鋅摻雜氧化鋯的制備及其抗菌性能研究

朱曉東

（上海師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，上海 200234)

由于遺傳因素、意外創(chuàng)傷、細(xì)菌感染所導(dǎo)致的牙體缺損、牙面不齊以及牙周炎、齲齒等[1]是口腔常見的疾病。其中，由于細(xì)菌感染所導(dǎo)致的“齲齒”被稱為世界第三大非傳染性疾病?？谇患膊‰m然不會直接影響到人們的生命安全，但是卻影響著人們的生活質(zhì)量，經(jīng)久不治的話，會間接影響著人們的身體健康。臨床研究表明，由于細(xì)菌感染所造成的牙齒修復(fù)失敗也是不可忽視的問題。

氧化鋯作為無機生物材料研究應(yīng)用以來，因其具有良好的生物相容性、化學(xué)穩(wěn)定性等性能，被廣泛應(yīng)用于齒科修復(fù)領(lǐng)域[2]。其中，釔穩(wěn)定的四方型氧化鋯（Y-TZP）因為具有較高的穩(wěn)定性，得到了廣泛的關(guān)注[3]。鋅元素作為一種常見的抗菌元素，能夠有效抑制口腔細(xì)菌形成。例如，谷海晶等人發(fā)現(xiàn)，鋅鹽釋放出的Zn2+具有一定的氧化還原性, Zn2+進入細(xì)胞后與DNA 反應(yīng)并破壞酶化合物, 抑制細(xì)菌產(chǎn)酸，從而具有抑制菌斑形成、抗菌的作用, 且不同濃度Zn2+抗抑菌效果不同, 同時會影響鈣磷灰石晶體形成的類型[4]。

本研究采用化學(xué)沉淀法制備納米級鋅摻雜氧化鋯粉體，研究了合成條件對粉體形貌和物相的影響規(guī)律，并探究了隨著鋅摻雜量的增加，合成氧化鋯對大金黃色葡萄球菌和大腸桿菌的抗菌性，以及其生物相容性的研究。

1 實驗材料與方法

1.1 Zn-ZrO2 的制備

將八水合氯氧化鋯（ZrOCl2·8H2O）溶于蒸餾水中配置成0.5mol/l 的溶液，然后加入六水合硝酸釔（Y（NO3）3·6H2O）和六水合硝酸鋅，其中控制釔含量為氧化鋯含量的3mol%，鋅含量為氧化鋯含量的1wt%、1.5wt% 和2wt%。通過攪拌器將混合體系攪拌完全，緩慢滴加氨水調(diào)節(jié)溶液pH 為10 左右，得到白色沉淀物，再將該懸浮液室溫下靜置沉淀12h。沉淀物經(jīng)過過濾，用水和無水乙醇清洗，100℃的條件下烘干。最后700℃煅燒兩小時，得到納米級Zn-ZrO2粉體。

1.2 物相和形貌表征

用X 射線衍射儀（型號D/max2550V，日本）對Zn-ZrO2粉體進行分析并確定其物相成分；采用場發(fā)射掃描電子顯微鏡（型號S-3400，日本）觀察Zn-ZrO2粉體表面形貌。

1.3 抗菌性測試

抗菌性測試選用的細(xì)菌是最具代表性的革蘭氏陽性菌金黃色葡萄球菌，金黃色葡萄球菌的培養(yǎng)基采用營養(yǎng)肉湯（NB）培養(yǎng)基。

1.3.1 細(xì)菌增殖實驗

細(xì)菌稀釋至濃度為1×107cfu/ml，接著每0.02g 滅菌后的樣品中接種500μl 的菌液，并在37℃培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)12h 和24h。再向菌液中加入Alarm Blue 熒光染色劑（菌液與染色劑體積比為9 ：1）。繼續(xù)培養(yǎng)2h，之后再取100μl 菌液于96 孔板中，采用分光光度計檢測其熒光強度，檢測范圍在560nm 到590nm。

