拉曼光譜技術(shù)識(shí)別不同病因膿毒癥的潛力

杜 金 夏書香

1.延邊大學(xué)臨床學(xué)院，吉林延吉 133000；2.延邊大學(xué)附屬醫(yī)院重癥醫(yī)學(xué)科，吉林延吉 133000

膿毒癥是臨床上非常緊急的一種醫(yī)療情況，最初定義為由感染引起的全身炎癥反應(yīng)綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）及其所致的各器官功能障礙。由于原定義缺乏特異性和敏感性，膿毒癥于2016年被美國重癥醫(yī)學(xué)會(huì)（Society of Critical Care Medicine，SCCM）聯(lián)合歐洲危重病醫(yī)學(xué)會(huì)（European Society of Intensive Care Medicine，ESICM）重新定義為一種由嚴(yán)重感染引起機(jī)體免疫反應(yīng)失調(diào)導(dǎo)致的致命性器官功能障礙（即sepsis 3.0）[1-2]。該新定義將診斷重點(diǎn)從SIRS 轉(zhuǎn)移到器官功能障礙，并加入了序貫器官衰竭評(píng)分（Sequential Organ Failure Assessment，SOFA），還提出快速序貫器官衰竭評(píng)分（quick Sequential Organ Failure Assessment，qSOFA）[2]，為臨床醫(yī)生識(shí)別膿毒癥患者提供有效信息并指導(dǎo)有效治療策略的實(shí)施。

1 膿毒癥概述及其臨床常用生物標(biāo)志物

1.1 膿毒癥概述

膿毒癥是由各種病原體感染引起的嚴(yán)重疾病，感染源可以是細(xì)菌、真菌、病毒等病原微生物，其中由細(xì)菌感染所致膿毒癥約占70%，病毒感染所致膿毒癥約占20%，余下10%多為真菌感染[3]。膿毒癥有著非常高的死亡率，若未及時(shí)采取治療措施，將大大增加患者的死亡風(fēng)險(xiǎn)。有研究顯示[1]，膿毒癥患者接受有效治療的時(shí)間每延遲1 h，死亡率將增加5%～10%。因此，臨床上需要對(duì)不同病因所致膿毒癥作出快速識(shí)別，以盡早對(duì)患者采取有效管理。

如今，膿毒癥已成為世界上導(dǎo)致感染患者死亡率增加的主要原因之一，也是目前重癥監(jiān)護(hù)病房（intensive care unit，ICU）面臨的一大難題，特別是其誘發(fā)的膿毒性休克和多器官功能障礙綜合癥（multiple organ dysfunction syndrome，MODS），已成為ICU 內(nèi)危重患者的主要死亡原因[4]。由于臨床上缺乏針對(duì)膿毒癥的特異性指標(biāo)，目前仍以耗時(shí)較長的實(shí)驗(yàn)室檢查來輔助確認(rèn)患者是否存在潛在感染，因此臨床上迫切需要一種快速、高效的檢測(cè)方法，以盡快明確膿毒癥及其潛在原因。

1.2 臨床常用輔助診斷膿毒癥的生物標(biāo)志物

由于膿毒癥大多由病原微生物感染所致，故目前臨床上大多通過血培養(yǎng)確定病原體種類以明確膿毒癥病因，同時(shí)為膿毒癥患者的診斷及治療提供有效信息，但由于血培養(yǎng)耗時(shí)較長，容易對(duì)患者接受治療的時(shí)間造成延遲，還易出現(xiàn)假陽性和假陰性結(jié)果[5]，因此臨床上常聯(lián)合降鈣素原（procalcitonin，PCT），C 反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）和外周血白細(xì)胞（white blood cells，WBC）等多種生物標(biāo)志物輔助診斷膿毒癥。

PCT 是臨床上常用于輔助診斷膿毒癥的可靠生物標(biāo)志物之一，與非膿毒癥患者比較，膿毒癥患者的血清PCT 值明顯升高，故血清PCT 值持續(xù)升高可提示存在膿毒癥。此外，在膿毒癥不同發(fā)展階段血PCT值也不相同，膿毒癥早期血PCT 水平較低，而在膿毒性休克等嚴(yán)重階段血PCT 水平則明顯升高[6]。盡管如此，在最新的“拯救膿毒癥運(yùn)動(dòng)（surviving sepsis campaign，SSC）”指南中指出，PCT 可用于診斷感染但不能識(shí)別膿毒癥病因[7]，其在膿毒癥中最主要的作用是指導(dǎo)抗生素的合理使用。

CRP 也是臨床上常用于輔助檢測(cè)感染及膿毒癥存在的生物標(biāo)志物，它是一種急性反應(yīng)蛋白，由炎癥及組織損傷后產(chǎn)生的細(xì)胞因子誘導(dǎo)肝臟產(chǎn)生，一般在感染后的4～6 h 內(nèi)開始逐漸升高。但其缺乏特異性，即在某些非感染情況下體內(nèi)CRP 水平也會(huì)升高[8]。

