外泌體在影響肝細(xì)胞癌免疫反應(yīng)中所起的雙重作用

周秋君 魏申譽(yù) 柴世牽 曹毅 陶茂燦

肝細(xì)胞癌占原發(fā)性肝癌的75%以上，是全球癌癥相關(guān)的第4大死因，由于肝癌具有較高的隱匿性以及缺乏可靠的早期診斷指標(biāo)，大多數(shù)肝癌患者在首次確診時(shí)已經(jīng)處于晚期因而難以進(jìn)行有效的根治性治療，往往只能依靠于姑息性的藥物治療，而一線藥物例如多激酶抑制劑索拉菲尼或侖伐替尼也僅能延長(zhǎng)晚期肝癌患者3個(gè)月左右的生存期[1]。近年來(lái)，由于免疫治療在黑色素瘤、非小細(xì)胞肺癌等癌癥中的成功應(yīng)用而備受關(guān)注。然而由于肝臟所固有的低免疫源性，導(dǎo)致肝癌在發(fā)生、發(fā)展中形成了免疫抑制性的腫瘤微環(huán)境，造成了較低的免疫治療陽(yáng)性反應(yīng)率[2]。隨著研究的深入，外泌體在肝癌中作為腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞間交流的一種重要方式而逐漸被人們認(rèn)知，其在免疫抑制性信號(hào)傳導(dǎo)、促進(jìn)腫瘤微環(huán)境的形成以及促進(jìn)腫瘤細(xì)胞免疫逃逸的過(guò)程中均扮演重要角色，故而有必要深入了解其在影響肝癌進(jìn)展中所起的重要機(jī)制，以針對(duì)性的開(kāi)發(fā)出免疫治療新療法[3]。

1 外泌體簡(jiǎn)介

外泌體是直徑30～100 nm的膜性囊泡，幾乎能夠被所有種類(lèi)的細(xì)胞所分泌，參與各種生理、病理過(guò)程，且通常能在各種體液包括血液、尿液、唾液等中被檢測(cè)到[4]。外泌體負(fù)責(zé)細(xì)胞間信號(hào)交流，通過(guò)受體配體結(jié)合及內(nèi)吞入靶細(xì)胞等方式進(jìn)行，并且能夠轉(zhuǎn)運(yùn)各種生物分子，比如蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、mRNAs、非編碼RNA包括長(zhǎng)鏈非編碼RNA、miRNAs以及環(huán)狀RNA等[5]。由于外泌體微囊泡膜結(jié)構(gòu)能夠較好地保護(hù)核酸等遺傳物質(zhì)，使得外泌體所攜帶的生物學(xué)信息能夠被用于監(jiān)測(cè)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展，有望成為良好的生物標(biāo)志物。在肝癌中，已知的外泌體所介導(dǎo)的腫瘤生物學(xué)行為包括血管生成、免疫抑制、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、耐藥等[6]。

2 外泌體在腫瘤免疫中的雙重作用

腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)行為不僅僅取決于腫瘤細(xì)胞本身，也受到腫瘤細(xì)胞與其所處腫瘤微環(huán)境的相互作用的調(diào)節(jié)，而來(lái)源于腫瘤細(xì)胞與免疫細(xì)胞的外泌體共同調(diào)節(jié)了機(jī)體的免疫反應(yīng)進(jìn)程[7]。在腫瘤發(fā)生過(guò)程中，各類(lèi)抗原呈遞細(xì)胞（APC）包括樹(shù)突狀細(xì)胞（DC）、巨噬細(xì)胞等通過(guò)吞噬各種腫瘤抗原并將其呈遞至主要組織相容性復(fù)合物（MHC）分子上并與T細(xì)胞特異性結(jié)合以啟動(dòng)免疫反應(yīng)，此過(guò)程被稱(chēng)為免疫突觸[8]。與此同時(shí)，也有證據(jù)表明APC會(huì)通過(guò)分泌擁有抗原呈遞作用的外泌體來(lái)激活更多免疫效應(yīng)細(xì)胞，并且被激活后的T細(xì)胞也會(huì)分泌外泌體以進(jìn)一步促進(jìn)抗腫瘤炎性反應(yīng)[9]。然而，在腫瘤的發(fā)展過(guò)程中，腫瘤細(xì)胞也會(huì)通過(guò)直接或間接方式塑造免疫抑制性的腫瘤微環(huán)境，以此來(lái)逃避或抑制免疫細(xì)胞的殺傷作用。腫瘤細(xì)胞可以通過(guò)多種方式逃避免疫監(jiān)視并誘導(dǎo)免疫耐受，其中就包括釋放腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體（TEX）[10]。有趣的是，一方面，腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體由于自身呈遞腫瘤相關(guān)抗原可以誘導(dǎo)、增強(qiáng)抗腫瘤免疫反應(yīng)；另一方面，腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體也可通過(guò)各種細(xì)胞間通訊的方式抑制免疫細(xì)胞正常功能，例如誘導(dǎo)免疫細(xì)胞抑制性的表型生成以及通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)啟動(dòng)免疫細(xì)胞程序性死亡[11]。