1.3.2 細(xì)菌形貌觀察

將樣品粉末用壓片機壓制成Φ7mm×3mm 大小的圓片，高溫滅菌后與500μl 菌懸液共培養(yǎng)24h，菌液濃度為1×107cfu/ml。之后將與菌液共同培養(yǎng)后的樣品片浸入濃度為2.5% 的戊二醛，并置于4℃的條件下避光保存12h。接著依次采用體積比為30%，50%，75%，90%，95%，100% 的乙醇對樣品片進行脫水處理，并用六亞甲基硅烷/ 乙醇溶液（1:2，2 ：1（體積比）和純六亞甲基硅烷）依次干燥10-20min。通風(fēng)干燥后表面噴金，用電子顯微鏡觀察樣品表面的細(xì)菌形貌。

1.3.3 細(xì)菌涂板

將兩種特定濃度的細(xì)菌懸液分別接種在含有0.02g 粉體的24 孔板內(nèi)，在37℃條件下培養(yǎng)24h，培養(yǎng)后的的菌懸液分別按10的冪次方稀釋并均勻地涂在相應(yīng)的培養(yǎng)皿上，37℃培養(yǎng)箱放置24h。24h 后取出瓊脂板置于凝膠成像系統(tǒng)設(shè)備的暗室中拍照。

1.4 生物相容性實驗

樣品的細(xì)胞相容性實驗選用人牙齦成纖維細(xì)胞（HGFs）進行，使用DMEM·F12 培養(yǎng)基，按照ISO10993.5 中所推薦的材料與浸提介質(zhì)比例進行材料浸提制備[5]。

1.4.1 細(xì)胞培養(yǎng)

液氮中取出細(xì)胞并在37℃下解凍，之后在離心機中離心處理5min，轉(zhuǎn)速為1000r/min。去除上清液，用移液槍加入新鮮培養(yǎng)基并吹打使其分散均勻，吸取適量的細(xì)胞懸浮液于培養(yǎng)皿中，在37℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3 天。

1.4.2 樣品浸提液的制備

將滅菌后的不同鋅摻雜量的氧化鋯粉末按照0μg/ml、50μg/ml、250μg/ml 和500μg/ml 的 粉 體 與 介 質(zhì) 比 例 浸 泡 在DMED·F12 培養(yǎng)基中。放置24h 后，無菌條件下過濾，取上清浸提液備用。

1.4.3 觀察細(xì)胞形貌

先將滅菌后的透明玻璃片放在24 孔板中，再將HGFs 接種于孔板中，接種密度為2.5×104cfu/ml，37℃條件下培養(yǎng)24h。之后去除培養(yǎng)液，加入樣品浸提液繼續(xù)培養(yǎng)24h，浸提液濃度為250μg/ml。之后再廢棄原培養(yǎng)基，用緩沖液將載有細(xì)胞的玻璃片清洗兩遍，加入2.5% 戊二醛固定，并放在4℃冰箱內(nèi)避光保存12h。之后采用不同濃度梯度的乙醇依次脫水處理。再用六亞甲基硅烷/ 乙醇溶液（1:2，2:1 和純六亞甲基硅烷）處理15min。最后室溫下通風(fēng)干燥，表面噴金后用電子顯微鏡觀察表面細(xì)胞形貌。

2 結(jié)果與分析

2.1 Zn-ZrO2 粉體的物相及形貌表征

圖1 不同含量鋅摻雜氧化鋯在20o-80o 的XRD 圖。

圖2 不同含量鋅摻雜氧化鋯產(chǎn)物的形貌圖。

圖1 中顯示，鋅摻雜氧化鋯粉體依舊是四方相為主的氧化鋯。在鋅摻雜氧化鋯產(chǎn)物的形貌圖2 中可見，不同含量鋅摻雜氧化鋯粉體都是粒度在幾十納米左右的顆粒，且分散性較差。

