小膠質(zhì)細胞在腦出血病理生理學機制中的研究進展

符巍馬 潞譚贏 游潮

腦出血是腦卒中的常見類型，約占全部腦卒中的15%［1?2］。流行病學數(shù)據(jù)顯示，全球每年新增腦出血病例超過100萬例，隨著人口老齡化的加劇，預(yù)計病例數(shù)仍會繼續(xù)增加［3］。盡管以外科手術(shù)和支持治療為主要手段的治療方案日臻成熟，但大多數(shù)腦出血患者仍最終殘疾甚至死亡［4］。腦出血初期，原發(fā)性腦損傷所致血腫壓迫和出血灶周圍組織水腫形成占位效應(yīng)和顱內(nèi)高壓，導(dǎo)致腦疝形成和死亡；之后小膠質(zhì)細胞激活，誘導(dǎo)分泌多種促炎性因子、促進氧化應(yīng)激和細胞毒性級聯(lián)反應(yīng)，神經(jīng)細胞發(fā)生功能損傷和死亡，最終引起繼發(fā)性腦損傷［5］。小膠質(zhì)細胞是關(guān)鍵的先天性免疫細胞，是在各種急性腦損傷的病理生理學機制中最先做出反應(yīng)的非神經(jīng)元［6］，活化后可分泌趨化因子、細胞因子、前列腺素及其他免疫調(diào)節(jié)分子［7］，這些分子在繼發(fā)性腦損傷和腦修復(fù)過程中發(fā)揮重要作用。動物實驗顯示，采用包含骨髓來源的單核細胞或巨噬細胞的細胞療法可有效緩解缺血性卒中模型大鼠腦損傷程度、改善預(yù)后［8］。因此，筆者認為小膠質(zhì)細胞的激活過程和免疫功能，以及與其他細胞之間的相互作用在腦出血的病理生理學機制中發(fā)揮至關(guān)重要的作用。腦出血后的神經(jīng)炎癥反應(yīng)可以引起繼發(fā)性腦損傷，如果在調(diào)控小膠質(zhì)細胞表型轉(zhuǎn)變、促進血腫吸收的同時抑制炎性因子釋放，可以減輕繼發(fā)性腦損傷，修復(fù)腦白質(zhì)之完整性，促進神經(jīng)功能修復(fù)。目前國外已公布的大型隨機對照臨床試驗并未顯示出積極的開顱血腫清除術(shù)可以改善預(yù)后，因此腦出血治療仍需從清除血腫的內(nèi)源性機制著手［9］。本文擬對腦出血后小膠質(zhì)細胞功能改變的研究進展進行概述，尤其關(guān)注小膠質(zhì)細胞的激活、極化、增殖、分泌和吞噬等作用，并總結(jié)小膠質(zhì)細胞表型轉(zhuǎn)變，以及以表型轉(zhuǎn)變?yōu)榘悬c的包括免疫調(diào)節(jié)劑在內(nèi)的各種調(diào)控小膠質(zhì)細胞的藥物、小膠質(zhì)細胞與其他神經(jīng)細胞之間的相互作用，重新思考腦出血的治療方向。

