。M.Dan等[11]在正離子模式下，采用 LC/ESI-MS 法測(cè)定三七不定根中皂苷含量，經(jīng)驗(yàn)證方法靈敏準(zhǔn)確。

在選擇反應(yīng)檢測(cè)（selected-reaction monitoring，SRM）模式下，需要二級(jí)質(zhì)譜（MS/MS）進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定或提高目標(biāo)成分選擇性和靈敏度時(shí)，則應(yīng)使用三重四極桿質(zhì)譜（triple quadrupole mass spectrometer，TQMS）與色譜聯(lián)用[2]。三重四極桿質(zhì)譜與色譜聯(lián)用技術(shù)在中藥多組分檢測(cè)、鑒別和定量方面發(fā)揮重要作用。袁圓等[12]采用液相色譜-串接四極桿質(zhì)譜儀，對(duì) 16 種市售含烏頭屬中藥制劑中 8 種生物堿進(jìn)行含量測(cè)定。李曉嬌等[13]建立 LC-MS/MS（三重四極桿質(zhì)譜檢測(cè)器）正負(fù)譜實(shí)時(shí)切換的分析方法同時(shí)測(cè)定血漿中黃連解毒湯 13 種主要活性成分。

1.2 液相色譜與離子阱質(zhì)譜聯(lián)用

離子阱具有強(qiáng)大的全掃描和選擇離子掃描功能，通過碰撞誘導(dǎo)解離（collision-induced dissociation，CID）實(shí)現(xiàn)二級(jí)或多級(jí)質(zhì)譜（multilevel mass spectrometry，MSn）掃描，而 MSn 是獲得詳細(xì)結(jié)構(gòu)信息的必要手段。Han T.等[14]建立了高相液相色譜-二極管陣列檢測(cè)與離子阱質(zhì)譜聯(lián)用的方法對(duì)中藥蒼耳子進(jìn)行了化學(xué)特征鑒定和定量分析。李娜等[15]采用液相色譜/離子阱質(zhì)譜聯(lián)用的分析方法推測(cè)出人參莖葉提取液中人參皂苷 Rg1、Re 加熱后發(fā)生脫糖、脫羥基、環(huán)合等反應(yīng)，生成多種降解產(chǎn)物。

三重四極桿復(fù)合線性離子阱質(zhì)譜（quadrupole-ion trap mass spectrometer，QTrap）兼具三重四極桿和線性離子阱質(zhì)譜的 MS/MS 和 MSn 掃描功能[16]，如中性缺失（neutral loss，NL）掃描、前體離子（precursor ion，PI）掃描、多反應(yīng)檢測(cè)（multiple-reaction monitoring，MRM）掃描和全掃描，可實(shí)現(xiàn)高通量的定量定性分析。Jin Y.R.等[17]建立高效液相色譜串聯(lián) QTrap 質(zhì)譜法，在MRM 模式下同時(shí)測(cè)定紫杉醇類化合物中 19 個(gè)二萜類化合物。

1.3 液相色譜與飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用

飛行時(shí)間質(zhì)譜具有較高的全光譜檢測(cè)靈敏度和質(zhì)量準(zhǔn)確性，每次進(jìn)樣可以全譜采集樣本中所有的m/z，大大提高數(shù)據(jù)采集效率，在中藥活性成分鑒別、代謝產(chǎn)物研究以及中藥表征和定量分析等領(lǐng)域得到廣泛應(yīng)用。

三重四極桿復(fù)合飛行時(shí)間質(zhì)譜（Q-TOF）在一級(jí)四極桿中進(jìn)行前體離子碎片化，在 TOF 檢測(cè)產(chǎn)物離子，通過區(qū)別相同標(biāo)示質(zhì)量但不同精確質(zhì)量的干涉峰和質(zhì)量峰，可滿足質(zhì)量分辨率高、測(cè)量準(zhǔn)確的分析要求，且具有一定選擇性，適用于復(fù)雜中藥樣品中成分識(shí)別和定量。王若柳等[18]采用LC-Q-TOF-MS 和 LC-IT-MS 檢測(cè)到參麥注射液中 74 個(gè)化合物，鑒定了其中 64 個(gè)化合物的結(jié)構(gòu)。