2.2 抗菌實驗

Zn-ZrO2粉體對大腸桿菌的抗菌結(jié)果：

圖3 （A）各組鋅摻雜氧化鋯對大腸桿菌的細(xì)菌增殖圖；（B）大腸桿菌與樣品片共培養(yǎng)24h 后的細(xì)菌形貌圖；（C）大腸桿菌與樣品粉末共培養(yǎng)24h 后的細(xì)菌涂板圖。

圖4 （A）各組鋅摻雜氧化鋯對金黃色葡萄球菌的細(xì)菌增殖圖；（B）金黃色葡萄球菌與樣品片共培養(yǎng)24h 后的細(xì)菌形貌圖；（C）金黃色葡萄球菌與樣品粉末共培養(yǎng)24h 后的細(xì)菌涂板圖。

在圖3（A）和4（A）細(xì)菌增殖圖中，未摻鋅的氧化鋯相比于空白對照組仍具有一定的抗菌性。同時，相比于0%Zn-ZrO2組，1%Zn-ZrO2、1.5%Zn-ZrO2和2%Zn-ZrO2組樣品對兩種細(xì)菌同樣顯示出了明顯的抗菌效果。在3（B）中大腸桿菌的形貌圖中可見，鋅的摻雜導(dǎo)致大腸桿菌形貌上不同程度的變化。而4（B）中金黃色葡萄球菌同樣也出現(xiàn)不同程度的凹陷和破裂現(xiàn)象。表明了鋅摻雜氧化鋯會破壞細(xì)菌結(jié)構(gòu)。在3（C）的細(xì)菌涂板實驗中，相比于其他組，1.5%Zn-ZrO2組瓊脂板中的菌落數(shù)最少，空白對照組的菌落數(shù)最多，其他組次之。而在4（C）中，同樣是空白對照組菌落數(shù)最多，0%Zn-ZrO2組次之，但是1%Zn-ZrO2、1.5%Zn-ZrO2和2%Zn-ZrO2組之間的菌落數(shù)差異不明顯?？傊\的摻雜會導(dǎo)致氧化鋯抗菌性的提高，但是不同摻雜量之間的抗菌性差異還不太明顯。

2.3 Zn-ZrO2 生物相容性實驗

圖5 的細(xì)胞形貌圖顯示，在與細(xì)胞共培養(yǎng)24h 后的0%Zn-ZrO2和 1%Zn-ZrO2樣品表面上，細(xì)胞數(shù)量居多且大都鋪展開來，而在1.5%Zn-ZrO2組樣品中，大量細(xì)胞還尚未鋪展。在2%Zn-ZrO2組樣品中，細(xì)胞出現(xiàn)數(shù)量明顯減少的現(xiàn)象。表明當(dāng)鋅摻雜量過高時，對HGFs 的生長具有一定的抑制作用。

圖5 250μg/ml 樣品浸提液分別與HGFs 共培養(yǎng)24h 之后的細(xì)胞生長圖。

3 小結(jié)

（1）以六水合硝酸鋅為鋅源，采用簡單的化學(xué)沉淀法將其加入到氧化鋯的制備過程中，合成了納米級鋅摻雜氧化鋯粉體，XRD 數(shù)據(jù)顯示鋅摻雜氧化鋯仍然是以四方相為主題的材料，且粒徑均分布在50nm 左右。

（2）通過改變鋅的摻雜量，得到了鋅摻雜氧化鋯對大腸桿菌和金黃色葡萄球菌不同程度的抗菌效。

（3）將所合成的鋅摻雜氧化鋯粉體應(yīng)用于對HGFs 的生物相容性實驗中，從樣品表面的細(xì)胞生長情況來看，當(dāng)鋅的摻雜量達(dá)到1.5% 時，對HGFs 具有明顯的抑制作用，當(dāng)摻雜量為2% 時，細(xì)胞數(shù)量明顯減少。