一、小膠質(zhì)細胞表型

小膠質(zhì)細胞是特異性存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫細胞［10］，活化小膠質(zhì)細胞在不同病程階段可以轉(zhuǎn)變?yōu)镸1型（促炎型）或M2型（修復(fù)型）兩種表型，這一動態(tài)變化過程稱之為極化。M1型小膠質(zhì)細胞可分泌多種促炎性因子和趨化因子，引起神經(jīng)炎癥反應(yīng)，誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡；M2型小膠質(zhì)細胞主要是吞噬和清除病原體，修復(fù)組織細胞。在急性腦損傷過程中，小膠質(zhì)細胞可動態(tài)、瞬時改變其表型，活化的小膠質(zhì)細胞可在脊髓損傷、缺血性卒中和顱腦創(chuàng)傷病程中介導(dǎo)神經(jīng)組織損傷和修復(fù)。動物實驗結(jié)果顯示，顱腦創(chuàng)傷和缺血性卒中動物模型中小膠質(zhì)細胞可由M2型向M1型轉(zhuǎn)變，而在癲動物模型中則M1型 和M2型 共 表 達［11］。近 年 關(guān) 于M1型 和M2型小膠質(zhì)細胞極化的傳統(tǒng)概念引起爭議：Casella等［12］對實驗性自身免疫性腦脊髓炎（EAE）小鼠模型的觀察發(fā)現(xiàn)，經(jīng)典的M1型標志物白細胞介素?6（IL?6）可被IL?4誘導(dǎo)并發(fā)揮抗炎癥反應(yīng)作用；Kim等［13］在顱腦創(chuàng)傷小鼠模型中觀察到M1型和M2型經(jīng)典標志物IL?1β和精氨酸酶1（Arg1）、腫瘤壞死因子（TNF）和甘露糖受體C1樣蛋白1（Mrc1）高度共表達于同一細胞。因此，目前尚無法確定小膠質(zhì)細胞究竟是發(fā)生M1型極化還是M2型極化。基于上述結(jié)果，有學者提出小膠質(zhì)細胞表型“二分法”過于簡單，不足以闡明小膠質(zhì)細胞的多種生物學功能［14］，但迄今尚未發(fā)現(xiàn)更多有力的實驗證據(jù)支持更多的分類。因此，筆者認為進行腦出血動物模型研究時，應(yīng)從疾病病程的多個時間點探索小膠質(zhì)細胞的吞噬和血腫清除率等功能。

1.M1型小膠質(zhì)細胞小膠質(zhì)細胞極化為M1型可誘導(dǎo)各種炎性因子的產(chǎn)生，炎性因子在分子水平的改變可反映腦出血后小膠質(zhì)細胞生物學功能的變化。對腦出血患者的腦組織進行免疫組化染色或流式細胞術(shù)分析，可鑒別小膠質(zhì)細胞表面標志物，包 括Iba1、CD11b、CD68和F4/80等［15?18］。正 常腦組織中CD11b僅由小膠質(zhì)細胞表達，而腦出血患者受損腦組織中的中性粒細胞和單核細胞亦表達該蛋白，故僅根據(jù)CD11b無法區(qū)分小膠質(zhì)細胞與中性粒細胞和單核細胞，通過流式細胞術(shù)檢測CD45表達量可對二者進行區(qū)分，CD45IntCD11b+為小膠質(zhì)細 胞、CD45HighCD11b+為巨 噬 細 胞［19?20］。腦 出 血 后，由M1型小膠質(zhì)細胞誘導(dǎo)的炎性因子表達變化顯著，對Ⅳ型膠原酶和自體血誘導(dǎo)的腦出血大鼠模型觀察可見，血清IL?1β、IL?6、TNF和誘導(dǎo)型一氧化氮合酶（iNOS）等炎性因子mRNA在急性期升高，相應(yīng)蛋白質(zhì)的表達變化也遵循相似的病程節(jié)點［21?23］。動物實驗結(jié)果顯示，嚙齒類動物腦出血3天內(nèi)腦組織IL?1β、IL?6和TNF水平升高，第4天開始逐步下降，至第7天恢復(fù)至正常水平；與上述促炎性因子不同，血清干擾素?γ（IFN?γ）在腦出血3天內(nèi)無明顯變化，但在腦出血后期（第7天）顯著升高［24?25］。盡管不同的腦出血動物模型和評估時間表達的特異性炎性因子水平不盡一致，但上述經(jīng)典的M1型標志物在急性期的總體變化與腦出血患者保持一致。至腦出血慢性期（發(fā)病后14天），大多數(shù)炎性因子的表達已恢復(fù)至正常水平［25］，但是上述炎性因子在腦出血慢性期是否發(fā)生變化，以及這些變化是否影響神經(jīng)功能的恢復(fù)，目前尚難以確定。