WBC 計(jì)數(shù)與分類因檢測(cè)價(jià)格低、 檢測(cè)速度相對(duì)較快，也成為目前診斷感染性疾病的常用指標(biāo)，其中以中性粒細(xì)胞占主要地位。研究發(fā)現(xiàn)[9]，該感染指標(biāo)易受到許多因素干擾，比如嚴(yán)重的組織損傷、血細(xì)胞破壞、急性中毒、急性大出血、血液系統(tǒng)疾病以及某些物理、化學(xué)因素?fù)p傷等都會(huì)影響體內(nèi)WBC 的數(shù)量變化，使其在早期識(shí)別膿毒癥方面有一定局限，無法做出準(zhǔn)確識(shí)別。

2 新型分子檢測(cè)技術(shù)——拉曼光譜

2.1 拉曼光譜的技術(shù)原理

拉曼光譜由印度物理學(xué)家Raman[10]于1928年觀測(cè)到，因此該技術(shù)被命名為“拉曼光譜”。拉曼光譜技術(shù)是一種利用單色光源照射被檢樣品，通過探測(cè)入射光與被檢樣品分子之間產(chǎn)生的非彈性散射來反映不同樣品的分子結(jié)構(gòu)及組成，進(jìn)而對(duì)不同種類的病原微生物做出快速區(qū)分的新型分子檢測(cè)技術(shù)[11]。由于不同分子在光照后吸收的能量不同，故振動(dòng)產(chǎn)生的光譜強(qiáng)度也不相同。光譜強(qiáng)度的高低與樣品中所含分子的濃度密切相關(guān)，分子濃度越高，呈現(xiàn)的光譜越強(qiáng)，提示該分子的可能性也就越大[11]。拉曼光譜技術(shù)正是根據(jù)不同分子產(chǎn)生的不同強(qiáng)度的特征性光譜對(duì)其做出識(shí)別的。

2.2 常用新型拉曼光譜技術(shù)——表面增強(qiáng)拉曼光譜

由于光子發(fā)生非彈性散射的概率非常低，大約每106 個(gè)光子中才出現(xiàn)一個(gè)非彈性散射[12]，使得普通拉曼光譜技術(shù)產(chǎn)生的信號(hào)通常很弱。20 世紀(jì)70年代，F(xiàn)leischmann 等[13]在測(cè)量吡啶在粗糙銀電極上的拉曼散射時(shí)偶然發(fā)現(xiàn)，吸附在粗糙金屬表面的分子可以顯著增強(qiáng)原本微弱的普通拉曼光譜信號(hào)，信號(hào)強(qiáng)度甚至可增至原來的百萬倍，并能檢測(cè)出吸附于金屬表面的單層物種?；谶@一發(fā)現(xiàn)，表面增強(qiáng)拉曼光譜（surface enhanced Raman spectroscopy，SERS）技術(shù)便初步建立起來，成為一種新型的拉曼光譜技術(shù)。此后，研究人員相繼研發(fā)了其他不同類型的新型拉曼光譜技術(shù)來增強(qiáng)普通拉曼光譜的信號(hào)強(qiáng)度，但SERS 是最常用的新型拉曼光譜技術(shù)之一[14]。

SERS 通過利用金屬粗糙表面或向樣品中加入金屬納米顆粒來增強(qiáng)普通拉曼光譜信號(hào)[15]。研究常用的金屬材料有金和銀兩種，兩者各有優(yōu)缺點(diǎn)：金不易被氧化，但利用金增強(qiáng)拉曼信號(hào)的程度比銀弱；銀增強(qiáng)拉曼信號(hào)的程度比金強(qiáng)，但容易被氧化[16]。SERS 在研究中識(shí)別樣品分子的方法有兩種：無標(biāo)記檢測(cè)和使用SERS 標(biāo)簽的間接檢測(cè)[17]。研究表明[18]，SERS 能夠?qū)η秩肴梭w的病原微生物進(jìn)行快速識(shí)別和區(qū)分，并可分別對(duì)存活和死亡的細(xì)菌種群進(jìn)行量化。

