循環(huán)腫瘤細胞檢測在乳腺癌臨床應用中的研究進展

孫鴻妍，楊 梅，張曉天，任浩文，劉秀敏，朱洪權

(吉林大學第二醫(yī)院 檢驗科，吉林 長春130041)

乳腺癌是一種臨床上較為常見的婦科惡性腫瘤，嚴重威脅著我國女性生命健康[1]。在乳腺癌患者中，有很多患者由于病灶轉(zhuǎn)移至其他臟器而引發(fā)死亡。據(jù)資料顯示，乳腺癌轉(zhuǎn)移十分迅速，在早期檢查時就發(fā)生轉(zhuǎn)移者可達10%，而僅有20%的患者在確診乳腺癌后可生存5年以上[2]。因此，危及乳腺癌患者生命的關鍵在于乳腺癌的復發(fā)和轉(zhuǎn)移。對于以往乳腺癌的診斷，常采用影像學方法來檢查乳腺癌原發(fā)病灶。然而，該方法只有病灶腫物直徑大于5 mm時才可被捕捉到，故無法及時發(fā)現(xiàn)腫瘤是否轉(zhuǎn)移[3]。因此，對于乳腺癌轉(zhuǎn)移和診斷的研究，尋找一種可盡早發(fā)現(xiàn)病灶轉(zhuǎn)移情況的檢測指標成為了現(xiàn)今研究的熱點。而通過液體活檢所得到的循環(huán)腫瘤細胞，其操作微創(chuàng)性及可實時監(jiān)測性等優(yōu)點可實現(xiàn)乳腺癌的早期診斷和監(jiān)測轉(zhuǎn)移[4]。

1 CTC的生物學特性

CTC是指來源于原發(fā)瘤體，在某些理化因素作用下不受血流切割力及機體免疫效應等影響脫離基底膜而進入血液的腫瘤細胞[5]。由于來自原發(fā)瘤體，其與原發(fā)腫瘤細胞性質(zhì)相同，因此可通過對CTC的檢測來判斷腫瘤的轉(zhuǎn)移情況。腫瘤細胞脫離基底膜后進入血液，在血流切割損傷、免疫殺傷以及細胞凋亡等作用下，最終在外周血所有細胞中，有活性的CTC僅占<0.01%，稱為高轉(zhuǎn)移潛能CTC[6]。更有研究表明，CTC在外周血中含量甚微，檢測106-107個白細胞才能捕捉到一個CTC。這表明CTC數(shù)量具有稀有性[7]。同時，CTC具有較強的異質(zhì)性。為了加速腫瘤的轉(zhuǎn)移進程，部分CTC會有上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(Epithelial-mesenchymal transition,EMT)的發(fā)生，即上皮細胞表型轉(zhuǎn)化為間質(zhì)細胞表型，導致上皮細胞形態(tài)發(fā)生改變[8-9]。不同腫瘤以及不同TNM分期的腫瘤其細胞表型會有所不同，因此，檢測腫瘤患者的CTC在癌癥的精確診斷中發(fā)揮了重要作用。

2 CTC的轉(zhuǎn)移機制

從原發(fā)病灶脫落的腫瘤細胞躲避了多種殺傷因素而存活下來，進一步浸潤血管內(nèi)皮進入血液或淋巴系統(tǒng)并參與循環(huán)，植入靶器官并增殖，從而實現(xiàn)腫瘤的轉(zhuǎn)移[10]。這就是腫瘤轉(zhuǎn)移過程中的“種子-土壤”學說。Giovanni Zarrilli等[11]認為，種子是由腫瘤細胞、其他細胞和基質(zhì)組成的復合物。其中的內(nèi)皮細胞受腫瘤細胞刺激后產(chǎn)生新的細小血管為腫瘤增殖提供能量及動力；巨噬細胞產(chǎn)生可溶解因子以促進其生長及遷移。土壤則是靶器官的基底膜，為腫瘤細胞的增殖提供合適的環(huán)境。同時，上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化通過促進CTC的生成及遷移，在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中起到重要作用。CTC發(fā)生EMT時上皮連接蛋白表達減少，間質(zhì)黏附蛋白表達增加，上皮細胞轉(zhuǎn)變?yōu)樗笮蔚拈g質(zhì)細胞，在細胞形態(tài)學上有利于腫瘤細胞的遷移[12]。EMT可提高CTC在外周血中的存活能力，增加了CTC的移行性，進而增加了CTC的侵襲性[13]。CTC不斷生成及遷移，進而侵襲組織，完成了腫瘤的轉(zhuǎn)移過程。