2.M2型小膠質(zhì)細胞與M1型小膠質(zhì)細胞已取得的研究成果不同，目前關(guān)于M2型小膠質(zhì)細胞的研究較少。已知M2型在缺血性卒中、多發(fā)性硬化和癲等多種中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病中發(fā)揮重要的吞噬作用和毒物清除作用［26?28］。IL?10是M2型小膠質(zhì)細胞分泌的抗炎性因子，除具有增強小膠質(zhì)細胞吞噬作用外，還可誘導(dǎo)巨噬細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（STAT3）抑制促炎性因子的產(chǎn)生［29］。研究顯示，腦出血患者血液和腦組織IL?10水平升高，且與再次出血有關(guān)，但具體機制尚不明確［30?32］。在Ⅳ型膠原酶誘導(dǎo)的腦出血C57BL/6小鼠模型中，大多數(shù)M2型小膠質(zhì)細胞標志物IL?10、Arg1、Ym1和CD206 mRNA于腦出血后1天表達上調(diào)，而轉(zhuǎn)化生長因子（TGF）以及IL?4 mRNA和蛋白于腦出血后3天表達顯著升高；但在自體血誘導(dǎo)的腦出血小鼠模型中，血腫周圍腦組織始終檢測不到IL?4，IL?10在腦出血2周內(nèi)亦無明顯改變，而TGF?β在腦出血第1～10天表達上調(diào)并持續(xù)至第14天，這一時期向腦組織定向注射TGF?β可以抑制小膠質(zhì)細胞IL?6的表達，進而改善小鼠行為異常［25］。臨床實踐中，腦出血患者發(fā)病3天內(nèi)血漿TGF?β水平升高與發(fā)病后90天神經(jīng)功能預(yù)后改善相關(guān)，M2型小膠質(zhì)細胞標志物CD163亦表達上調(diào)［25］。基于上述基礎(chǔ)與臨床研究結(jié)果，推測TGF?β和CD163有可能是腦出血的潛在治療靶點。對自體血誘導(dǎo)的腦出血小鼠模型的觀察顯示，發(fā)病第1天CD206和Ym1表達即升高［33］，而Ⅳ型膠原酶誘導(dǎo)的腦出血大鼠模型則于發(fā)病第2和3天Ym1表達才升高［34］。目前，關(guān)于M2型小膠質(zhì)細胞標志物在膠原酶誘導(dǎo)的腦出血模型中的動態(tài)變化研究較少，現(xiàn)有數(shù)據(jù)僅顯示M1型標志物在腦出血后3～6小時表達升高，M2型標志物較M1型表達升高晚1天且持續(xù)時間更短。由于Ⅳ型膠原酶和自體血這兩種建模方式存在諸多差異，即使相同的實驗條件下兩種模型得出的研究結(jié)果亦有許多不一致之處。因此建議，在有條件的情況下同時開展兩種建模方式，以便更準確、全面地評估M1型和M2型標志物與預(yù)后的關(guān)系。

3.M1型與M2型小膠質(zhì)細胞之間的轉(zhuǎn)變目前對腦出血后小膠質(zhì)細胞兩種表型的動態(tài)轉(zhuǎn)變知之甚少。研究顯示，M1型和M2型標志物在腦出血模型中的表達隨時間變化，在Ⅳ型膠原酶誘導(dǎo)的腦出血小鼠模型中發(fā)病3天內(nèi)即出現(xiàn)小膠質(zhì)細胞表型轉(zhuǎn)變，自體血誘導(dǎo)的腦出血大鼠模型發(fā)病1周內(nèi)方出現(xiàn)小膠質(zhì)細胞表型的轉(zhuǎn)變，即發(fā)病3天內(nèi)小膠質(zhì)細胞主要向M1型極化，再緩慢向M2型極化，故小膠質(zhì)細胞向M1型極化后誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥反應(yīng)是急性期繼發(fā)性腦損傷的重要機制，隨后向M2型極化是神經(jīng)功能恢復(fù)的關(guān)鍵因素；而且M2型標志物在老齡動物模型中的表達變化與腦出血神經(jīng)功能預(yù)后密切相關(guān)［35］。然而，目前關(guān)于M2型標志物的相關(guān)研究較少，尚無法確定其在腦出血亞急性期和慢性期的具體作用機制，鑒于某些M2型標志物和細胞因子對小膠質(zhì)細胞和巨噬細胞的作用呈非特異性，因此建議采用多次免疫熒光染色檢測這兩種細胞的特異性標志物。