3 外泌體抗原呈遞激活肝癌免疫反應(yīng)

在肝癌中，無(wú)論是免疫細(xì)胞來(lái)源的亦或是腫瘤細(xì)胞來(lái)源的包含腫瘤抗原的外泌體均能通過(guò)抗原呈遞的方式來(lái)誘導(dǎo)和增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)，并且某些免疫細(xì)胞來(lái)源的外泌體對(duì)于肝癌細(xì)胞有直接抑制或殺傷作用。DC細(xì)胞作為最主要的抗原呈遞細(xì)胞在T細(xì)胞的啟動(dòng)中扮演著不可或缺的角色，在吞噬腫瘤抗原后它能夠釋放表達(dá)MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ大分子的外泌體，進(jìn)一步激活免疫反應(yīng)[12]。有報(bào)道顯示，來(lái)源于小鼠肝癌細(xì)胞系的TEX能夠激活并促進(jìn)DC細(xì)胞的成熟，提升其表面MHC-Ⅰ和MHC-Ⅱ的水平，并且TEX與傳統(tǒng)腫瘤細(xì)胞溶解產(chǎn)物激活DC細(xì)胞相比能帶來(lái)更強(qiáng)的體內(nèi)以及體外免疫反應(yīng)[13]。另外，在原位肝癌小鼠中，TEX處理的DC細(xì)胞顯著改善了肝癌腫瘤微環(huán)境：T效應(yīng)淋巴細(xì)胞數(shù)量增多，IFN-γ水平提升，IL-10以及腫瘤生長(zhǎng)因子β（TGF-β）降低。由此可見(jiàn)，TEX能通過(guò)激活DC細(xì)胞啟動(dòng)T細(xì)胞的免疫殺傷效應(yīng)，為外泌體抗腫瘤治療提供了嶄新的臨床應(yīng)用前景。NK細(xì)胞是一類(lèi)無(wú)需預(yù)先致敏就能非特異性殺傷腫瘤細(xì)胞的免疫細(xì)胞，之前有報(bào)道，肝癌細(xì)胞釋放的外泌體包含應(yīng)激誘導(dǎo)熱休克蛋白（HSP），能夠顯著激活NK細(xì)胞并促進(jìn)其殺傷腫瘤效應(yīng)[14]。并且這種殺傷效應(yīng)是通過(guò)NK細(xì)胞識(shí)別腫瘤細(xì)胞上自然殺傷細(xì)胞活化型受體（NKG2D）的配體來(lái)實(shí)現(xiàn)的。最近有研究發(fā)現(xiàn)，一些抗腫瘤藥（如卡鉑）在治療肝癌的過(guò)程中能夠誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞釋放包含HSP70的外泌體，由此增強(qiáng)了肝癌腫瘤免疫源性并激活了NK細(xì)胞[14]。除了TEX的免疫激活效果，免疫細(xì)胞源性的外泌體也能夠起到抗腫瘤的效果。例如，巨噬細(xì)胞來(lái)源的外泌體如miR-223和miR-142，可通過(guò)細(xì)胞間交流的形式抑制肝癌中某些基因轉(zhuǎn)錄后蛋白水平的表達(dá)，抑制微管不穩(wěn)定蛋白1和胰島素樣生長(zhǎng)因子1的分泌及肝癌細(xì)胞的增殖[15]。另外，也有研究發(fā)現(xiàn)，HDAC6基因能夠通過(guò)上調(diào)肝癌細(xì)胞TEX的miRNA let-7i-5p表達(dá)，從而抑制TSP1蛋白表達(dá)并占據(jù)CD47受體，最終阻斷巨噬細(xì)胞中CD47-SIRPα通路介導(dǎo)的抗吞噬作用，從而抑制肝癌腫瘤發(fā)生[16]。以上研究均顯示出腫瘤來(lái)源的外泌體作為肝癌免疫治療增強(qiáng)腫瘤免疫源性的巨大潛力，有望于成為肝癌免疫治療的腫瘤疫苗。

