脫氧核糖核酸酶1與肝臟疾病關(guān)系的研究進(jìn)展

王 娟，安家興，庹必光

遵義醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院消化內(nèi)科 貴州遵義 563000

脫氧核糖核酸酶(DNase)是特異性靶向DNA的核酸內(nèi)切酶。DNase中發(fā)揮主要作用的是DNase1家族，其主要功能為降解體內(nèi)異常的DNA。DNase1家族屬于Tat D蛋白家族，現(xiàn)有DNase1、DNase1L1、DNase1L2和DNase1L3共4個(gè)成員，成員之間具有很高的序列同源性，但表達(dá)部位卻有很大差異[1]。DNase1是該家族最先被發(fā)現(xiàn)的成員，有助于清除循環(huán)中游離的DNA。缺乏DNase1時(shí)，血清中DNA/染色質(zhì)復(fù)合物將會(huì)持續(xù)存在，導(dǎo)致自身抗體的形成。DNase1在系統(tǒng)性紅斑狼瘡(systemic lupus erythematosus，SLE)、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、干燥綜合征、甲狀腺自身免疫性疾病和炎癥性腸病患者的血清中活性降低[2-4]，是許多自身免疫性疾病(尤其是SLE)的危險(xiǎn)因素[5-7]。DNase1是腎小管上皮細(xì)胞中消化DNA的主要核酸酶[8]，其功能障礙會(huì)導(dǎo)致嚴(yán)重的狼瘡性腎炎[9]。Dnase1已被證明可以成功地消化囊性纖維化中的游離DNA，可以清除黏液，達(dá)到治療目的[10]。

肝臟是體內(nèi)一線免疫組織，每分鐘體內(nèi)血液總量的30%會(huì)流經(jīng)肝臟[11]。因此，血液循環(huán)中積累的DNA片段可以引起與肝臟相關(guān)的免疫反應(yīng)，從而導(dǎo)致一系列肝臟疾病。Ludwig等[12]的研究表明肝臟是血清DNase1的來(lái)源之一，DNase1可能在阻止一些肝臟疾病的進(jìn)展方面發(fā)揮重要作用。本綜述旨在闡明DNase1的結(jié)構(gòu)和功能，闡明其在肝病發(fā)病機(jī)制中的作用，從而為該類疾病的診斷和治療提供更多選擇。

1 DNase1的結(jié)構(gòu)和功能

DNase1是一種由283個(gè)氨基酸組成的核酸內(nèi)切酶，相對(duì)分子質(zhì)量為31 434。該基因位于16p13.3號(hào)染色體上，包含9個(gè)外顯子和8個(gè)內(nèi)含子，這些內(nèi)含子跨越15 kb基因組DNA[13]。DNase1包含一個(gè)特征性的 DNase結(jié)構(gòu)域。DNase結(jié)構(gòu)域是構(gòu)成DNase1超家族(一種由重復(fù)突變產(chǎn)生的祖先基因)的基礎(chǔ)[14]。DNase1超家族通常作為磷酸水解酶來(lái)裂解DNA的磷酸二酯鍵[15]。DNase結(jié)構(gòu)域高度保守，其中257個(gè)氨基酸殘基分散在整個(gè)一級(jí)序列中[16]，這些殘基也高度保守。Dlaklc[17]的研究表明這些保守的氨基酸殘基可能對(duì)催化作用更為重要。例如，His131是組氨酸殘基，可能是與DNA雙鏈的磷酸鹽發(fā)生靜電相互作用的位點(diǎn)[18]。但是在現(xiàn)階段，仍不清楚DNA在何處以及如何與酶結(jié)合。結(jié)構(gòu)域包含四層α/β三明治基序[19]，可以形成三個(gè)疏水核，而這個(gè)疏水區(qū)域主要負(fù)責(zé)DNase1的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性和剛性。保證酶穩(wěn)定性的其他因素包括分子內(nèi)氫鍵、鹽橋、兩個(gè)二硫鍵(其中半胱氨酸170至206這一片段對(duì)活性至關(guān)重要)和兩個(gè)Ca2+結(jié)合位點(diǎn)[20]。Ca2+結(jié)合位點(diǎn)的存在可保護(hù)DNase1不被蛋白酶水解，防止半胱氨酸 170和206之間二硫鍵的還原[21]，參與還原酶的重新折疊[22]，穩(wěn)定分子中的環(huán)區(qū)。DNase1活性取決于二價(jià)陽(yáng)離子的存在，沒(méi)有二價(jià)陽(yáng)離子時(shí)甚至無(wú)法檢測(cè)到DNase1活性，但是Zn2+和二價(jià)陽(yáng)離子的螯合劑除外，它們會(huì)抑制DNase1活性[23]。還有一些情況也會(huì)使DNase1活性下降：與單體G肌動(dòng)蛋白結(jié)合幾乎可以完全抑制DNase1的活性[24]；在高于80 ℃時(shí)，DNase1活性會(huì)完全喪失[25]；在pH4.5以下或pH9.5以上環(huán)境中DNase1也會(huì)喪失活性[26]。DNase1在DNase結(jié)構(gòu)域之前包含一個(gè)長(zhǎng)度為18～22個(gè)氨基酸的信號(hào)序列(N端信號(hào)肽)，該序列的功能是抑制DNase1活性[27]，并促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)轉(zhuǎn)運(yùn)[1]。