二、小膠質(zhì)細胞在血腫清除中的作用

小膠質(zhì)細胞具有強大的吞噬能力，可在病理條件下吞噬并清除中樞神經(jīng)系統(tǒng)β?淀粉樣蛋白（Aβ）、神經(jīng)原纖維纏結(jié)（NFTs）以及凋亡致裂解的神經(jīng)元和神經(jīng)突觸碎片，同時也是血腫清除過程中的重要細胞，CD36、CD47和CD163可能參與小膠質(zhì)細胞吞噬血腫的過程［35?36］。（1）CD36：動物實驗和臨床研究均顯示，腦組織CD36表達上調(diào)可促進血腫吸收［37］。CD36是過氧化物酶增殖物激活受體（PPAR）介導(dǎo)的下游基因轉(zhuǎn)錄關(guān)鍵靶點，PPARγ激活可誘導(dǎo)CD36表達上調(diào)，進而強化小膠質(zhì)細胞吞噬血腫的能力，而小膠質(zhì)細胞和單核細胞Toll樣受體4（TLR4）信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路則下調(diào)CD36的表達［38］。動物實驗顯示，TLR4缺陷型小鼠血腫周圍區(qū)域可觀察到較少的活化小膠質(zhì)細胞和較高水平的CD36和CX3C趨化因子配體1（CX3CL1）；自體血誘導(dǎo)的腦出血CD36-/-小鼠IL?1β和TNF mRNA表達高于野生型小鼠，該模型小鼠小膠質(zhì)細胞在體外吞噬紅細胞的能力降低，但IL?10水平升高［38］。因此認為，CD36表達缺失可導(dǎo)致TLR4表達上調(diào)，TLR4信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游的小膠質(zhì)細胞通過下調(diào)CD36的表達和促進IL?10的生成而減弱小膠質(zhì)細胞的吞噬作用并減慢血腫的吸收。（2）CD47：目前關(guān)于CD47與小膠質(zhì)細胞相關(guān)性的研究相對較少。Ni等［39］采用自體血誘導(dǎo)腦出血野生型小鼠或CD47-/-小鼠模型，發(fā)現(xiàn)予以CD47治療的小鼠血紅素加氧酶?1（HO?1）降解速率增加，并以M2型極化方式加速血腫清除。（3）CD163：血紅蛋白清除劑受體CD163在血腫清除過程中具有潛在作用［40?41］。在自體血誘導(dǎo)的腦出血大鼠模型中，血腫消退的同時CD163表達升高，表明能夠調(diào)節(jié)小膠質(zhì)細胞吞噬作用的蛋白質(zhì)可以促進血腫吸收［41］。由此可見，探尋能夠調(diào)控小膠質(zhì)細胞極化和吞噬作用，并清除血腫的新靶點有可能引領(lǐng)腦出血治療的發(fā)展。

三、小膠質(zhì)細胞與其他神經(jīng)細胞之間的相互作用

1.神經(jīng)元CX3CL1/CX3CR1信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在中樞神經(jīng)系統(tǒng)可激活小膠質(zhì)細胞并介導(dǎo)其與神經(jīng)元之間的相互作用［42?44］。綠色熒光蛋白（GFP）標記的CX3CR1小鼠模型被廣泛用于小膠質(zhì)細胞激活和功能研究［45?46］，缺血性卒中小鼠模型顯示，神經(jīng)元釋放CX3CL1，并通過CX3CR1參與小膠質(zhì)細胞激活，而CX3CL1敲除小鼠對缺血?再灌注損傷的敏感性顯著降低［47］；自體血誘導(dǎo)腦出血小鼠模型顯示，TLR4敲除小鼠CX3CL1和CD36 mRNA表達均高于野生型小鼠，而單核細胞特異性CX3CR1缺陷小鼠神經(jīng)功能有所改善，表明腦出血后神經(jīng)元分泌的CX3CL1參與小膠質(zhì)細胞的吞噬作用和神經(jīng)功能恢復(fù)［48］。由 此 可 見，腦出血后CX3CL1與CX3CR1結(jié)合可誘發(fā)神經(jīng)元與小膠質(zhì)細胞之間的反應(yīng)，并參與小膠質(zhì)細胞表型的轉(zhuǎn)變。