4 外泌體促進(jìn)肝癌免疫逃逸

盡管在癌癥發(fā)生過(guò)程中外泌體對(duì)于機(jī)體免疫系統(tǒng)的激活起到了一定的幫助，但是大量的研究表明，在腫瘤進(jìn)展過(guò)程中，外泌體所產(chǎn)生的免疫抑制效應(yīng)導(dǎo)致了癌癥不可逆的進(jìn)展，其中外泌體對(duì)于免疫細(xì)胞的調(diào)節(jié)作用至關(guān)重要[17]。

4.1 巨噬細(xì)胞 巨噬細(xì)胞通常是由外周血中單核細(xì)胞募集、分化而來(lái)，在肝癌腫瘤微環(huán)境的發(fā)生、發(fā)展中扮演了重要的角色。生理狀態(tài)下，單核細(xì)胞通常會(huì)在2 d內(nèi)發(fā)生凋亡，然而在腫瘤驅(qū)動(dòng)的慢性持續(xù)性炎癥狀態(tài)下，單核細(xì)胞會(huì)被持續(xù)動(dòng)員募集進(jìn)入肝癌腫瘤微環(huán)境，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生、發(fā)展。近期的研究表明，肝癌TEX在單核細(xì)胞的絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）通路中激活了Ras和細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶，阻止了半胱天冬酶的裂解，從而抑制了單核細(xì)胞的凋亡，進(jìn)而促進(jìn)了腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞（TAM）的募集[18]。另外，敲低試驗(yàn)驗(yàn)證了TEX是通過(guò)其裝載的磷酸化受體酪氨酸激酶如磷酸化上皮生長(zhǎng)因子和人上皮生長(zhǎng)因子受體2激活MAPK通路的。此外，隨著肝癌的進(jìn)展，TAM逐漸由抗腫瘤的M1型巨噬細(xì)胞極化為促癌的M2型巨噬細(xì)胞，其中肝癌TEX所運(yùn)載的ncRNA亦起到重要作用。有研究顯示，肝癌細(xì)胞分泌lncRNA TUC339通過(guò)TEX細(xì)胞間交流方式運(yùn)輸至TAM中，促進(jìn)了TAM向M2表型的極化[19]。在TAM中沉默TUC339可顯著增加促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生、共刺激分子的表達(dá)以及細(xì)胞吞噬作用的增強(qiáng)，而過(guò)表達(dá)試驗(yàn)恰恰相反。此外，芯片技術(shù)顯示TUC339在巨噬細(xì)胞中可通過(guò)與CXCR趨化因子受體結(jié)合、Toll樣受體信號(hào)通路等發(fā)揮作用。最新的研究發(fā)現(xiàn)肝癌TEX中轉(zhuǎn)錄因子Sal樣蛋白2能夠上調(diào)miR-146a-5p的表達(dá)，并激活NF-κB信號(hào)通路、誘導(dǎo)促炎因子表達(dá)，從而重塑巨噬細(xì)胞表型，使其極化為M2型巨噬細(xì)胞[20]。由此M2型巨噬細(xì)胞上調(diào)了效應(yīng)T細(xì)胞中PD-L1和CTL4的表達(dá)，促進(jìn)了效應(yīng)T細(xì)胞在腫瘤微環(huán)境內(nèi)的耗竭，助長(zhǎng)了肝癌腫瘤免疫抑制微環(huán)境。且內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激對(duì)于腫瘤細(xì)胞發(fā)揮免疫逃逸及藥物抵抗有很強(qiáng)的促進(jìn)作用。在衣霉素處理的肝癌細(xì)胞TEX中，miR-23a-3p被發(fā)現(xiàn)顯著上調(diào)，并且與巨噬細(xì)胞中程序性死亡配體-L1（PD-L1）的含量呈正相關(guān)[21]。進(jìn)一步研究表明，肝癌TEX來(lái)源的miR-23a-3p可通過(guò)PTENAKT通路上調(diào)巨噬細(xì)胞內(nèi)PD-L1表達(dá)從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞死亡，并進(jìn)一步抑制了CD8+T細(xì)胞以及IL-12的產(chǎn)生，從而促進(jìn)了免疫抑制環(huán)境的形成。此外，有研究發(fā)現(xiàn)褪黑素可以通過(guò)抑制肝癌TEX中STAT3通路的激活來(lái)下調(diào)巨噬細(xì)胞中PD-L1的表達(dá)，并同時(shí)抑制了IL-6、IL-10以及TNF-α等在巨噬細(xì)胞中的表達(dá)，表明了褪黑素對(duì)于緩解腫瘤免疫抑制狀態(tài)的潛在作用[22]。

