腦出血損傷相關(guān)分子模式研究進展

于志淵 鄭峻馬 潞李浩 游潮

根據(jù)流行病學調(diào)查資料統(tǒng)計，腦出血占世界范圍內(nèi)全部腦卒中的10%～15%，我國這一比例則高達17%～55%［1?2］，腦出血患者發(fā)病后30天的病死率約為40%，發(fā)病后180天生活自理者僅占全部腦出血患者的20%［3?4］。腦出血的損傷機制包括原發(fā)性和繼發(fā)性腦損傷，出血和占位效應(yīng)對腦組織的直接破壞稱之為原發(fā)性腦損傷［5］；出血后伴隨的炎癥反應(yīng)、血?腦屏障（BBB）破壞，以及血腫周圍水腫形成等造成的腦組織新發(fā)損傷為繼發(fā)性腦損傷，與預(yù)后不良密切相關(guān)，被認為是腦出血治療的潛在靶點［6］。腦出血后血液成分釋放進入腦組織，首先活化小膠質(zhì)細胞等中樞神經(jīng)系統(tǒng)固有免疫細胞，引發(fā)炎癥反應(yīng)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的級聯(lián)反應(yīng)，破壞血?腦屏障，導(dǎo)致外周血免疫細胞浸潤活化，進而釋放各類細胞因子、趨化因子、自由基，以及其他毒性物質(zhì)，形成免疫風暴，導(dǎo)致神經(jīng)元及其支持細胞大量死亡［7?8］。另外，腦出血后24小時，破入腦組織的紅細胞發(fā)生裂解，由其釋放的血紅蛋白、血紅素和鐵離子等細胞毒性物質(zhì)也在神經(jīng)細胞死亡中發(fā)揮重要作用［9］。神經(jīng)細胞死亡后釋放的一系列內(nèi)源性危險信號，稱為損傷相關(guān)分子模式（DAMP），后者與模式識別受體相結(jié)合，激活固有免疫反應(yīng)，誘發(fā)炎癥反應(yīng)?細胞死亡?DAMP釋放?炎癥反應(yīng)之惡性循環(huán)，此為腦出血后繼發(fā)性腦損傷的重要病理生理學機制［10］。常見的DAMP主要包括腺苷、熱休克蛋白（HSP）、白細胞介素?33（IL?33）等，而近年文獻報道的一系列研究更關(guān)注血紅素、高遷移率族蛋白1（HMGB1）、S?100B蛋白（S?100B）和過氧化物還原酶（Peroxiredoxin）等重要的DAMP在腦出血繼發(fā)性腦損傷中的作用，本文擬對此類內(nèi)源性危險信號分子的研究進展進行概述，以為進一步的基礎(chǔ)研究和臨床轉(zhuǎn)化研究提供參考。