2.星形膠質(zhì)細胞星形膠質(zhì)細胞可以分泌多種調(diào)控小膠質(zhì)細胞激活和極化的趨化因子，包括CXC趨化因子配體1（CXCL1）、CXCL2、CC趨化因子配體20（CCL20）、CCR1和CCR2等，這些趨化因子在腦出血患者的血腫周圍組織中呈高表達，表明其在腦出血的病理生理學機制中具有潛在作用［49］。在自體血誘導(dǎo)的腦出血大鼠模型中，紋狀體和大腦皮質(zhì)CXCL2水平于建模第1天即顯著升高［50］；在Ⅳ型膠原酶誘導(dǎo)的腦出血小鼠模型中，抑制CCL2或CCR2表達可調(diào)控小膠質(zhì)細胞激活并下調(diào)iNOS的表達，從而促進血腫吸收并且改善神經(jīng)功能［51］；而在自體血誘導(dǎo)腦出血的CCR2-/-小鼠模型中，則可見較少的M1型小膠質(zhì)細胞激活和早期運動功能改善［52］。動物實驗顯示，IL?15作為星形膠質(zhì)細胞與小膠質(zhì)細胞之間的相互作用因子，可加劇腦出血后繼發(fā)性腦損傷［53］。由此可見，深入探究小膠質(zhì)細胞極化、吞噬作用和星形膠質(zhì)細胞的其他功能有助于提高對腦出血病理生理學機制的理解。

3.少突膠質(zhì)細胞腦出血后小膠質(zhì)細胞極化與少突膠質(zhì)細胞功能之間的相互作用目前尚未闡明。Ⅳ型膠原酶誘導(dǎo)的腦出血小鼠模型發(fā)病2周內(nèi)可見血腫周圍白質(zhì)少突膠質(zhì)細胞前體細胞和成熟少突膠質(zhì)細胞的增殖和分化，但具體機制尚不清楚［54］。多發(fā)性硬化動物模型顯示，M2型小膠質(zhì)細胞在髓鞘再生期間可促進少突膠質(zhì)細胞增殖和分化，可能與神經(jīng)功能恢復(fù)有關(guān)［55］。動物實驗顯示，超聲引導(dǎo)下全血注射誘導(dǎo)腦出血后，少突膠質(zhì)細胞可分泌觸珠蛋白，并在24小時內(nèi)發(fā)揮神經(jīng)細胞（包括神經(jīng)元、星形膠質(zhì)細胞和小膠質(zhì)細胞）保護作用，使其免受血紅蛋白裂解后產(chǎn)生的氯化血紅素和鐵離子引起的毒性作用［56］。未來有待更多基礎(chǔ)與臨床研究拓寬小膠質(zhì)細胞與少突膠質(zhì)細胞之間相互作用的認知。

四、小結(jié)

小膠質(zhì)細胞在腦出血病程中發(fā)揮重要作用，其激活程度、表型極化、血腫清除機制及其與神經(jīng)細胞之間的相互作用是目前腦出血研究的熱點。盡管目前關(guān)于腦出血后小膠質(zhì)細胞極化的諸多機制尚不十分明確，但一些實驗性藥物已經(jīng)證明可以通過抑制M1型極化或增強M2型極化，達到減輕繼發(fā)性腦損傷、促進神經(jīng)功能恢復(fù)的效果。如何在恰當?shù)臅r間節(jié)點既可抑制M1型小膠質(zhì)細胞激活、減少各種炎性因子分泌，又可促進M2型小膠質(zhì)細胞激活、最大程度加速血腫清除，從而抑制神經(jīng)炎癥反應(yīng)、保護神經(jīng)功能，尚待更多基礎(chǔ)與臨床研究的驗證。由此可見，在探索腦出血治療藥物的道路上，特異性存在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的小膠質(zhì)細胞依然具有巨大的研究價值和應(yīng)用前景。

利益沖突無