非結(jié)核分枝桿菌的臨床檢測研究進展

潘 晴 暴芳芳 劉 紅 張福仁

山東第一醫(yī)科大學附屬皮膚病醫(yī)院(山東省皮膚病醫(yī)院，山東省皮膚病性病防治研究所)，濟南，250022

分枝桿菌是細菌中重要的一類，屬放線菌目、分枝桿菌科，主要包括結(jié)核分枝桿菌復合群(Mycobacterium tuberculosis complex, MTC)、麻風分枝桿菌(Mycobacterium leprae)和非結(jié)核分枝桿菌(non-tuberculous mycobarteria, NTM)[1,2]，其可通過多種途徑如皮膚、呼吸道、消化道等進入人體，激活細胞免疫；亦可引起局部的免疫反應(免疫細胞的聚集及相關細胞因子、趨化因子等的釋放)，形成肉芽腫。其中，非結(jié)核分枝桿菌(也稱非典型分枝桿菌)在我們周圍的環(huán)境中無處不在，包括水、土壤、動物、植物、乳制品和其他食品，目前已鑒定出180多種NTM[3]，主要包括海分枝桿菌、鳥分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、潰瘍分枝桿菌、龜分枝桿菌、膿腫分枝桿菌等。非典型分枝桿菌易引起肺部及皮膚感染，引發(fā)肺部疾病最為常見。自20世紀90年代中期以來，特別是隨著艾滋病的流行、器官移植以及免疫抑制劑應用的增多，非結(jié)核分枝桿菌感染患病率不斷上升[4,5]。結(jié)核分枝桿菌感染與NTM感染臨床表現(xiàn)相似，臨床醫(yī)生易將非結(jié)核分枝桿菌疾病誤診為結(jié)核分枝桿菌病或者真菌感染如“孢子絲菌病模式”[6,7]，采取了不當?shù)闹委熓侄危瑢颊卟∏樵斐刹涣加绊慬8]，因此，對感染菌株進行鑒定對于非結(jié)核分枝桿菌感染性疾病的診療至關重要。本文對于非結(jié)核分枝桿菌在國內(nèi)外檢測鑒定的研究現(xiàn)狀做出如下綜述。

非結(jié)核分枝桿菌一般分為2類，快生長分枝桿菌(rapid growing non-tuberculous mycobacteria，RGM)和慢生長分枝桿菌(slowly growing non-tuberculous mycobacteria，SGM),在營養(yǎng)豐富、溫度適宜的條件下培養(yǎng)，7天內(nèi)肉眼可見單個菌落者為快生長菌(RGM)，大于7天者則為慢生長菌(SGM)[9]。目前鑒定方法主要有傳統(tǒng)檢測法、PCR-核酸序列檢測法、qPCR法、PCR-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)分析法、PCR單鏈構象多態(tài)性(PCR-SSCP)法、基因芯片法、速生型非結(jié)核分枝桿菌快速MIC鑒定法、免疫學鑒定法等。

1 傳統(tǒng)檢測法

雖然，NTM感染與MTC感染臨床表現(xiàn)極為相似，但是NTM感染仍反應出特殊性，若患者合并肺部基礎疾病并伴咯血，肺高分辨CT空洞發(fā)生率高，病灶內(nèi)干酪化較少，鈣化較低，PPD試驗(結(jié)核菌素試驗)陰性，以及運用治療結(jié)核病方法效果不明顯等癥狀時，則應考慮是否為NTM感染[10]。應立即將患者痰涂片進行抗酸染色，但此方法不能區(qū)分麻風分枝桿菌、結(jié)核分枝桿菌復合群以及非結(jié)核分枝桿菌，若抗酸染色為陽性結(jié)果，應再進一步利用培養(yǎng)基進行培養(yǎng)，并分離菌株進行 PNB(對硝基苯甲酸)生長實驗，以此判斷此菌株是快速型(RGM)或緩慢型分枝桿菌(SGM)以及是否為非結(jié)核分枝桿菌，并且抗酸染色法存在陽性率不高的缺點[11-13]。Wang等[14]在培養(yǎng)基中加入500 μg/mL的PNB可選擇性抑制MTC，但是NTM菌株具有抗性，通過液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法(LC/MS/MS)對PNB的還原產(chǎn)物進行鑒定，發(fā)現(xiàn)只有NTM菌株可檢測到該產(chǎn)物，以此對MTC、NTM進行鑒別。但是，此法耗時長。

