流行性乙型腦炎發(fā)病機制的研究進展

但美伶 尹榕

流行性乙型腦炎簡稱乙腦，又稱為日本腦炎（Japanese encephalitis，JE），是由嗜神經(jīng)性病毒乙腦病毒（Japanese encephalitis virus，JEV）引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)的急性炎癥，由蟲媒傳播。乙腦具有季節(jié)性和地域性，目前主要分布在東南亞及西太平洋的24個國家，約有30億人生活在乙腦流行區(qū)域，每年報道約6.8 萬乙腦臨床病例，病死率為25%～30%，30%～50%的乙腦幸存者遺留嚴(yán)重的神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥，給社會和公共衛(wèi)生帶來沉重負(fù)擔(dān)[1]。

1 乙腦病毒結(jié)構(gòu)及基因型

乙腦病毒屬于黃病毒科黃病毒屬，是一種含有包膜的正向單鏈RNA 病毒，在人類中具有神經(jīng)侵襲性和神經(jīng)毒性。該病毒具有3種結(jié)構(gòu)蛋白：衣殼蛋白（C）、前體膜蛋白（M）和包膜蛋白（E），以及7個非結(jié)構(gòu)蛋白：NS-1、NS-2A、NS-2B、NS-3、NS-4A、NS-4B 和NS-5[1，2]。目前確定了乙腦病毒的5種基因型，分別命名為G-Ⅰ、G-Ⅱ、G-Ⅲ、G-Ⅳ、G-Ⅴ。一項小鼠模型的中和試驗和被動免疫研究表明，感染屬于G-Ⅰ、G-Ⅱ、G-Ⅲ或G-Ⅳ病毒中任何一種病毒可以賦予交叉基因型免疫保護。另外，乙腦病毒基因型之間存在競爭性置換，即在某個區(qū)域一種基因型部分或完全替代另一種基因型，但這種競爭性置換的機制目前尚不清楚[3]。

2 乙腦的發(fā)病機制

2.1 病毒的復(fù)制人類被攜帶乙腦病毒的蚊蟲叮咬后，病毒首先在局部皮膚和淋巴結(jié)中復(fù)制，引起短暫的低病毒血癥。在潛伏期，乙腦病毒主要在單核-巨噬細(xì)胞和樹突狀細(xì)胞中復(fù)制[4]。然后，被感染的細(xì)胞從外周遷移至中樞，導(dǎo)致乙腦發(fā)生[5]。

乙腦病毒通過受體介導(dǎo)的胞吞作用進入細(xì)胞。非結(jié)構(gòu)蛋白（NS），如NS-1、NS-2A、NS-2B、NS-3、NS-5等在病毒復(fù)制及裝配過程中扮演重要角色[2，6，7]。信號肽酶復(fù)合物亞基1（SPCS1）是調(diào)節(jié)黃病毒復(fù)制的宿主因子，通過與NS-2B 相互作用影響病毒復(fù)制，進而影響乙腦病毒蛋白的加工翻譯和病毒裝配[6]。另外，宿主內(nèi)質(zhì)網(wǎng)在病毒基因組的復(fù)制和病毒體顆粒的成熟中也起著非常重要的作用[7]。

宿主microRNA 能直接靶向作用于病毒的mRNA，既能抑制病毒基因組的翻譯，防止病毒復(fù)制，也可以穩(wěn)定病毒RNA，增強復(fù)制。Chen 等[8]發(fā)現(xiàn)人工轉(zhuǎn)染miR-33a-5p 模擬物后導(dǎo)致乙腦病毒復(fù)制顯著減少，并進一步證實了miR-33a-5p 通過靶向抑制真核翻譯延伸因子1A1(EEF1A1)的細(xì)胞內(nèi)水平來抑制病毒復(fù)制。而Sharma 等[9]的一項研究表明miR-146a 的外源性過表達可導(dǎo)致感染乙腦病毒時Jak-STAT 途徑被抑制，從而導(dǎo)致干擾素誘導(dǎo)基因（IFIT-1 和IFIT-2）的下調(diào)，促進病毒的復(fù)制。

此外，Huang 等[10]研究表明，CW-33（一種呋喃喹啉的中間體合成衍生物）可抑制乙腦病毒復(fù)制并觸發(fā)Akt 激活，Akt 調(diào)節(jié)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+的釋放，減少Ca2+介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。

