間充質(zhì)干細(xì)胞遷移在骨組織損傷修復(fù)中的作用

顏杉鈺，梅宏翔，李娟

口腔疾病研究國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 國(guó)家口腔疾病臨床醫(yī)學(xué)研究中心 四川大學(xué)華西口腔醫(yī)院正畸科，四川 成都（610041）

間充質(zhì)干細(xì)胞（mesenchymal stem cell，MSCs）具有自我更新與增殖、響應(yīng)趨化信號(hào)并遷移至目標(biāo)部位以及響應(yīng)分化信號(hào)進(jìn)行終末分化的能力，在骨形成以及骨損傷修復(fù)過(guò)程中發(fā)揮著重要作用［1］，并已廣泛用于干細(xì)胞移植、組織工程與免疫治療中，但是由于MSCs歸巢能力較差，其在臨床中的應(yīng)用尚受到局限。研究證實(shí)血液循環(huán)中MSCs感知到組織損傷之后，會(huì)遷移到損傷部位，并與受損組織處MSCs一同進(jìn)行組織特異性分化，協(xié)同修復(fù)創(chuàng)傷組織［1］。所以提高M(jìn)SCs遷移效率將有利于其在再生醫(yī)學(xué)和臨床治療中的應(yīng)用。本文就MSCs遷移與骨代謝的相關(guān)性出發(fā)，探討了骨組織損傷中介導(dǎo)MSCs遷移的具體機(jī)制，并對(duì)其臨床應(yīng)用前景進(jìn)行綜述。

1 MSCs遷移能力影響骨代謝

組織受損后，局部損傷組織會(huì)釋放信號(hào)因子以激活局部和全身的MSCs，導(dǎo)致趨化因子受體表達(dá)升高。同時(shí)，損傷部位釋放的基質(zhì)細(xì)胞衍生因子1（stromal cell-derived factor-1，SDF-1）等趨化因子能與MSCs表面受體結(jié)合，募集MSCs到達(dá)損傷部位，參與組織再生過(guò)程［2］。目前，體外實(shí)驗(yàn)主要使用遷移實(shí)驗(yàn)（transwell實(shí)驗(yàn)）或劃痕實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞遷移能力進(jìn)行評(píng)估；體內(nèi)研究則會(huì)對(duì)目的MSCs進(jìn)行標(biāo)記，局部注射或靜脈注射后24 h進(jìn)行成像或獲取目的MSCs，評(píng)估遷移至特定部位的能力。

MSCs遷移功能異常可能是導(dǎo)致骨代謝相關(guān)疾病的直接原因，其中包括遷移部位及遷移速度異常。MSCs的遷移部位主要受到破骨細(xì)胞分泌的生長(zhǎng)因子（transforming growth factor，TGF）-β1調(diào)控。高表達(dá)的TGF-β1將導(dǎo)致成骨分化活性增加以及異位成骨，并成為進(jìn)行性骨干發(fā)育不良（camuratiengelmann，CED）的重要誘導(dǎo)因素［3］。而骨質(zhì)疏松患者的MSCs遷移速度下降會(huì)導(dǎo)致骨折愈合能力下降，這可能與MSCs的整聯(lián)蛋白表達(dá)降低有關(guān)，導(dǎo)致對(duì)骨形態(tài)發(fā)生蛋白（bone morphogenetic protein，BMP）反應(yīng)性下降，下調(diào)MSCs的遷移及成骨分化能力［4］。這些都表明在骨組織生長(zhǎng)發(fā)育及損傷部位修復(fù)中，MSCs遷移扮演著重要角色。

2 骨組織損傷部位募集MSCs并促進(jìn)其成骨分化

在骨組織損傷修復(fù)中，MSCs遷移至損傷組織后，需要分化為成骨細(xì)胞才能形成骨基質(zhì)修復(fù)骨損傷。所以參與該過(guò)程的MSCs的遷移能力與成骨分化正向相關(guān)，并可能與兩者共用部分通路有關(guān)。Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子（Runt-related transcription factor 2，Runx2）是MSCs成骨分化早期的主要轉(zhuǎn)錄因子，其能通過(guò)與PI3K-蛋白激酶B（protein kinase B，Akt）信號(hào)通路相互作用，促進(jìn)細(xì)胞遷移和成骨分化［5］。而作為MSCs成骨分化中重要的通路，經(jīng)典Wnt和非經(jīng)典Wnt通路在影響成骨分化的同時(shí)，也能調(diào)控MSCs遷移［6］。