2 PCR-核酸序列檢測法

16S rRNA基因是細菌鑒定最常用的基因，然而，該基因在不同的分枝桿菌物種中具有高度相似的序列，因此無法區(qū)分密切相近的非結(jié)核分枝桿菌物種。為了克服這些局限性，最近的研究利用其他基因，如hsp65和rpoB來準確鑒定NTM,序列數(shù)據(jù)分析需利用 GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)公共數(shù)據(jù)庫[15]。

(1)普通PCR法：M. Saifi等[16]利用hsp65基因測序鑒定了48株分枝桿菌，其中包括32株NTM。Cheng等[17]從奶牛身上采集320份可見病變組織，其中11個樣本顯示典型肉芽腫病變，共培養(yǎng)得到8例菌株，對其進行3個基因(16S rRNA、hsp65和rpoB)測序以鑒別物種。Joao等[18]對22株參考菌株和54株臨床分離株利用16S rRNA、hsp65基因測序進行鑒定，鑒定率與商用試劑盒相比顯著提升。Varahram等[9]對水和土壤標本進行16s-23s rRNA和hsp65基因進行測序，344例RGM中鑒定出322例(94.4%)。

(2)巢式PCR：巢式PCR是一種先利用外部引物擴增基因組中的特異性區(qū)域，將細菌鑒定至屬、種水平，再利用內(nèi)部引物擴增基因組中的特異性區(qū)域，將細菌鑒定至種甚至亞種水平的方法[19]。李學淵等[20]利用巢式PCR檢測手部慢性肉芽腫標本37例，有22例非結(jié)核分枝桿菌陽性。林愛紅等[21]利用巢式PCR檢測公共場所中水、土壤、風管積塵和氣溶膠樣本中結(jié)核分枝桿菌和非結(jié)核分枝桿菌，并對陽性率進行分析。

(3)多重PCR：多重PCR是指在同一PCR反應體系中，同時加上多種病原微生物的特異性引物，進行PCR擴增，可用于同時檢測多種病原體。該方法具有高效、低成本、速度快等優(yōu)點，有較好的可操作性[22]。Kim等[15]分別利用這3個基因(16S rRNA、hsp65和rpoB)對109例臨床菌株測序，物種鑒別率分別為 71.30%、86.79%和81.55%，但使用多重PCR的方法可使物種鑒別率提高到97.25%。Chae等[23]對55株參考菌株和94株分枝桿菌臨床分離株進行多重PCR檢測，檢測結(jié)果與標準一致。

3 熒光定量PCR(qPCR)技術

qPCR檢測技術原理是在普通PCR反應體系中加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監(jiān)測整個PCR進程，最后通過標準曲線對未知模板進行定量分析的方法[24]。qPCR產(chǎn)物分析不用打開PCR反應管，可減少核酸實驗室污染風險，對于定性檢測是非常重要的優(yōu)點，此外該方法還具有準確度高、靈敏、特異性強和檢測快速的優(yōu)點。Lee等[25]采用實時熒光定量PCR試劑盒(Genetree Research Inc., Seoul, Korea)檢測痰標本、支氣管沖洗和培養(yǎng)標本中MTBC、NTM，敏感性可達98%以上，特異性100%。王旭洲等[26]采用熒光定量PCR技術對200例肉芽腫病變進行分枝桿菌檢測，其中100例結(jié)核分枝桿菌陽性，3例非結(jié)核分枝桿菌陽性。Rahman等[27]利用LyteStar TB/NTM qPCR試劑盒(Altona Diagnostics，德國)，分析了782例疑似結(jié)核患者的臨床標本，檢測出49例MTB、74例NTM陽性樣本。

4 PCR-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)分析法

PCR-RFLP分析法是通過PCR擴增分枝桿菌相對保守的基因片段，根據(jù)分枝桿菌保守基因組DNA片段內(nèi)的限制性酶切位點的不同，將擴增產(chǎn)物經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化切割成不同大小片段，進行瓊脂糖凝膠電泳分析。此項技術提高了目的DNA含量和相對特異性，而且方法簡便，分型時間短[28]。Davar等[29]采用PCR-RFLP技術對8166例臨床樣本進行鑒定，結(jié)果有61例為NTM。Farnia等[30]采用PCR-RFLP技術，利用hsp65基因?qū)Ψ种U菌進行分子鑒定，確診了80位NTM感染患者。LI等[31]通過PCR-RFLP技術，利用hsp65、rpoB基因?qū)Ψ中蜑橐伤讫?膿腫分枝桿菌復合群的27例臨床樣本進行鑒定，結(jié)果有18例為膿腫分枝桿菌，4例為潰瘍分枝桿菌，剩余5例為其他分枝桿菌。