2.2 免疫機制乙腦病毒從血液中進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，并快速引發(fā)體液和細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，乙腦患者的臨床表現(xiàn)和預(yù)后取決于病毒的毒力和宿主免疫反應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)，先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)在減少病毒血癥和清除病毒中都非常重要[11]。

2.2.1 先天免疫反應(yīng) 小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的兩種重要細(xì)胞，它們在乙腦病毒感染過程中有助于宿主產(chǎn)生先天免疫力。據(jù)報道，小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞在病毒感染期間，可上調(diào)一系列趨化因子，如CCL2（單核細(xì)胞趨化蛋白，MCP-1），CCL5（RANTES），CXCL10（干擾素γ 誘導(dǎo)蛋白，IP-10）等，這些趨化因子能以自分泌的形式刺激中樞神經(jīng)系統(tǒng)中其他白細(xì)胞遷移，從而增強其他可能具有神經(jīng)毒性的介質(zhì)的分泌[12，13]。作為先天免疫的一部分，IFN-α是一種因病毒感染產(chǎn)生的糖蛋白細(xì)胞因子，它不直接抗病毒，而是誘導(dǎo)細(xì)胞中產(chǎn)生效應(yīng)蛋白，從而抑制病毒的復(fù)制、組裝或釋放[11]。

2.2.2 適應(yīng)性免疫反應(yīng)

2.2.2.1 體液免疫 已有文獻[11]報道了體液免疫反應(yīng)在調(diào)控乙腦病毒感染及其傳播過程中的作用。乙腦患者血清和腦脊液中產(chǎn)生IgM 抗體來對抗這種原發(fā)性感染?？贵w可能在病毒免疫階段(即病毒越過血腦屏障到達中樞神經(jīng)系統(tǒng)之前的階段)限制病毒的復(fù)制來保護宿主。IgM 抗體水平高往往提示預(yù)后良好。另外，識別主要位于病毒E 蛋白表位的中和抗體參與了這種體液免疫，這些抗體抑制病毒在細(xì)胞內(nèi)的附著、內(nèi)化和復(fù)制。表明針對E 蛋白的單克隆抗體的被動轉(zhuǎn)移可以保護小鼠免受乙腦病毒的侵害。除此之外，抗NS-1 和抗前體膜蛋白（PrM）在介導(dǎo)針對乙腦病毒感染的保護性免疫中也發(fā)揮著重要作用[11]。

2.2.2.2 細(xì)胞免疫 細(xì)胞免疫在乙腦中的作用機制目前尚不清楚。在一項小鼠的白細(xì)胞遷移抑制試驗中觀察到小鼠T細(xì)胞的被動轉(zhuǎn)移賦予了終生細(xì)胞免疫能力[11]。在另一項研究中，證明用滅活的乙腦疫苗免疫可在體內(nèi)誘導(dǎo)T細(xì)胞活化[14]。這表明滅活的乙腦疫苗誘導(dǎo)的保護性免疫包括乙腦病毒特異性T細(xì)胞以及具有多種生物學(xué)活性的抗體。以上關(guān)于乙腦的動物實驗表明，細(xì)胞免疫限制了病毒復(fù)制并保護了中樞神經(jīng)系統(tǒng)免受病毒入侵。

在乙腦患者中分離出病毒特異的CD4+和CD8+T淋巴細(xì)胞，并發(fā)現(xiàn)它們可隨著乙腦病毒的刺激而增殖，并且高質(zhì)量的多功能CD4+T細(xì)胞反應(yīng)提示與完全康復(fù)具有相關(guān)性。乙腦病毒感染可誘導(dǎo)CD8+T細(xì)胞應(yīng)答的抑制，可能會增加宿主的易感性[11]。此外，DNA 或活疫苗誘導(dǎo)的最佳抗體反應(yīng)完全取決于CD4+Th 細(xì)胞的存在[15]。對于感染乙腦病毒，不同個體臨床反應(yīng)和疾病進展具有差異，這可能與T細(xì)胞反應(yīng)的遺傳或種族差異有關(guān)，這將對于未來疫苗的研發(fā)起到重要的提示作用[11]。