一、血紅素

腦出血后紅細胞隨血液擴散至腦實質(zhì)，小膠質(zhì)細胞通過吞噬紅細胞而在內(nèi)源性血腫清除機制中發(fā)揮作用，該過程由CD36介導(dǎo)，受過氧化物酶體增殖物激活受體γ（PPARγ）調(diào)節(jié)，PPARγ活化可促進血腫清除并減輕腦出血后的繼發(fā)性腦損傷［11］。然而，當大量紅細胞進入腦實質(zhì)后，內(nèi)源性血腫清除機制則難以承受清除血腫的“重任”，加之腦實質(zhì)的微環(huán)境不適宜紅細胞生存，紅細胞逐漸裂解、釋放血紅蛋白，后者進一步分解、釋放游離血紅素，最終經(jīng)血紅素加氧酶降解形成游離鐵離子，游離血紅素和鐵離子均為重要的炎癥反應(yīng)誘因［12］。血紅素是目前較為關(guān)注的血紅蛋白衍生DAMP，可激活免疫細胞，上調(diào)細胞黏附分子（CAMs）和細胞因子的表達，引起急性神經(jīng)炎癥反應(yīng)［13］。一方面，血紅素以Toll樣受體4（TLR4）依賴性方式激活巨噬細胞，誘導(dǎo)促炎性因子的分泌［14］；另一方面，顯著上調(diào)小膠質(zhì)細胞TLR4和腫瘤壞死因子?α（TNF?α）等促炎性因子的表達。敲除TLR4基因或應(yīng)用TLR4抗體可抑制血紅素誘導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞活化，動物實驗顯示，腦出血后小膠質(zhì)細胞TLR4水平明顯升高，游離血紅素可使野生型小鼠促炎性因子水平和腦含水量顯著升高，加重神經(jīng)功能缺損，而TLR4基因敲除小鼠則不出現(xiàn)與之相同的炎癥反應(yīng)，表明腦出血后血紅素可通過TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路引起小膠質(zhì)細胞活化并誘導(dǎo)核因子?κB（NF?κB）活化，繼而誘發(fā)神經(jīng)炎癥反應(yīng)，在腦出血繼發(fā)性腦損傷機制中發(fā)揮重要作用［15］。血紅素具有上調(diào)星形膠質(zhì)細胞基質(zhì)金屬蛋白酶?9（MMP?9）、促炎性因子和趨化因子等炎性反應(yīng)物質(zhì)表達的作用，而敲除TLR2基因或應(yīng)用TLR2抗體則可使血紅素誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細胞活化受到抑制；與野生型小鼠相比較，外源性血紅素并未誘發(fā)TLR2基因敲除小鼠產(chǎn)生急性神經(jīng)炎癥反應(yīng)，而且其血?腦屏障破壞和中性粒細胞浸潤程度明顯較輕，IL?1β、IL?6和TNF?α等促炎性因子水平顯著降低，神經(jīng)功能缺損程度輕微，提示腦出血后血紅素所引起的繼發(fā)性腦損傷需依賴TLR2蛋白的表達［16］。上述研究結(jié)果表明，血紅素可根據(jù)不同細胞類型，采用不同模式識別受體，激活固有免疫反應(yīng)，如通過TLR4蛋白激活小膠質(zhì)細胞和巨噬細胞，通過TLR2蛋白激活星形膠質(zhì)細胞。

二、高遷移率族蛋白1

HMGB1是一種普遍存在于哺乳動物且含量豐富的非組蛋白DNA結(jié)合蛋白，腦出血后血腫周圍神經(jīng)細胞受損，HMGB1自細胞核釋放至細胞外，成為重要的DAMP［17?18］。Zhou等［19］的研究顯示，腦出血患者血清HMGB1水平顯著高于正常對照者；該作者于腦出血小鼠模型亦觀察到同樣的結(jié)果，即血腫周圍組織HMGB1水平顯著升高，并于出血后72小時達峰值，出血后5天表達水平逐漸下降。有研究顯示，腦出血患者血清HMGB1表達變化與血腫量、美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表（NIHSS）評分、IL?6和TNF?α表達水平相關(guān)［19?20］，且為神經(jīng)功能預(yù)后不良的重要影響因素，其受試者工作特征（ROC）曲線下 面 積（AUC）為0.718（95%CI：0.603～0.831，P=0.001）［20］。下調(diào)HMGB1表達可減輕腦出血繼發(fā)性腦損傷，HMGB1抑制劑丙酮酸乙酯可減弱小膠質(zhì)細胞活化、抑制神經(jīng)元凋亡、緩解腦水腫和神經(jīng)功能缺損程度［21］；HMGB1單克隆抗體具有抑制HMGB1釋放、降低血清HMGB1表達水平、抑制小膠質(zhì)細胞活化、緩解氧化應(yīng)激反應(yīng)和減輕腦水腫的作用［18］。動物實驗結(jié)果亦提示，HMGB1抑制劑甘草甜素可逆轉(zhuǎn)HMGB1激活固有免疫反應(yīng)的作用，抑制神經(jīng)元凋亡、減輕腦水腫和腦損傷程度、改善大鼠行為異常［22］；HMGB1抑制劑或晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）阻斷劑可減少急性期腦出血大鼠模型血腫周圍炎性細胞浸潤、下調(diào)促炎性因子表達、緩解腦水腫、改善神經(jīng)功能［23］；而上調(diào)腦出血大鼠模型微小RNA?129?5p（miRNA?129?5p）表達則能夠有效抑制腦出血后HMGB1?RAGE信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)蛋白的 表 達［24］。上 述 研究 表 明，HMGB1?RAGE信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路可能參與腦出血急性期損傷機制。此外，亦有研究顯示，HMGB1在腦出血恢復(fù)期具有促進血管生 成 和 神 經(jīng) 修 復(fù) 作 用［25?27］，今 后 尚 待 進 一 步 探 究HMGB1在腦出血不同階段的作用。