DNase1是一種分泌蛋白，當(dāng)N端信號(hào)肽被酶切后，成熟的DNase1將被轉(zhuǎn)運(yùn)至核膜并保存在酶原顆粒中[1]。當(dāng)細(xì)胞暴露于某些刺激時(shí)，DNase1從核膜中釋放出來(lái)并分泌到細(xì)胞外，參與壞死細(xì)胞的染色質(zhì)分解。有兩個(gè)機(jī)制可阻止DNase1進(jìn)入細(xì)胞核，以避免DNase1破壞正常核酸。一個(gè)是DNase1的N端信號(hào)肽可引導(dǎo)DNase1蛋白分泌至細(xì)胞外，或?qū)⑵湎拗圃趦?nèi)質(zhì)網(wǎng)、高爾基體或核膜中[28]。第二個(gè)是DNase1缺乏核定位信號(hào)，因此其無(wú)法被跨核膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)[29]。在細(xì)胞內(nèi)(包括高爾基體和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)等細(xì)胞器)和細(xì)胞外均可檢測(cè)到DNase1[1]。由于DNase1會(huì)與胞質(zhì)溶膠中G肌動(dòng)蛋白形成復(fù)合體，特異性抑制DNase1活性[30]，因此DNase1在細(xì)胞內(nèi)不發(fā)揮作用。

DNase1以Ca2+/Mg2+依賴性方式優(yōu)先切割雙鏈DNA，產(chǎn)生3’-OH/5’-P末端[26]。DNase1會(huì)優(yōu)先切割“裸”DNA(無(wú)蛋白質(zhì)的DNA)，尤其是小于150 bp的短基因片段，但是只能在體內(nèi)蛋白水解酶的幫助下切割染色質(zhì)。除此之外，DNase1傾向于將5’端切成T末端片段[31]。具體而言，在早期階段，DNase1會(huì)按照dT-dN、dN-dA和dG-dN的順序攻擊磷酸二酯鍵，但很少攻擊dC-dN鍵。在降解的后期，盡管在5’端對(duì)dA的偏好仍然存在，但在3’端對(duì)dT的偏好消失[25]。

2 人體內(nèi)DNase1的來(lái)源和分布

人胰腺中負(fù)責(zé)外分泌的胰島細(xì)胞[32]和胃腸道中的杯狀細(xì)胞[33]可以分泌DNase1到消化道中，并且胰腺來(lái)源的DNase1活性最高[34]，所以最初DNase1被認(rèn)為只是一種消化酶。DNase1在酸性環(huán)境中活性會(huì)降低甚至失活,關(guān)于DNase1如何在胃中被保存并發(fā)揮作用，目前人們提出了兩種假說(shuō)[34]：第一種認(rèn)為DNase1在經(jīng)過(guò)胃的時(shí)候通過(guò)將它的原始結(jié)構(gòu)改變成胃酸不能分解的形式而被保存下來(lái)；另一種認(rèn)為DNase1通過(guò)翻譯后糖基化而獲得酸穩(wěn)定性。Wroblewski等[35]在1950年報(bào)道DNase1也存在于人的血液中，血液中的DNase1通過(guò)核孔被動(dòng)擴(kuò)散或直接通過(guò)受損的核膜到達(dá)受損細(xì)胞，從而發(fā)揮降解DNA的功能[36]。Napirei等[37]指出血液中的DNase1主要由肝臟、甲狀腺、腦垂體和消化道(胃、十二指腸、小腸和大腸)分泌。泌尿生殖系統(tǒng)(腎臟、膀胱、附睪、腹側(cè)前列腺、副腺和卵巢)和內(nèi)分泌組織(如甲狀腺和垂體)也會(huì)分泌DNase1[24,38-40]，并且在淚腺、眼和腸系膜淋巴結(jié)中也檢測(cè)到了DNase1[37]。有研究[41]表明DNase1活性調(diào)控受到雄激素的影響，所以男性泌尿系統(tǒng)和肝臟中DNase1活性明顯高于女性。