離子阱復(fù)合飛行時(shí)間質(zhì)譜（IT-TOF）將 IT 的多級(jí)質(zhì)譜掃描功能和 TOF 的高分辨率、高精確質(zhì)量測(cè)量能力結(jié)合，可為中藥復(fù)雜系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)識(shí)別提供大量信息，成功用于中藥中靶向和非靶向化合物的全方位鑒別。仝令坤等[19]采用高效液相色譜-二極管陣列檢測(cè)與離子阱復(fù)合飛行時(shí)間質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-DAD-IT-TOF）對(duì)中藥羅布麻葉指紋圖譜中 30 個(gè)化學(xué)成分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定，其中 5 種化合物為首次指認(rèn)。

2 液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)在中藥質(zhì)量研究中的應(yīng)用

我國(guó)中藥質(zhì)量控制上存在諸多問題，如定性、定量標(biāo)準(zhǔn)不明確；指標(biāo)成分專屬性差，不能準(zhǔn)確客觀地反應(yīng)中藥的內(nèi)在質(zhì)量[20]；中藥毒性成分、毒性機(jī)制不明確，無法制定合理的限度要求；非法添加物檢測(cè)能力不足，無法保證臨床用藥安全等。液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)是鑒定各種復(fù)雜樣品中已知或未知化合物最常用的技術(shù)之一，結(jié)合了高效液相色譜法分離能力和不同類型質(zhì)譜的定性、定量能力優(yōu)勢(shì)，可在中藥的多指標(biāo)成分定性、定量分析、指紋圖譜研究、毒性成分和非法添加物檢測(cè)等方面發(fā)揮重要作用。

2.1 結(jié)構(gòu)鑒定與定量分析

中藥的質(zhì)量和治療效果，在一定程度上，取決于其活性成分的含量。但由于氣候、耕種條件、收獲時(shí)間、干燥及儲(chǔ)存條件和提取程序的不同，導(dǎo)致中藥樣品中所含的活性成分往往具有很大差異。因此，建立完善的分析方法以檢測(cè)中藥中的活性成分，在中藥質(zhì)量控制中尤為重要。

Wang L.L.等[21]采用液相色譜-電噴霧離子化-串聯(lián)質(zhì)譜法，同時(shí)定量測(cè)定山茱萸中 5-羥甲基-2-呋喃醛等 11 種高極性成分。經(jīng)過驗(yàn)證，該方法成功應(yīng)用于評(píng)估三個(gè)起源以及加工后的野生山茱萸的成分變化，且環(huán)烯醚萜異構(gòu)體首次被作為山茱萸的質(zhì)量標(biāo)志物。

紫花前胡苷是中藥毛前胡的活性成分，劉航等[22]采用高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)，在電噴霧正離子模式下，對(duì)不同產(chǎn)地毛前胡中的紫花前胡苷進(jìn)行定量研究。方法學(xué)驗(yàn)證結(jié)果顯示，紫花前胡苷在 1.002 3～9.015 2 ng 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，所建立方法準(zhǔn)確可靠。

2.2 指紋圖譜分析

中藥通常是通過多組分協(xié)同作用發(fā)揮藥效，基于定量單一的標(biāo)志物無法滿足對(duì)中藥標(biāo)準(zhǔn)化質(zhì)量的研究。通過色譜技術(shù)構(gòu)建中藥指紋圖譜，可以標(biāo)示中藥中所含的特征性共有峰，依此來評(píng)價(jià)中藥質(zhì)量的一致性和穩(wěn)定性[22]。由于精確的質(zhì)量測(cè)量需要高分辨率來實(shí)現(xiàn)，因此高分辨率質(zhì)譜技術(shù)廣泛用于中藥指紋圖譜分析[24]。根據(jù)藥物特性，采用分析儀器聯(lián)用技術(shù)有針對(duì)性地構(gòu)建多維指紋圖譜[25]，研究中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)，能夠從根本上反應(yīng)其內(nèi)在質(zhì)量。

Yang N.等[26]建立了超高效液相色譜聯(lián)用光電二極管陣列檢測(cè)器（photo-diode array，PDA）和質(zhì)譜的方法，標(biāo)記了消炎利膽片制劑指紋圖譜中 39 個(gè)色譜峰，并對(duì) 5-甲氧基-5-羥脯氨酸-6-酮等五個(gè)重要成分進(jìn)行了定性評(píng)價(jià)。此方法可用于快速評(píng)價(jià)消炎利膽片制劑的質(zhì)量一致性。胡一晨等[27]采用高效液相色譜與 Q-TOF-MS 高分辨串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對(duì) 11 批秦艽花藥材進(jìn)行分析，建立其指紋圖譜，標(biāo)定指紋圖譜中 23 個(gè)共有峰，為提高秦艽花的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了依據(jù)。