三、S?100B蛋白

S?100B蛋白是一種通過星形膠質(zhì)細胞表達和釋放的腦組織特異性鈣結(jié)合蛋白（CaBP），為RAGE之配體，二者相互作用在腦出血損傷機制中發(fā)揮重要作用［28］。腦出血后S?100B自受損的細胞質(zhì)快速釋放進入血液［29］，活化星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞，產(chǎn)生促炎性因子和活性氧（ROS），可進一步加重腦出血的繼發(fā)性腦損傷［30］。對Ⅳ型膠原酶構(gòu)建的腦出血大鼠模型觀察發(fā)現(xiàn)，腦出血后6小時大鼠血清S?100B水平即達峰值［31］。臨床研究顯示，腦出血患者發(fā)病6小時內(nèi)血清S?100B水平升高，24小時內(nèi)達峰值，第2天進入平臺期，此后逐漸下降［32］；腦出血患者血清S?100B水平不僅高于正常對照者且可持續(xù)至發(fā)病后第7天［32?33］，且血清與腦脊液S?100B水平呈顯著正相關(guān)，均高于正常對照者［34］。研究顯示，腦出血患者血清S?100B水平明顯高于缺血性卒中患者，據(jù)此可對二者進行鑒別［29，35］。動物實驗結(jié)果顯示，腦出血大鼠模型血清S?100B水平與血腫量（r=0.37，P＜0.05）和血腫周圍水腫程度（r=0.48，P＜0.01）呈正相關(guān)［31］；臨床研究顯示，腦出血患者血清S?100B水平與Glasgow昏迷量表（GCS）評分呈負相關(guān)（r=?0.45，P=0.004），與血腫量（r=0.45，P＜0.0001）和血腫周圍水腫程度（r=0.27，P=0.033）呈正 相 關(guān)［32?33，35］。通過 血 清S?100B變 化，尚 可 判 斷 腦出血患者預(yù)后：血清S?100B水平升高為發(fā)病后1周病死率上升的預(yù)測因素（OR=1.046，95%CI：1.014～1.078；P=0.004）［32］；血清S?100B水平較高者大多預(yù)示早期神經(jīng)功能惡化（P=0.001）和預(yù)后不良（P=0.003）［33］；另外，腦出血24小時內(nèi)的血清S?100B水平被認為是出院時神經(jīng)功能預(yù)后的預(yù)測因素（OR=1.02，95%CI：1.003～1.039；P=0.02）［36］；經(jīng) 研 究 表明，S?100B水平預(yù)測神經(jīng)功能預(yù)后不良的靈敏度可達100%、特異 度 為76.2%［35］。Ferrete?Araujo等［37］對36例腦出血患者進行前瞻性觀察發(fā)現(xiàn)，最終死亡13例、生存23例，而死亡患者入院時、發(fā)病后24和48小時血清S?100B水平均高于生存患者；生存患者神經(jīng)功能預(yù)后良好者11例、預(yù)后不良12例，預(yù)后不良患者發(fā)病后24、48和72小時血清S?100B水平均高于預(yù)后良好患者，提示血清S?100B是腦出血患者病死和神經(jīng)功能預(yù)后不良的早期預(yù)測指標。因此Ferrete?Araujo認為，血清S?100B可以成為腦出血治療的可行靶點，目前此類研究尚處于動物實驗階段。動物實驗顯示，應(yīng)用Arundic acid抑制星形膠質(zhì)細胞合成S?100B，可降低腦出血大鼠模型中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)S?100B的表達，以及抑制星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞活化，減少促炎性因子釋放和活性氧生成，減少神經(jīng)元凋亡，緩解腦出血引起的神經(jīng)功能缺損和腦損傷［30，38］；電針和涼血通瘀方劑等中藥治 療亦可降 低血清S?100B水平［39?40］。S?100B在腦出血中的作用和相關(guān)機制尚待進一步研究。