3 DNase1與肝臟疾病

到目前為止，肝臟已被證實(shí)為是血清中DNase1的來(lái)源之一，并且肝臟DNase1活性和血清DNase1活性存在平行關(guān)系[12]。在正常情況下DNase1不能進(jìn)入細(xì)胞核，因此DNase1在肝臟和血液中均不發(fā)揮作用。但當(dāng)肝臟發(fā)生炎癥或壞死時(shí)，肝細(xì)胞破裂并釋放出DNase1，肝臟和血清DNase1活性均升高。而增多的DNase1在清除壞死肝細(xì)胞染色質(zhì)過(guò)程中發(fā)揮了重要作用，從而緩解或避免一系列由肝細(xì)胞壞死引起的肝臟疾病。目前雖然肝臟疾病與DNase1的關(guān)系還未研究透徹，但是多項(xiàng)研究[42-44]顯示DNase1活性會(huì)隨著肝臟疾病的進(jìn)展而變化，提示DNase1有可能成為肝臟疾病診斷及預(yù)后判斷的生物指標(biāo)。DNase1是體內(nèi)分解循環(huán)中多余DNA的酶之一，在疾病發(fā)展期間或許可以通過(guò)人為調(diào)節(jié)DNase1活性從而達(dá)到治療疾病的目的。

3.1肝癌肝癌是癌癥相關(guān)第二大死亡原因[45]，其中肝細(xì)胞癌占肝癌的95%。癌栓是導(dǎo)致癌癥患者非腫瘤死亡的主要原因，而中性粒細(xì)胞外陷阱(neutrophil extracellular trap,NET)是導(dǎo)致肝癌血栓形成的重要因素之一。NET是在病原微生物入侵機(jī)體時(shí)由中性粒細(xì)胞釋放的染色質(zhì)和各種酶原顆粒形成的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[46]。NET可以與紅細(xì)胞結(jié)合并充當(dāng)血栓形成的支架[47]，影響組織血供從而損害細(xì)胞[48]，具有促炎和血栓形成的作用。血清中的DNase1可消化NET的DNA骨架，從而減少癌栓的形成[48]。循環(huán)游離DNA(cf-DNA)是存在于人體血液、尿液和其他體液中的游離DNA，由極短(<200 bp)的雙鏈DNA片段組成[49]。帶負(fù)電荷的cf-DNA會(huì)形成空間位阻，因此細(xì)胞外基質(zhì)中高水平的cf-DNA可能會(huì)阻礙癌癥患者化療藥物的分布并降低藥物療效[50]。長(zhǎng)度為147 bp的cf-DNA已被證實(shí)為核小體[49]。核小體是細(xì)胞死亡的副產(chǎn)物，具有高增殖指數(shù)的浸潤(rùn)性腫瘤患者體內(nèi)核小體釋放增多。DNase1可以降解cf-DNA，降低血漿核小體水平。研究[51]表明，肝細(xì)胞癌組織中核酸內(nèi)切酶活性明顯低于正常肝組織，并且NET和cf-DNA濃度顯著增加。因此DNase1或可成為肝細(xì)胞癌化療反應(yīng)的預(yù)測(cè)因素和預(yù)后生物標(biāo)志物[52]。然而，重組DNase1是否能用于肝細(xì)胞癌的治療還需要研究證實(shí)。

3.2自身免疫性肝病自身免疫性肝病是一種由于人體免疫系統(tǒng)異常導(dǎo)致正常肝臟細(xì)胞受到攻擊的疾病。自身免疫性肝病是指包括原發(fā)性膽汁性肝硬化、自身免疫性肝炎和原發(fā)性硬化性膽管炎在內(nèi)的一系列疾病。這些肝臟疾病的病因尚不清楚，并且在臨床治療中也存在許多困難[43]。DNase1是人體組織和血清中存在的一種核酸內(nèi)切酶，其缺乏可能導(dǎo)致壞死性物質(zhì)清除不良，在炎癥和免疫耐受喪失中起重要作用。細(xì)胞異常死亡時(shí)由于DNA片段未能被及時(shí)清除，導(dǎo)致DNA片段通過(guò)循環(huán)到達(dá)肝臟，進(jìn)而觸發(fā)DNA驅(qū)動(dòng)的自身免疫反應(yīng)[53]。Gatselis等[43]研究發(fā)現(xiàn)上述3種自身免疫性肝病患者血清DNase1活性顯著低于正常人，但這3組患者血清DNase1活性無(wú)明顯差異。DNase1活性與原發(fā)性膽汁性肝硬化和自身免疫性肝炎的發(fā)病有關(guān)，而血清DNase1活性升高可能是自身免疫性肝炎完全緩解的獨(dú)立預(yù)測(cè)因子[43]。通過(guò)調(diào)節(jié)DNase1活性治療自身免疫性肝病可能是一個(gè)新的研究方向。