5 PCR單鏈構象多態(tài)性(PCR-SSCP)分析法

PCR-SSCP是利用DNA單鏈構象具有多態(tài)性進行基因檢測的一種分析技術，該技術敏感性高、操作簡便，廣泛應用于多種基因突變的檢測和基因多態(tài)性分析，近年來，PCR-SSCP技術被大量應用于細菌、分枝桿菌等的分類分型研究中[32]。不同種的DNA單鏈其空間構象不同，在非變性PAGE電泳中的遷移率也不同，最終呈現(xiàn)不同的帶譜，從而達到菌種鑒定的目的[28]。靳曉紅等[33]通過設計兩對引物分別擴增16S rDNA兩條片段，根據(jù)SSCP電泳圖譜對98株臨床分離株進行鑒定，結(jié)果有93株為結(jié)核分枝桿菌復合群，5株非結(jié)核分枝桿菌。

6 基因芯片法

基因芯片(genechip)(又稱DNA芯片、生物芯片)的原理是雜交測序，隨著90年代以來基因芯片技術的不斷發(fā)展，該技術開始應用到分枝桿菌的檢測中。與傳統(tǒng)方法相比，基因芯片技術具有快速、結(jié)果可靠、重復性好、通量高的特點，為分枝桿菌的實驗室診斷開拓新途徑。李曉非等[34]對656例抗酸染色陽性的肺結(jié)核患者痰標本采用基因芯片法進行菌種鑒定，檢出21例NTM，與培養(yǎng)法一致。Zhu等[35]基于16S rRNA建立生物芯片檢測系統(tǒng)，對64株參考菌株、296株MTC、243株NTM、138株其他菌落、195份痰標本進行鑒定，結(jié)果與DNA測序一致率達100%。常鳳霞[36]選取324例臨床上懷疑分枝桿菌感染患者，采集其尿液、痰液及膿液標本，分別采用基因芯片法、涂片抗酸染色技術進行檢測，結(jié)果基因芯片技術陽性率9.57%，高于涂片抗酸染色技術(7.41%)。

7 速生型非結(jié)核分枝桿菌快速MIC鑒定法

RGM-NTM快速MIC鑒定法是一種采集疑似患者呼吸道分泌物(痰液、支氣管沖洗液、肺泡灌洗液等)在適當?shù)姆墙Y(jié)核分枝桿菌培養(yǎng)基中培養(yǎng)，利用其采集標本的耐藥性檢測來診斷非結(jié)核分枝桿菌及其種類的方法[37]。陳品儒等[38]采用快速生長分枝桿菌藥敏試驗液基微量稀釋 MIC 法，以添加陽離子的 MH2(Mueller- Hiuton)肉湯為培養(yǎng)基，按照結(jié)核病診斷細菌學檢驗規(guī)程對202株致病性NTM進行8種藥物敏感性測定。8種藥物包括阿米卡星(AMK)，頭孢西丁(CXT)，環(huán)丙沙星(CIP)，克拉霉素(CLA)，多西環(huán)素(DCC)，利奈唑胺(LZD)，復方磺胺甲基異惡唑(SMZCO)，妥布霉素(TOB)。結(jié)果分離鑒定出龜分枝桿菌128株，膿腫分枝桿菌56株，偶發(fā)分枝桿菌9株，龜-膿腫及龜-偶發(fā)復合群9株。 我國NTM檢出以速生型非結(jié)核分枝桿菌為主，常見菌種主要為龜-膿腫分枝桿菌復合群、偶發(fā)分枝桿菌、胞內(nèi)分枝桿菌、龜分枝桿菌等[39，40]。因此，該方法有較高的臨床診斷價值。