四、過氧化物還原酶

Peroxiredoxin是一類氧化應(yīng)激誘導(dǎo)型過氧化物酶，在哺乳動物細胞中可分為Peroxiredoxin1～6（Prx1～6）共6種亞型，具有氧化還原活性，可以調(diào)節(jié)氧化應(yīng)激相關(guān)細胞凋亡，發(fā)揮神經(jīng)保護作用［41］。（1）Prx1：是Peroxiredoxin中的主要出血應(yīng)激誘導(dǎo)型亞型［42］。其主要表達于腦出血大鼠模型的星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞，于紋狀體注射腺病毒使其過表達，可使炎癥反應(yīng)減輕并抑制細胞凋亡［43］；注射丹紅注射液可上調(diào)腦出血大鼠模型星形膠質(zhì)細胞Prx1的表達，下調(diào)TNF?α和IL?1β等促炎性因子的表達水平，以減輕腦出血后神經(jīng)炎癥反應(yīng)［44］。亦有研究顯示，Peroxiredoxin釋放至細胞外即失去抗氧化能力，其可激活TLR2/4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，從而加重神 經(jīng) 炎 癥 反 應(yīng)［45?46］。外 源 性Prx1具 有 激 活RAW264.7細胞TLR4/NF?κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用，并分泌TNF?α和IL?6等促炎性因子。腦出血72小時內(nèi)Prx1表達水平升高，并由凋亡細胞釋放至細胞外，激活TLR4/NF?κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，使神經(jīng)炎癥損傷進一步加重［47］；而蒿本內(nèi)酯及其衍生物則可降低腦出血后Prx1的表達和釋放，抑制TLR4/NF?κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活，減少免疫細胞活化和促炎性因子的分泌，從而改善腦出血后的神經(jīng)功能缺損［48］。上述研究表明，腦出血后細胞內(nèi)Prx1產(chǎn)生正向有益作用，而細胞外Prx1介導(dǎo)的TLR4/NF?κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活可在繼發(fā)性腦損傷機制中發(fā)揮重要作用。（2）Prx2：在紅細胞內(nèi)表達豐富。于腦出血大鼠模型尾狀核注射裂解紅細胞可使其腦組織Prx2表達升高，引起腦水腫、血?腦屏障破壞、中性粒細胞浸潤、小膠質(zhì)細胞活化、神經(jīng)元死亡和神經(jīng)功能缺損，而Prx2抑 制劑Conoidin A則可緩解 上 述損傷［49］。腦 出血后，注射Lipocalin?2可促進腦出血小鼠模型Prx2相關(guān)中性粒細胞浸潤、小膠質(zhì)細胞/巨噬細胞活化、神經(jīng)元凋亡，進而繼發(fā)腦水腫和神經(jīng)功能缺損，而敲除或敲低Lipocalin?2則Prx2相關(guān)性腦損傷程度明顯減輕［50］。目前，尚無Prx3～6在腦出血后 繼發(fā)性腦損傷機制中作用的報道，因此，Peroxiredoxin在腦出血后繼發(fā)性腦損傷中的作用及機制尚待進一步研究。