4.2 T淋巴細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞 T淋巴細(xì)胞可根據(jù)其功能分為CD4+和CD8+T細(xì)胞兩大類(lèi)，其中CD4+T細(xì)胞在腫瘤免疫中主要為輔助功能，負(fù)責(zé)抗體產(chǎn)生與釋放、CD8+T細(xì)胞的激活，而CD8+T細(xì)胞主要負(fù)責(zé)識(shí)別與殺傷腫瘤細(xì)胞。然而，腫瘤來(lái)源的外泌體卻能夠通過(guò)抑制Th1反應(yīng)來(lái)誘導(dǎo)CD4+CD25+的調(diào)節(jié)性T細(xì)胞產(chǎn)生（Treg）的生成，而效應(yīng)T細(xì)胞PD-1、T細(xì)胞免疫球蛋白黏蛋白分子（TIM-3）等可誘導(dǎo)T細(xì)胞程序性死亡或進(jìn)入休眠狀態(tài)，從而逃避免疫細(xì)胞的監(jiān)視功能[23]。大多數(shù)外泌體并非是通過(guò)被攝取的方式進(jìn)入T細(xì)胞從而進(jìn)行細(xì)胞間交流的，而是與細(xì)胞表面受體結(jié)合從而傳導(dǎo)信號(hào)或調(diào)節(jié)T細(xì)胞功能[24]。也有部分外泌體通過(guò)間接地調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞表型轉(zhuǎn)換，以M2型巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)效應(yīng)T細(xì)胞的耗竭或是通過(guò)抑制DC細(xì)胞激活從而阻斷T細(xì)胞激活，這些研究上文均已列舉過(guò)[20-21]。最近有報(bào)道顯示，14-3-3ζ在肝癌細(xì)胞和腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞中均有高表達(dá)，且其高表達(dá)與免疫激活抑制、免疫細(xì)胞增殖以及抗腫瘤功能相關(guān)[25]。在外周血CD3+T細(xì)胞中，14-3-3ζ高表達(dá)時(shí)PD-1、TIM-3、淋巴細(xì)胞激活基因3與細(xì)胞毒T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原4等抑制性受體顯著升高，且其增殖和活動(dòng)受到抑制。另外，肝癌中高表達(dá)14-3-3ζ的TEX可直接被T細(xì)胞吞噬，由此可證明肝癌細(xì)胞中14-3-3ζ通過(guò)外泌體的形式被轉(zhuǎn)運(yùn)到T細(xì)胞內(nèi)，并且介導(dǎo)了幼稚T細(xì)胞向Treg細(xì)胞而非效應(yīng)T細(xì)胞的分化偏移。此外，亦有報(bào)道稱(chēng)主要組織相容性復(fù)合物Ⅰ（MIC）A/B和視磺酸轉(zhuǎn)錄本1/UL16結(jié)合蛋白（RAET1/ULBP）家族在肝癌TED中顯著富集，其中MICA和ULBP能夠通過(guò)外泌體途徑抑制NKG2D信號(hào)通路，從而削弱細(xì)胞毒性T細(xì)胞的腫瘤殺傷功能，且裝載TGF-β的外泌體能夠抑制CD8+T細(xì)胞的激活[26]。