對(duì)骨組織損傷的即刻反應(yīng)是血腫的形成和炎癥，在炎癥階段大量聚集的免疫細(xì)胞能將MSCs募集到骨折部位。巨噬細(xì)胞作為骨折修復(fù)中免疫反應(yīng)不可缺少的部分，幾乎參與了整個(gè)修復(fù)階段。巨噬細(xì)胞的條件培養(yǎng)基中含有大量分泌的炎癥因子和生長(zhǎng)因子，能夠促進(jìn)MSCs的遷移和成骨分化［7］。而骨折愈合前期巨噬細(xì)胞的耗竭會(huì)使新生骨骼的密度和強(qiáng)度降低一半［8］。同時(shí)，骨折部位的炎癥反應(yīng)會(huì)使巨噬細(xì)胞M0分化為M1和M2亞群，M1巨噬細(xì)胞即經(jīng)典巨噬細(xì)胞參與初始急性炎癥階段，而M2巨噬細(xì)胞能夠分泌生長(zhǎng)因子以及CCL2、CXCL8和SDF-1等趨化因子，募集MSCs至骨折部位參與修復(fù)過(guò)程［9］。同時(shí)，下調(diào)M1會(huì)抑制MSCs對(duì)骨折部位的募集以及成骨分化的啟動(dòng)過(guò)程，從而延緩骨折修復(fù)，降低新生骨密度［10］。

損傷組織初始的炎癥反應(yīng)中會(huì)釋放多種趨化信號(hào)分子：比如SDF-1，血小板源生長(zhǎng)因子（plateletderived growth factor，PDGF）等炎癥因子或生長(zhǎng)因子；啟動(dòng)有利于愈合的信號(hào)級(jí)聯(lián)反應(yīng)，比如Smads通路，募集MSCs到損傷部位并參與修復(fù)過(guò)程［9］。其中SDF-1是最為重要的趨化因子，介導(dǎo)MSCs遷移到損傷部位。SDF-1在骨修復(fù)的早期階段與MSCs上的CXCR4結(jié)合，促進(jìn)細(xì)胞遷移和新骨形成［11］。CXCR4高表達(dá)的MSCs對(duì)SDF-1的趨化作用增強(qiáng)，增強(qiáng)MSCs對(duì)骨髓的歸巢能力［12］。

損傷組織血小板能分泌PDGF參與MSCs募集過(guò)程，PDGF-AA能反饋性下調(diào)PDGFα，促進(jìn)BMPRIII復(fù)合物形成，從而激活BMP-Smad1/5/8信號(hào)通路，分別通過(guò)Twist1/Atf4軸和Runx2/Osx軸促進(jìn)MSCs遷移和成骨分化［13］。

TNF-α能夠通過(guò)介導(dǎo)絲裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPKs）p38磷酸化，從而上調(diào)富含亮氨酸的α-2-糖蛋白1（leucinerich-alpha-2-glycoprotein 1，LRG1），促進(jìn)MSCs遷移以及新生血管形成，并有利于隨后的骨形成［14］。而TGF-β1會(huì)與TβRI結(jié)合，使Smad2/3磷酸化并與Smad4結(jié)合，改變MSCs的遷移能力。在敲除Tgfb1基因的小鼠中，MSCs向骨小梁表面遷移能力下降，成骨細(xì)胞數(shù)目變少，骨形成能力降低［3］。

一些研究通過(guò)不同的方式改變細(xì)胞的遷移能力，證實(shí)骨組織損傷修復(fù)能力與MSCs遷移的相關(guān)性。在牽張成骨模型中，切除交感神經(jīng)的小鼠去甲腎上腺素（norepinephrine，NE）和β3-腎上腺素能受體（β3-adrenergic receptor，ADRB3）表達(dá)下降，MSCs更多地募集在骨損傷部分。而體外實(shí)驗(yàn)證明NE能與MSCs表面的ADRB3結(jié)合，從而下調(diào)遷移相關(guān)基因基質(zhì)金屬蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）-2，并上調(diào)抗遷移基因TIMP-3，抑制SDF-1誘導(dǎo)的遷移、成骨分化以及礦化結(jié)節(jié)的形成［15］。增加MSCs的CXCR4表達(dá)后，細(xì)胞對(duì)SDF-1的趨化能力及歸巢到骨髓的能力增強(qiáng)，同時(shí)，SDF-1/CXCR4軸的激活能夠在骨修復(fù)早期將MSCs募集到損傷部位，從而促進(jìn)骨修復(fù)［16］。