五、其他

除上述4種重要DAMP外，還有其他常見DAMP，如HSP、腺苷、IL?33等內(nèi)源性危險信號分子，近年也有研究探討其在腦出血后繼發(fā)性腦損傷中的作用。（1）HSP：是一類進化上相對保守的分子伴侶家族，通過調(diào)節(jié)應(yīng)激反應(yīng)參與腦出血的病理生理學機制［51］。HSP70家族是常見的HSP，采用格爾德霉素上調(diào)HSP70表達可以減輕腦出血小鼠模型的神經(jīng)炎癥反應(yīng)，降低血?腦屏障損傷，改善其神經(jīng)功能［52］。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白75（GRP75）是HSP70家族成員，誘導(dǎo)腦出血大鼠模型過表達GRP75可以降低促炎性因子的分泌，抑制炎癥反應(yīng)，減少神經(jīng)元凋亡，具有神經(jīng)保護作用［53］。HSP32亦稱為血紅素加氧酶?1（HO?1），其在腦出血繼發(fā)性腦損傷中的作用仍存爭議［54］。動物實驗顯示，通過miRNA?183?5p抑制HO?1表達可減輕腦出血小鼠模型氧化應(yīng)激和神經(jīng)炎癥反應(yīng)，從而改善其神經(jīng)功能［55］?；谀X出血大鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)，HO?1可通過調(diào)節(jié)磷脂酰肌醇3?激酶（PI3K）/絲氨酸/蘇氨酸激酶（AKT）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路發(fā)揮神經(jīng)保護作用［56］。在腦出血小鼠模型發(fā)病早期，HO?1可加重神經(jīng)炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進細胞死亡和腦白質(zhì)損害；至疾病后期，HO?1則促進血腫吸收和血管生成，有利于神經(jīng)功能的恢復(fù)［57］。上述結(jié)果提示，HO?1在腦出血病理生理學機制中的作用較為復(fù)雜，尚待更多研究深入探討。（2）ATP：腦組織富含ATP，是一類常見的DAMP［58］。腦出血后受損傷的神經(jīng)細胞釋放ATP，激活嘌呤能P2X7受體并產(chǎn)生信號級聯(lián)反應(yīng)，最終導(dǎo)致促炎性因子釋放和細胞死亡［59］。基于腦出血小鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，P2X7受體水平于腦出血后24小時達到峰值，且主要表達于神經(jīng)元，P2X7受體激活后可通過細胞外信號調(diào)節(jié)激酶1/2（ERK1/2）/NF?κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路加重氧化應(yīng)激反應(yīng)［60］；抑制P2X7受體可通過絲裂原激活蛋白激酶（MAPK）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路限制腦出血大鼠模型繼發(fā)性腦損傷的進展［61］；牛磺酸具有抑制P2X7受體作用，可緩解腦出血大鼠模型神經(jīng)炎癥反應(yīng)，減少神經(jīng)元凋亡和腦白質(zhì)損傷［62］。上述研究結(jié)果表明，ATP相關(guān)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路有可能是腦出血的潛在治療靶點。（3）IL?33：屬于IL?1家族成員，可結(jié)合其膜受體腫瘤抑制素2（ST2），激活免疫細胞［63］?；谀X出血小鼠模型的研究顯示，IL?33可以減輕腦出血后炎癥反應(yīng)、細胞凋亡與自噬，緩解腦水腫，具有神經(jīng)保護作用［64］。Chen等［65］發(fā)現(xiàn)，IL?33能夠促進腦出血大鼠模型小膠質(zhì)細胞由促炎癥型向抑炎癥型轉(zhuǎn)變，減輕神經(jīng)元損傷和腦白質(zhì)損傷，改善神經(jīng)功能。

綜上所述，DAMP功能多樣化，與細胞類型密切相關(guān)，在腦出血后不同階段可能發(fā)揮不同作用。因此，未來研究有必要進一步深入探討不同類型DAMP在不同階段對不同細胞的作用，同時也有必要開發(fā)針對DAMP的治療策略，以改善腦出血患者預(yù)后。

利益沖突無