B淋巴細(xì)胞是體液免疫的主要組成部分，其不僅能夠分泌特異性抗體，也具有部分抗原呈遞功能，其中調(diào)節(jié)性B細(xì)胞（Breg）在肝癌中與不良預(yù)后有著顯著聯(lián)系[27]。在肝癌患者的腫瘤組織中，TIM-1+Breg細(xì)胞的浸潤(rùn)水平顯著升高，呈現(xiàn)CD5highCD24-CD27-/+CD38+的表型，這促進(jìn)了免疫抑制細(xì)胞因子IL-10的過(guò)表達(dá)并顯著抑制了CD8+T細(xì)胞的免疫活性。而經(jīng)過(guò)肝癌TEX處理后的B細(xì)胞也呈現(xiàn)出了相同的表型，這些都與肝癌晚期分期及早期復(fù)發(fā)相聯(lián)系。進(jìn)一步研究顯示，外泌體來(lái)源的HMGB1激活了B細(xì)胞并可通過(guò)TLR2/4及MAPK通路誘導(dǎo)其表型轉(zhuǎn)換及擴(kuò)增[28]。

5 外泌體相關(guān)肝癌免疫治療的方法及進(jìn)展

針對(duì)外泌體相關(guān)肝癌免疫治療方法包括誘導(dǎo)、增強(qiáng)機(jī)體自身免疫力，以及通過(guò)藥物阻斷免疫抑制相關(guān)通路。由于腫瘤來(lái)源的外泌體能夠顯著增強(qiáng)腫瘤免疫源性，激發(fā)相關(guān)抗原呈遞細(xì)胞活化，因此一系列通過(guò)腫瘤細(xì)胞來(lái)源或免疫細(xì)胞來(lái)源的外泌體誘導(dǎo)免疫增強(qiáng)的試驗(yàn)已經(jīng)展開(kāi)[13，29-30]。其中呈遞甲胎蛋白（AFP）的DC細(xì)胞來(lái)源的外泌體（DEXAFP）在異位、原位及誘導(dǎo)肝癌小鼠模型中均產(chǎn)生了較強(qiáng)的抗原特異性免疫反應(yīng)，并抑制了腫瘤生長(zhǎng)，延長(zhǎng)了生存時(shí)間，小鼠肝癌腫瘤微環(huán)境得以明顯改善，表達(dá)IFN-γ的CD8+T細(xì)胞明顯增加，IFN-γ及IL-2水平也均明顯增加，并且CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞及IL-10水平在腫瘤組織中明顯減少[29]。利用重組腺相關(guān)病毒載體攜帶AFP基因加載人外周血來(lái)源的DC細(xì)胞，制備出高純度DEXAFP[30]。DEXAFP能夠有效刺激naveT細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)T細(xì)胞激活為抗原特異性細(xì)胞毒性T細(xì)胞，有效抑制肝癌生長(zhǎng)。這兩項(xiàng)研究均提示DC細(xì)胞來(lái)源的外泌體有望成為免疫療法中的肝癌疫苗。

近期，一項(xiàng)關(guān)于腫瘤細(xì)胞來(lái)源的外泌體PD-L1的研究提示，來(lái)自腫瘤細(xì)胞的外泌體PD-L1能夠抑制引流淋巴結(jié)T細(xì)胞的活化，而去除外泌體PD-L1可抑制腫瘤生長(zhǎng)，即使在抗PD-L1抗體的模型中也是如此，這項(xiàng)研究盡管未在肝癌細(xì)胞系中展開(kāi)，但也提示外泌體PD-L1可作為一種有效的抗免疫檢查點(diǎn)抑制劑耐藥的方法[11]。

6 小結(jié)

綜上所述，外泌體作為一種新型細(xì)胞間通訊方式，在腫瘤細(xì)胞及機(jī)體免疫細(xì)胞的相互作用中扮演了不可替代的角色。外泌體能夠有效激活機(jī)體免疫系統(tǒng)中的抗原呈遞細(xì)胞，促進(jìn)抗腫瘤免疫反應(yīng)，為外泌體抗肝癌治療提供新思路，為無(wú)細(xì)胞肝癌疫苗的誕生奠定了基礎(chǔ)。同時(shí)，外泌體在肝癌免疫抑制微環(huán)境的塑造過(guò)程中起到促進(jìn)肝癌發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移的作用，本文詳細(xì)闡述了肝癌患者外泌體對(duì)于幾種主要免疫細(xì)胞的影響機(jī)制，并揭示了它們?cè)诟伟┻M(jìn)展中起到的作用。在未來(lái)的研究中，應(yīng)該更加注重對(duì)于外泌體在免疫抑制通路方面的研究，以獲取更多潛在的針對(duì)性治療靶點(diǎn)，更好地應(yīng)用于臨床實(shí)踐。