綜上，骨組織損傷初始炎癥階段，趨化信號(hào)分子會(huì)促進(jìn)MSCs募集到損傷部位并進(jìn)一步成骨分化，修復(fù)骨組織損傷。MSCs遷移能力上調(diào)，會(huì)激活其成骨分化能力，有利于骨損傷修復(fù)。

3 MSCs募集過(guò)程中細(xì)胞外基質(zhì)硬度改變，為骨損傷修復(fù)提供準(zhǔn)備

骨組織損傷過(guò)程中，MSCs會(huì)從骨髓或者外周血等部位遷移到損傷部位，其所處基質(zhì)硬度水平會(huì)發(fā)生改變。細(xì)胞內(nèi)肌動(dòng)蛋白和肌球蛋白絲的交叉橋聯(lián)所產(chǎn)生的收縮力及表面黏著斑對(duì)基質(zhì)的粘附力會(huì)改變細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)，從而活化MSCs，上調(diào)細(xì)胞遷移和成骨分化能力，促進(jìn)骨損傷修復(fù)［17］。

MSCs處于天然組織硬度相匹配的基質(zhì)上培養(yǎng)時(shí)會(huì)呈現(xiàn)出譜系特異性分化，比如在硬基質(zhì)中MSCs成骨分化能力增強(qiáng)，在軟基質(zhì)中MSCs更傾向于成脂分化［18］。同時(shí)，MSCs具有趨硬性（durotaxis），即MSCs向更硬的區(qū)域遷移，這可能是由于MSCs的單個(gè)黏著斑能夠向細(xì)胞外基質(zhì)施加波動(dòng)性的拉力來(lái)感知周圍的硬度，并通過(guò)黏著斑激酶（focal adhesion kinase，F(xiàn)AK）/磷酸化樁蛋白/黏著斑蛋白來(lái)決定細(xì)胞反應(yīng)［19］。MSCs用于感知硬度的整合素α4的過(guò)表達(dá)也會(huì)增強(qiáng)促進(jìn)其對(duì)骨髓的歸巢和成骨分化能力［20］。Lin等［21］將MSCs培養(yǎng)在基質(zhì)硬度為1～20 kPa的水凝膠中，發(fā)現(xiàn)高基質(zhì)硬度下，細(xì)胞Lamin A/C下調(diào)使得核硬度降低，MMP等蛋白酶分泌增加，從而上調(diào)硬基質(zhì)中的MSCs遷移速率。同時(shí)，與整聯(lián)蛋白相連的激酶（integrin-linked kinase，ILK）缺乏會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞骨架以及BMP/Smad和Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)受損，細(xì)胞遷移能力和成骨分化受到影響，最終抑制小鼠體內(nèi)的骨發(fā)育，降低骨量［22］。然而，整合素的表達(dá)并不總是與遷移呈正相關(guān)，因?yàn)殡S著硬度的增加，黏附依賴性遷移會(huì)轉(zhuǎn)變?yōu)榉丘じ揭蕾囆赃w移［21］。下調(diào)ROCK信號(hào)通路能抑制肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維和黏著斑的形成，反而會(huì)促進(jìn)細(xì)胞突起形成，增強(qiáng)細(xì)胞的遷移和成骨分化能力，并促進(jìn)MSCs募集及骨形成［23］。

以上研究表明MSCs向骨損傷部位的遷移過(guò)程中存在著較為復(fù)雜的調(diào)控機(jī)制，為MSCs在骨損傷部位進(jìn)一步發(fā)揮修復(fù)功能提供基礎(chǔ)。