8 免疫學鑒定法

分枝桿菌生長過程中會分泌200多種蛋白，最具特異性的蛋白MPB64(mycobacterial protein from BCG of Rm0. 64 in electrophoresis)，是由結(jié)核分枝桿菌分泌到菌體外的，而非結(jié)核分枝桿菌則不分泌該蛋白，因此，通過檢測和鑒定 MPB64可以鑒別 MTB 和 NTM。Abe等[41]以20株結(jié)核分枝桿菌參考菌株和111株臨床分離菌株為研究對象，采用免疫色譜法(MPB64-ICA)對結(jié)核分枝桿菌復合物進行了鑒定，結(jié)果只有結(jié)核分枝桿菌呈現(xiàn)陽性，然后又對362例痰標本中抗酸桿菌陽性的108例進行鑒定，51例為結(jié)核分枝桿菌，其它為NTM。張帆等[42]對89例分枝桿菌培養(yǎng)陽性痰標本，采用膠體金法進行結(jié)核分枝桿菌MPB64抗原檢測，結(jié)果有25例檢測陰性，確診為NTM，該方法檢測NTM，敏感性為96.9%，特異性為100%。潘愛珍等[43]分別采用MPB64免疫膠體金法和傳統(tǒng)PNB/TCH法對2種分枝桿菌標準菌株和418株臨床分離株進行鑒定，與PCR測序方法相比，結(jié)果二者一致率分別為95.93%、87.08%。MPB64免疫膠體金法在分枝桿菌菌種鑒定中，特異度靈敏度較高，方法簡便、快速，適合推廣應用。

9 其他鑒定法

其它檢測方法主要有藥敏學方法、三磷酸腺苷(ATP)發(fā)光法、結(jié)核T淋巴細胞斑點試驗(T-SPOT. TB)等。藥敏學檢測非結(jié)核分枝桿菌是一種檢出率高、檢測結(jié)果較為準確的方法，其中鳥分枝桿菌利用藥敏學檢測方法檢出率高[12]。李洪敏等[44]通過新型BACTEC MGIT 960全自動快速分枝桿菌培養(yǎng)鑒定藥敏儀鑒定分枝桿菌，與培養(yǎng)法相比縮短了時間，結(jié)核分枝桿菌平均7.2天，非結(jié)核分枝桿菌最快僅需1天即可報告結(jié)果，該儀器自動化程度高、方法簡便。三磷酸腺苷生物發(fā)光法是一種經(jīng)過簡化的生物化學方法，利用ATP與熒光素-熒光素酶復合物的反應來測定是否存在三磷酸腺苷(ATP)。在PNB培養(yǎng)管中一旦有菌生長則其ATP的含量就會隨之升高，反之其ATP的含量則會降低。劉君等[45]對69例臨床菌株進行鑒定，評估ATP發(fā)光法準確率達98.6%(68/69)。T-SPOT．TB是一種γ干擾素釋放試驗(interferon-gamma release assay)，通過檢測外周血中經(jīng)結(jié)核分枝桿菌特異性抗原早期分泌靶向抗原(early secreting antigen target 6．ESAT-6，6 kD)和培養(yǎng)濾過蛋白肽段庫(culture filtrate protein 10，CFP．10，10 kD)刺激后釋放γ干擾素的T淋巴細胞，并據(jù)此結(jié)果判斷是否感染結(jié)核的技術[46]。該技術主要應用于結(jié)核分枝桿菌感染的診斷和后續(xù)監(jiān)測，而對于非結(jié)核分枝桿菌感染的意義未被充分認可。目前已有報道顯示，海分枝桿菌[46]、胞內(nèi)分枝桿菌、龜分枝桿菌、偶發(fā)分枝桿菌[47]、堪薩斯分枝桿菌、戈登分枝桿菌[48]等多種NTM可導致T-SPOT. TB陽性。

10 小結(jié)

綜上所述，NTM大多屬于條件致病菌，在周圍環(huán)境中分布范圍廣，容易感染免疫力低下的人群。近年來，NTM感染發(fā)病率增高，其危害性也越來越受到重視。NTM感染臨床特征與結(jié)核病很相似，容易造成漏檢或誤診，延誤臨床的治療，因此，NTM的檢測與鑒定尤為重要。傳統(tǒng)的檢測方法耗時長，限制了臨床應用，當前，分子生物學技術大力發(fā)展，可對非結(jié)核分枝桿菌進行快速準確地分析，在NTM菌種鑒定方面展現(xiàn)出獨特的優(yōu)勢和廣泛的應用前景，但為使檢測結(jié)果更可靠，應結(jié)合細菌學、免疫學等方法，通過多種技術同時鑒定，充分發(fā)揮各方法的優(yōu)勢，使鑒定結(jié)果更加準確，以便更好地輔助早期NTM感染疾病的臨床診療。