3 CTC檢測在乳腺癌診斷及治療中的應用

3.1 乳腺癌的早期篩查及診斷

由于液體活檢的創(chuàng)傷較小、操作簡單、樣本較容易獲取，且CTC的檢測僅需采集受檢者的外周血，故可通過CTC檢測來對乳腺癌進行早期篩查。Cristofanilli等[14]認為，通過檢測外周血中是否存在CTC以及在一段時間后CTC數(shù)是否有增加趨勢，可以較早篩查出乳腺癌患者，早期即可采用適宜的方案進行治療。Kallergi G等[15]對25例轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者CTC中間質(zhì)標志物Vimentin及Twist 1進行檢測，結果顯示均為陽性，故可利用CTC對轉(zhuǎn)移性乳腺癌進行診斷。Lang JE等[16]認為，目前，我們通過檢測CTC的RNA序列，來對乳腺癌進行診斷是可行的。該方法通過對乳腺癌患者的CTC進行全轉(zhuǎn)錄組分析，并與乳腺癌腫瘤細胞進行比對，從而實現(xiàn)乳腺癌類型的診斷。Gradilone A等[17]對92例乳腺癌患者的CTC進行檢測，其中有91%的Ⅳ期患者CTC具有ALDH1(+)，波形蛋白(+)，纖維蛋白(+)的特征。并且，ALDH1(+)與疾病分期顯著相關。因此，CTC可對不同分期的乳腺癌患者進行診斷。對于乳腺癌的診斷，由于免疫殺傷等作用的影響，CTC在血液中含量過少，因此，仍需以組織活檢及影像學檢查為基礎，將CTC檢測作為輔助檢查手段，更早地發(fā)現(xiàn)乳腺癌的存在。

3.2 預測乳腺癌的轉(zhuǎn)移情況

腫瘤細胞從原發(fā)病灶脫落進入到外周血中形成CTC，具有與原發(fā)腫瘤相似的生物學特性，故可通過對血液中CTC的檢測來反映乳腺癌原發(fā)病灶的狀態(tài)。因此，CTC可作為乳腺癌患者轉(zhuǎn)移的早期預警。CTC對轉(zhuǎn)移灶數(shù)目的預測能力與CTC的數(shù)量成正比[18]。CTC的檢測可用于評估轉(zhuǎn)移性乳腺癌的轉(zhuǎn)移灶數(shù)目。據(jù)文獻顯示，Ning Xie等[19]選取了38例轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者，同時在健康女性中隨機抽取25位作為對照組，通過免疫熒光法檢測CTC。結果表明，有73.3%的患者血液中至少含有1個CTC，而對照組無CTC檢出。按轉(zhuǎn)移部位數(shù)量分為三組，1個、2個及3個以上的CTC陽性率分別為33%、50%及95.45%。且患者CTC陽性率越高，患者的總生存率(OS)越短。經(jīng)多變量分析可知，患者OS與CTC及轉(zhuǎn)移灶數(shù)目，呈顯著相關。此外，CTC檢測是轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者有效的預后工具。Huebner等[20]進行了一項CTC檢測與其預測轉(zhuǎn)移性乳腺癌預后能力的研究。在該研究中，血液中≥1個CTC的患者的OS低于未檢測出CTC的患者。且當患者出現(xiàn)每7.5 ml血液中≥5個CTC時，患者的無進展生存時間(PFS)和OS均出現(xiàn)顯著縮短。由此可見，CTC是轉(zhuǎn)移性乳腺癌患者預后的關鍵預測因子。因此,利用液體活檢的方式對外周血中的CTC進行檢測，可實現(xiàn)對乳腺癌患者轉(zhuǎn)移情況的動態(tài)監(jiān)測。

3.3 動態(tài)監(jiān)測乳腺癌進展及選擇治療方案

在已確診的乳腺癌患者中，對其外周血中CTC進行檢測，來判斷原發(fā)病灶的異質(zhì)性，通過異質(zhì)性來動態(tài)監(jiān)測癌癥進展情況。Vasseur A等[21]在一項研究中發(fā)現(xiàn)，選取254名乳腺癌患者利用AdnaTest和CellSearch系統(tǒng)進行CTC檢測。得到的結果分別為：有42%的HER2+患者中只含有HER2-的CTC，有33%的HER2-患者中含有HER2+的CTC。這反映了乳腺癌在疾病發(fā)展過程中出現(xiàn)了異質(zhì)性，腫瘤的耐藥性也會隨之增加。隨時對患者的CTC進行檢測，通過CTC陽性率的變化，可盡早發(fā)現(xiàn)對一線治療產(chǎn)生耐藥性的情況。這一變化，可指導醫(yī)生盡早改變治療藥物，在惡化、轉(zhuǎn)移之前進行干預。這種方法發(fā)現(xiàn)病人耐藥性可早于臨床表現(xiàn)或影像學約2個月[22]。此外，通過CTC的計數(shù)，可以用來選擇乳腺癌患者適宜的治療方案。通過STIC-CTC試驗可以發(fā)現(xiàn)，當CTC<5個/7.5 ml時，采用內(nèi)分泌治療，當CTC≥5個/7.5 ml時，進行化學治療的治療方案，使乳腺癌患者的PFS得以顯著升高[23]。因此，分析外周血中的CTC可判斷腫瘤的發(fā)展情況，并有助于進行更有效的治療選擇。