T細(xì)胞免疫球蛋白粘蛋白結(jié)構(gòu)域1（TIM-1）作為病毒入侵的輔助因子可促進乙腦病毒的感染。乙腦病毒和TIM-1 之間的相互作用可能直接影響免疫應(yīng)答過程中的抗原提呈[16]。乙腦病毒通過MyD88 依賴性和非依賴性途徑誘導(dǎo)樹突狀細(xì)胞功能損傷，繼而導(dǎo)致較差的CD4+和CD8+T細(xì)胞反應(yīng)，提高了病毒的存活率和在體內(nèi)傳播效率。TLR2-MyD88 和p38 MAPK 信號通路可能參與乙腦病毒介導(dǎo)的可溶性和細(xì)胞相關(guān)抗原交叉提呈的抑制[4]。另一項小鼠模型研究表明，在乙腦感染期間，髓樣抑制細(xì)胞（MDSC）的數(shù)量增加，這些細(xì)胞會抑制T濾泡輔助細(xì)胞介導(dǎo)的免疫反應(yīng)，削弱免疫應(yīng)答，從而促進疾病的進展[17]。

2.3 血腦屏障破壞乙腦的特征在于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的廣泛炎癥和血腦屏障的破壞。乙腦病毒通過內(nèi)皮細(xì)胞吞噬作用穿過血腦屏障，進入中樞神經(jīng)系統(tǒng)，在神經(jīng)元中傳播，并誘導(dǎo)炎性細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生，引起血腦屏障的破壞。

血腦屏障的破壞不是病毒本身造成的，在感染乙腦病毒的小鼠模型中，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中產(chǎn)生大量趨化因子和細(xì)胞因子，包括CXCL10、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、TNF-α、IL-6 和IFN-γ 等，并通過以下兩種途徑調(diào)節(jié)血腦屏障的通透性。首先，炎癥細(xì)胞因子或趨化因子可通過下調(diào)緊密連接蛋白降低血腦屏障的通透性。其次，炎性細(xì)胞因子可以通過誘導(dǎo)黏附分子在血腦屏障內(nèi)皮細(xì)胞上的表達來進一步損害血腦屏障。炎癥介質(zhì)IFN-γ下調(diào)了緊密連接蛋白的表達，在破壞血腦屏障通透性的過程中起核心作用[18]。

2.4 神經(jīng)炎癥神經(jīng)炎癥是乙腦病毒感染的標(biāo)志。乙腦病毒感染可誘導(dǎo)促炎細(xì)胞因子的表達，引起人類急性腦炎。一般認(rèn)為，乙腦發(fā)病機理很大程度上是宿主神經(jīng)元免疫系統(tǒng)炎癥反應(yīng)失調(diào)的結(jié)果。感染乙腦病毒的細(xì)胞顯示出LCFA（長鏈脂肪酸）β氧化受損，IL-6 和TNF-α 表達增加。積累的LCFA 觸發(fā)氧化應(yīng)激，激活NF-κB（核轉(zhuǎn)錄因子），誘導(dǎo)促炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生，隨后可能會導(dǎo)致與乙腦相關(guān)的腦損傷[19]。

據(jù)報道，乙腦病毒可雙向引起神經(jīng)元細(xì)胞死亡。首先，在神經(jīng)元細(xì)胞內(nèi)進行病毒復(fù)制直接導(dǎo)致細(xì)胞死亡。其次，間接殺傷，即小膠質(zhì)細(xì)胞、星形細(xì)胞和募集的巨噬細(xì)胞過度激活導(dǎo)致釋放過量的促炎細(xì)胞因子，如IL-6、TNF-α 和RANTES 等，增加血腦屏障的通透性，并促使大量白細(xì)胞遷移至中樞神經(jīng)系統(tǒng)進而導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞死亡[20]。

單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞和小膠質(zhì)細(xì)胞在乙腦引起的中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥中起主要作用。人小膠質(zhì)細(xì)胞參與乙腦病毒的復(fù)制及儲存，被稱作病毒庫。乙腦病毒對人小膠質(zhì)細(xì)胞沒有致病性，但能以接觸傳播的方式將病毒傳給易感細(xì)胞。小膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)元病病理中起關(guān)鍵作用，具有促炎性（M1）或抗炎性（M2）雙重作用，可導(dǎo)致神經(jīng)毒性反應(yīng)或神經(jīng)保護功能。要有效地去除病原體，就需要早期的小膠質(zhì)細(xì)胞活化。但是，長時間的小膠質(zhì)細(xì)胞活化會導(dǎo)致促炎性介質(zhì)的過量產(chǎn)生，進而導(dǎo)致神經(jīng)炎癥的發(fā)生[21]。