3 拉曼光譜技術(shù)識(shí)別不同病原體所致膿毒癥的潛力

3.1 識(shí)別細(xì)菌所致膿毒癥的潛力

臨床上引起膿毒癥的細(xì)菌類別有很多，如金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌等，其中金黃色葡萄球菌是導(dǎo)致膿毒癥的重要感染性因素之一，可產(chǎn)生各種毒力因子，且常分離出耐藥性金黃色葡萄球菌，如耐甲氧西林金黃色葡萄球菌[19]。Potluri 等[20]開發(fā)了一種SERS 納米標(biāo)記結(jié)合聚合酶鏈反應(yīng)的MRSA 鑒別方法，結(jié)果表明基于SERS 的檢測(cè)方法具有時(shí)間短、靈敏度高的優(yōu)點(diǎn)。Ciloglu 等[21]利用SERS 結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)技術(shù)對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌、甲氧西林敏感的金黃色葡萄球菌以及嗜肺軍團(tuán)菌（對(duì)照組）做出研究，最終證明SERS 結(jié)合機(jī)器學(xué)習(xí)技術(shù)是一種有效區(qū)分敏感細(xì)菌的可靠方法。此外，在Ho 等[22]的研究設(shè)計(jì)中通過鍍金的二氧化硅基質(zhì)獲得細(xì)菌細(xì)胞拉曼光譜，采用最先進(jìn)的卷積神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)圖像分類技術(shù)對(duì)30株細(xì)菌分離株進(jìn)行區(qū)分，得出拉曼光譜技術(shù)在鑒別細(xì)菌方面有著較高準(zhǔn)確度的結(jié)論。Kim 等[23]采用SERS 功能化底物對(duì)7 株大腸埃希菌分離株進(jìn)行了鑒定，驗(yàn)證了拉曼光譜技術(shù)對(duì)未知大腸埃希菌亞型進(jìn)行快速分型的可行性。Wang 等[24]開展了一項(xiàng)在SERS 基礎(chǔ)上使用硼酸功能化的多巴胺包被的Au@Ag 納米顆粒作為探針檢測(cè)致病菌的研究，該研究于30 min 內(nèi)便對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸埃希菌、痢疾志賀菌、銅綠假單胞菌和肺炎克雷伯菌作出分類。

3.2 識(shí)別真菌所致膿毒癥的潛力

除細(xì)菌外，念珠菌、霉菌等真菌也是導(dǎo)致膿毒癥發(fā)生的常見病原微生物。Hu 等[25]在研究中使用預(yù)先制備的Fe3O4@PEI（PEI 為聚乙烯亞胺）與帶正電荷的銀納米顆粒（AgNPs+）聯(lián)合SERS 用于念珠菌的檢測(cè)，采用正交偏最小二乘判別分析作為多因素分析工具直接從血清中鑒定念珠菌，而不是破壞細(xì)胞壁從真菌體內(nèi)提取DNA 檢測(cè)，經(jīng)驗(yàn)證，該方法具有良好的分類能力，能夠明確區(qū)分常見念珠菌，也是首個(gè)直接從血清中鑒定真菌的方法。Strycker 等[26]開發(fā)了一種利用785 nm 偏移激發(fā)拉曼差異技術(shù)結(jié)合神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)的模型對(duì)10 種具有醫(yī)學(xué)重要性的霉菌分生孢子的拉曼光譜進(jìn)行檢測(cè)，最終成功對(duì)研究中的霉菌分生孢子的拉曼光譜作出了快速、準(zhǔn)確的鑒別。

3.3 識(shí)別病毒所致膿毒癥的潛力

病毒性膿毒癥常見病原體有流感病毒、 冠狀病毒、皰疹病毒、腸道病毒等。Asif 等[27-28]在利用SERS檢測(cè)SARS-CoV-2 的研究中表明，拉曼光譜技術(shù)在鑒別病毒方面具有很大潛力，可作為快速檢測(cè)各種病毒的有效工具。Lim 等[29]的研究通過SERS 獲取病毒感染細(xì)胞的拉曼光譜信號(hào)，采用PCA 分析不同病毒拉曼光譜的關(guān)鍵特征，最終成功區(qū)分了由不同流感病毒感染的細(xì)胞。Dou 等[30]演示了一種基于納米級(jí)拉曼和紅外光譜的新型檢測(cè)方法，這種雙峰成像方法可以提供不同但互補(bǔ)的復(fù)雜生物標(biāo)本的結(jié)構(gòu)信息，有助于病毒種類的快速鑒定。Wang 等[31]將Fe3O4@Ag 納米顆粒作為磁性SERS 納米標(biāo)簽制作了基于SERS 的生物傳感器，以高靈敏度快速完成了甲型H1N1 流感和人腺病毒等兩種呼吸道病毒的檢測(cè)。此外，有研究表明，拉曼光譜技術(shù)還可能是定量研究宿主感染過程中活病毒和死病毒動(dòng)力學(xué)的有力工具[32-33]。

4 展望

綜上所述，拉曼光譜技術(shù)在識(shí)別不同病因所致膿毒癥方面表現(xiàn)出強(qiáng)大的分析潛力及發(fā)展空間。盡管該技術(shù)可通過分析病原微生物的特異性光學(xué)特征明確膿毒癥病因，但將其轉(zhuǎn)換到臨床環(huán)境中常規(guī)使用仍然是一個(gè)難題。解決這一難題的關(guān)鍵在于研制出一種成本低、便于操作且靈敏度高的振動(dòng)光譜分析儀以及構(gòu)建分子光譜數(shù)據(jù)庫。目前，研究者們正在努力減少拉曼光譜技術(shù)對(duì)臨床環(huán)境的種種要求，以推動(dòng)該技術(shù)盡快應(yīng)用于臨床環(huán)境中。