3.4 判斷藥物的治療療效

通過CTC的檢測，可為患者確定最有效的治療方法。治療過程中，根據(jù)患者CTC的變化情況可判斷患者的預后，從而判斷治療藥物療效。Magbanua MJM等[24]最近的一項研究表明，采用治療前后CTC變化趨勢曲線與單純CTC計數(shù)相比可以更全面地判斷藥物療效，也能更好地預測乳腺癌患者的OS及PFS。通過對CTC的檢測，可以判斷腫瘤存在的異質(zhì)性，這可為HER2-乳腺癌但HER2+的CTC患者使用抗HER2藥物療效不足提供依據(jù)，從而及時尋找新的治療藥物[25]。目前有研究表明，利用CTC計數(shù)可知，外周血中CTC<5個/7.5 ml的患者早先采取新療法要比CTC≥5個/7.5 ml的患者療效好[26]。因此，CTC的檢測對于判斷治療乳腺癌藥物的療效，具有一定的幫助。

3.5 發(fā)現(xiàn)新的治療靶點

由于外周血的采集較為方便，因此，可隨時、多次對外周血中CTC進行檢測，這種液體活檢技術可使醫(yī)生隨時掌握乳腺癌患者的病情變化。由于腫瘤具有異質(zhì)性，通過液體活檢可檢測到在轉(zhuǎn)移過程中腫瘤細胞可能發(fā)生的生化變化，而這在原發(fā)腫瘤中是不存在的，有助于尋找適宜的、有針對性的治療靶點[27]。此外，不同患者的CTC表型存在差異，對CTC的分子表型進行分析可以發(fā)現(xiàn)相應的治療靶點，從而指導臨床上更好地進行個體化治療，有助于進入“精準醫(yī)療時代”[28]。可對乳腺癌患者的CTC進行RT-PCR檢測，判斷腫瘤細胞基因是否發(fā)生突變。若發(fā)生突變可能表明耐藥性增強，提示需要尋找新的治療靶點[29]。但該方法局限于CTC計數(shù)較高的患者。就目前CTC的生物學分選方法來說，捕獲CTC的標志物常采用上皮細胞粘附分子(EpCAM)。但由于EpCAM在發(fā)生EMT的過程中可能發(fā)生下調(diào)，因此，目前需尋找更多的間質(zhì)標志物來捕獲CTC，完成對CTC的富集[30]。根據(jù)對CTC的檢測，可以判斷腫瘤細胞mRNA及蛋白質(zhì)的表達情況，而許多蛋白質(zhì)是抗腫瘤藥物的實際靶點，這對確定乳腺癌的治療十分有利[31]。

4 小結

CTC檢測作為乳腺癌檢查的輔助手段，由于其可實時監(jiān)測乳腺癌的進展、識別腫瘤異質(zhì)性且創(chuàng)傷小等優(yōu)點，已經(jīng)成為了一項臨床感興趣的液體活檢技術。CTC可在體外進行培養(yǎng)，目前，研究人員已成功建立乳腺癌患者的CTC細胞系及CTC異種移植物，可將二者用于體內(nèi)及體外藥敏試驗，從而判斷腫瘤細胞耐藥性及增加新的治療靶點。目前來看，部分實驗對CTC數(shù)量具有一定的要求，但CTC檢測的靈敏度及特異性較低，低檢出率往往限制了CTC檢測的臨床應用，未來應尋找新的分離及檢測技術，更好地將CTC應用于臨床。目前新興的液體活檢技術，也包括ctDNA的檢測。ctDNA可提供腫瘤的基因組信息，其比CTC更易分離，且具有較高的特異性及靈敏度。但有些信息是無法從ctDNA中獲得的，例如CTC可提供從蛋白質(zhì)和RNA中獲得的信息。故在組織活檢及影像學基礎上，可將CTC與ctDNA結合，對乳腺癌患者進行更加全面，多方位檢測。發(fā)揮液體活檢技術更大的潛力，使患者及時得以更有針對性的治療。