3.3藥物性肝損傷藥物性肝損傷病死率很高，也是臨床上急性肝功能衰竭的主要原因之一[54]。對(duì)乙酰氨基酚是一種廣泛使用的鎮(zhèn)痛藥，其過(guò)量使用可導(dǎo)致藥物性肝損傷[55]。肝臟受到毒性藥物刺激后，儲(chǔ)存在肝細(xì)胞以及肝竇內(nèi)皮細(xì)胞核和線粒體中的DNA被釋放到細(xì)胞質(zhì)中[44]。藥物再誘導(dǎo)細(xì)胞質(zhì)中的DNA以一種不依賴于壞死的機(jī)制從肝細(xì)胞釋放到肝竇微血管中，通過(guò)血液循環(huán)，在肝微循環(huán)和肝實(shí)質(zhì)中沉積[56]。細(xì)胞外沉積的DNA可導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死以及無(wú)菌性炎癥的發(fā)生[44]。肝損傷早期出現(xiàn)代謝障礙會(huì)阻礙DNase1的生成，從而促進(jìn)肝臟DNA的沉積。研究[44,57]表明，對(duì)乙酰氨基酚中毒后，DNase1可切割細(xì)胞外DNA，顯著抑制對(duì)乙酰氨基酚介導(dǎo)的肝臟炎癥和損傷。而對(duì)乙酰氨基酚給藥后血清DNase1活性會(huì)逐漸增加[57]。因此，對(duì)細(xì)胞外DNase1的識(shí)別管理可能是治療藥物誘發(fā)的肝損傷的關(guān)鍵手段之一。

3.4乙型肝炎乙型肝炎是一種常見的疾病，由于基因組HBV病毒庫(kù)的持續(xù)存在，如游離型共價(jià)閉合環(huán)狀DNA和染色體整合的HBV DNA，患者在停藥后經(jīng)常會(huì)復(fù)發(fā)，這給乙型肝炎的治療帶來(lái)了很大的困難。研究[58]發(fā)現(xiàn)DNase1存在于HBV感染者血清的HBV顆粒中；在感染早期，HBV顆粒中存在的DNase1有助于降解循環(huán)中的HBV DNA顆粒，這也是感染早期HBV DNA顆粒復(fù)制較少的原因；隨著病程進(jìn)展到肝硬化、肝癌階段時(shí)，DNase1的表達(dá)明顯上調(diào)，并且可以抑制HBV的復(fù)制。最近，Hallez等[42]發(fā)現(xiàn)DNase1可以與細(xì)胞內(nèi)HBc簇結(jié)合，從而進(jìn)入到新生的HBV衣殼中并降解HBV DNA，或可降低復(fù)發(fā)率，這為乙型肝炎的治療提供了新思路。

4 展望

DNase1是一種核酸內(nèi)切酶，主要功能是降解人體內(nèi)細(xì)胞死亡時(shí)釋放的DNA。DNase1中起主要作用的部位是DNase結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域上的保守殘基通過(guò)催化作用影響核酸內(nèi)切酶的活性。肝臟是DNase1的主要來(lái)源。目前發(fā)現(xiàn)DNase1與4種肝臟疾病有關(guān)：肝癌、自身免疫性肝病、藥物性肝損傷和乙型肝炎。已有大量研究證實(shí)在肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展過(guò)程中，DNase1發(fā)揮了阻止疾病進(jìn)展的積極作用。但是目前關(guān)于DNase1的研究主要集中在其與自身免疫性疾病的關(guān)系，而關(guān)于DNase1在肝臟疾病發(fā)病機(jī)制中具體作用的研究還太少。進(jìn)一步探索DNase1與肝臟疾病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，可為相關(guān)肝臟疾病提供新的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)。