4 MSCs遷移在骨相關(guān)疾病治療中的應(yīng)用

4.1 骨質(zhì)疏松癥

對(duì)MSCs修飾后進(jìn)行局部或全身注射利于骨質(zhì)疏松癥的恢復(fù)。CXCR4高表達(dá)的MSCs在局部骨髓注射以及尾靜脈注射后，在骨髓中存留率及歸巢能力更高，同時(shí)靜脈注射進(jìn)入骨質(zhì)疏松小鼠后，可完全恢復(fù)骨量并部分恢復(fù)骨形成［24］。而高表達(dá)CXCR4和核心結(jié)合因子α亞基1（core-binding factor subunit alpha-1，Cbfa-1）的MSCs能完全恢復(fù)骨質(zhì)疏松小鼠的骨骼強(qiáng)度和硬度［24］。另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)高表達(dá)CXCR4和NF-κB受體激活劑（receptor activator of NF-kappa B，RANK）的MSCs能夠促進(jìn)MSCs向骨骼的歸巢，改善卵巢切除小鼠的骨礦物質(zhì)密度［12］。Lim等［11］對(duì)Icaritin在骨質(zhì)疏松中的作用進(jìn)行了一系列探究，發(fā)現(xiàn)其能夠通過(guò)激活信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)激活因子轉(zhuǎn)錄因子3（signal transduction activator transcription factor 3，STAT-3）的磷酸化會(huì)上調(diào)CXCR4，從而促進(jìn)人MSCs向基質(zhì)細(xì)胞衍生因子趨化及其成骨分化能力。甲狀旁腺素作為治療骨質(zhì)疏松癥的骨合成代謝藥物，能進(jìn)一步促進(jìn)MSCs募集并歸巢至骨折部位，促進(jìn)成骨及血管生成，有利于骨質(zhì)疏松小鼠骨折部位的恢復(fù)［25-26］。這些藥物可能進(jìn)一步成為骨質(zhì)疏松癥的治療藥物或佐劑，有利于骨質(zhì)疏松患者骨折預(yù)后。

4.2 骨質(zhì)缺損

目前骨質(zhì)缺損研究主要集中于骨組織工程。對(duì)支架材料進(jìn)行表面處理能促進(jìn)MSCs募集并黏附在支架，同時(shí)能促進(jìn)成骨分化和礦化物質(zhì)的形成。無(wú)機(jī)底物對(duì)MSCs的遷移及分化具有重要作用。He等［27］發(fā)現(xiàn)對(duì)膠原支架進(jìn)行羥基磷灰石表面處理將促進(jìn)MSCs形成發(fā)育良好的肌動(dòng)蛋白絲和黏著斑，降低N-鈣黏蛋白和α-連環(huán)蛋白水平，提高了MSCs的遷移能力，進(jìn)而通過(guò)Wnt-1/β-Catenin通路上調(diào)成骨分化水平。

在支架上荷載藥物能夠進(jìn)一步增強(qiáng)支架材料誘導(dǎo)的MSCs募集，進(jìn)一步促進(jìn)骨形成。納米粒子修飾的殼聚糖-瓊脂糖-明膠支架能負(fù)載SDF-1和BMP-2并緩慢釋放，促進(jìn)MSCs向支架遷移和成骨分化［28］。對(duì)明膠/納米羥基磷灰石（G/nHAp）支架上荷載大麻二酚能促進(jìn)MSCs遷移和成骨分化，促進(jìn)骨缺損修復(fù)［29］。在外泌體/β-TCP復(fù)合支架中，外泌體能夠被內(nèi)源性MSCs內(nèi)化，增強(qiáng)細(xì)胞遷移及成骨分化能力，同時(shí)促進(jìn)體內(nèi)骨缺損恢復(fù)［30］。

4.3 骨關(guān)節(jié)炎

在膠原誘導(dǎo)的鼠關(guān)節(jié)炎模型以及類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者發(fā)炎關(guān)節(jié)中有MSCs浸潤(rùn)［31］。類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者骨髓中存在著過(guò)量的凋亡細(xì)胞，MSCs對(duì)凋亡細(xì)胞的吞噬能促進(jìn)其成骨分化并表達(dá)趨化分子受體CXCR4/5以及黏附分子ICAM-1，促使其向發(fā)炎的關(guān)節(jié)遷移，其分泌的IL-6等炎癥因子，還能激活CD4+T細(xì)胞并促使其向Th17細(xì)胞分化［32］。這些研究為干細(xì)胞療法治療骨關(guān)節(jié)炎提供了理論基礎(chǔ)。

5 展望

在MSCs參與損傷組織修復(fù)過(guò)程中，損傷部位的細(xì)胞募集對(duì)整個(gè)修復(fù)過(guò)程十分重要。而干細(xì)胞療法現(xiàn)在面臨著MSCs遷移能力不足的問(wèn)題，亟需進(jìn)一步研究?，F(xiàn)在的研究主要集中于信號(hào)分子對(duì)MSCs遷移及成骨分化能力的影響，真正探究不同遷移速率MSCs在成骨分化及骨損傷修復(fù)中的功能差異較少，需要進(jìn)一步的研究加以證實(shí)。

【Author contributions】Yan SY performed the literature review and article drafting；Mei HX performed the literature review and article revision；Li Jdid the direction guidance and article revision.