2.3 中藥毒性成分分析

中藥的毒性評(píng)價(jià)對(duì)藥物的合理利用及人體的安全、健康具有重要意義。尋找中藥中潛在的毒性成分，建立毒性成分質(zhì)量檢測(cè)方法。針對(duì)不同情況制定合理的限度要求，是中藥質(zhì)量控制中的重要內(nèi)容[28-29]。然而，由于中藥成分復(fù)雜，有多種成分共存，同時(shí)又具有高度關(guān)聯(lián)性，無疑增加了中藥毒性成分分析工作的難度。

中藥馬錢子在臨床上常用來緩解風(fēng)濕麻痹等癥狀，其有效成分馬錢子堿和士的寧具有毒性，過量使用會(huì)引發(fā)中毒甚至死亡。韋立志等[30]建立高效液相色譜與三重四極桿質(zhì)譜聯(lián)用法，同時(shí)測(cè)定風(fēng)濕馬錢片等 4 種抗風(fēng)濕類中成藥中馬錢子堿與士的寧含量。通過此方法可實(shí)現(xiàn)對(duì)制劑中馬錢子堿和士的寧成分含量的嚴(yán)格控制。

阿多尼弗林堿（adonifoline）作為一種天然毒性物質(zhì)廣泛存在于千里光藥材。熊芬等[31]建立UPLC-MS 方法對(duì)千柏鼻炎片等 14 種含千里光的中藥制劑中的阿多尼弗林堿進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果顯示，不同產(chǎn)地相關(guān)制劑中 Pas 含量具有顯著差異，提示應(yīng)注意其用藥安全。

2.4 中藥非法添加物分析

中藥雖然起效慢，但其療效緩和，可以到達(dá)標(biāo)本兼治的效果，因此有些中藥常被大眾服用以改善體質(zhì)。一些不法商家利用中藥制劑成分復(fù)雜、現(xiàn)有分析方法無法對(duì)各成分均進(jìn)行全面檢測(cè)的特點(diǎn)[32]，向中藥中非法添加西藥，以加快中藥療效，從而增加藥品銷量。在患者不知情的情況下，若持續(xù)服用含有非法添加藥物的中藥制劑，會(huì)產(chǎn)生不可預(yù)知的不良反應(yīng)，嚴(yán)重危害人民的生命安全。非法添加物種類繁多，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)因具有檢測(cè)范圍廣、選擇性高、準(zhǔn)確、快速等特點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用到中藥制劑中非法添加物的檢測(cè)中[33]。

一些不法商家在治療痛風(fēng)類中成藥中，添加抗炎鎮(zhèn)痛和激素類西藥，患者長(zhǎng)期服用會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重不良反應(yīng)。勇艷華等[34]采用液相色譜串聯(lián)四極桿質(zhì)譜，多反應(yīng)監(jiān)測(cè)方式采集并定量，同時(shí)測(cè)定痛風(fēng)類中成藥中氫化可的松、乙酰氨基酚等 17 種非法添加物，檢出限可達(dá)到 0.1 mg?L-1，該方法可用于痛風(fēng)類中成藥中非法添加物的日常檢測(cè)。

李岳等[35]建立四極桿-靜電場(chǎng)軌道阱高分辨率質(zhì)譜方法，同時(shí)篩查某中藥保健品中降壓類、安神類、減肥類等 11 類，共 115 種非法添加物，并對(duì)潛在的陽性樣品進(jìn)行定量分析。所建立的方法具有快速、便捷、準(zhǔn)確的特點(diǎn)，能夠滿足日常中藥保健品監(jiān)管工作的篩查確證需求。

3 結(jié)語

如今，中藥治療在世界范圍內(nèi)廣泛應(yīng)用，建立可靠、嚴(yán)格的中藥質(zhì)量控制體系對(duì)確保中藥制劑的安全性和有效性來說十分重要。中藥有效成分識(shí)別是保證中藥質(zhì)量的前提，指紋圖譜分析是一種被廣泛接受的成分評(píng)估方法。同時(shí)，有效檢測(cè)中藥毒性成分和嚴(yán)厲打擊中藥非法添加物更是避免臨床不良事件發(fā)生的重要手段。隨著科學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展和儀器設(shè)備的日益完善，液質(zhì)聯(lián)用技術(shù)仍將在中藥質(zhì)量研究領(lǐng)域?qū)崿F(xiàn)其更多的應(yīng)用價(jià)值。