過度刺激谷氨酸受體，尤其是神經(jīng)元N-甲基-D-天冬氨酸受體(NMDAR)，可引起神經(jīng)毒性反應(yīng)。Chen 等[22]發(fā)現(xiàn)，乙腦病毒通過增加NMDAR 亞基（NR1 和NR2）的磷酸化和觸發(fā)Ca2+的內(nèi)流來激活NMDAR，Ca2+的內(nèi)流引起鈣蛋白酶和其他蛋白酶介導(dǎo)的細(xì)胞骨架損傷反應(yīng)激活，并伴有活性氧產(chǎn)生，線粒體功能障礙，最終導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞凋亡。因此，NMDAR 在調(diào)節(jié)乙腦病毒誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞損傷和神經(jīng)炎癥中起著至關(guān)重要的作用。

3 乙腦的治療

疫苗接種目前仍是預(yù)防乙腦最經(jīng)濟、最有效的手段?，F(xiàn)階段使用的乙腦疫苗主要有三種:鼠腦滅活疫苗、細(xì)胞培養(yǎng)滅活疫苗和細(xì)胞培養(yǎng)減毒活疫苗。目前廣泛認(rèn)可的疫苗是源自小鼠腦或細(xì)胞培養(yǎng)物的滅活疫苗，SA14-14-2 株在我國廣泛使用，并認(rèn)為對所有基因型均具有較好的保護效果[11，23]。

microRNA 對乙腦病毒復(fù)制的調(diào)控目前主要集中于抗病毒通路Jak-STAT，調(diào)控Jak-STAT 通路或許是抑制病毒復(fù)制的有利的研究方向[9]。NMDAR拮抗劑MK-801（地卓西平）可阻止乙腦病毒誘導(dǎo)的神經(jīng)元細(xì)胞凋亡、谷氨酸和炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生，最終對急性腦炎提供保護作用，并降低感染乙腦病毒小鼠的死亡率[22],因此，NMDAR 靶向治療可能成為控制乙腦的有效方法。有報道Ca2+抑制劑可在病毒進入、復(fù)制階段起到抑制病毒的作用，可拮抗乙腦病毒活性，被認(rèn)為是一種有效的治療方法[24]。

一項研究表明，米諾環(huán)素可降低感染乙腦病毒小鼠的神經(jīng)元凋亡、小膠質(zhì)細(xì)胞活化、胱天蛋白酶活性、促炎介質(zhì)釋放和病毒滴度，表明米諾環(huán)素可以作為乙腦患者臨床試驗的候選藥物[25]。Ye 等[26]證實了依那西普可減輕由乙腦病毒引起的炎癥反應(yīng)，并顯著提高小鼠的存活率。尼泊爾一項隨機雙盲對照試驗發(fā)現(xiàn)，靜脈注射丙種球蛋白會使IL-6、IL-4 升高，通過調(diào)節(jié)體液免疫的方式減少神經(jīng)系統(tǒng)后遺癥的發(fā)生[27]。但這些藥物都不能達到完全治愈小鼠的目的，還需要進一步的研究來評估聯(lián)合用藥是否能達到最佳療效。

4 小結(jié)

乙腦的發(fā)病與流行一直是困擾我國及其他大多數(shù)亞洲國家的嚴(yán)重公共衛(wèi)生問題。由于缺乏有效的藥物治療，使得乙腦的防治成為一項難題。為了不斷探索新的治療方案，關(guān)于乙腦發(fā)病機理的研究一直以來既是熱點也是難點，涉及病毒復(fù)制、免疫反應(yīng)、血腦屏障破壞、神經(jīng)炎癥等方面，并提出了眾多干預(yù)策略。雖然我們在對乙腦發(fā)病機制的研究上有了較大進展，但用于人類治療的臨床藥物的開發(fā)卻滯后。目前部分藥物（米諾環(huán)素、依那西普等）被認(rèn)為能改善乙腦病毒感染小鼠的致死性結(jié)局，但仍缺乏大量的臨床研究,而且尚不能達到治愈的效果。因此，仍有必要進行更多的臨床藥物的研發(fā)及評估聯(lián)合用藥是否能達到最佳治療效果。