Wnt信號通路、靶向降解技術與心力衰竭治療的新進展

康伊，張偉，孫蔚雯，王晶，張艷，逯春鵬

Wnt信號在生物體發(fā)育過程中的作用至關重要，同時也在多種病理過程中發(fā)揮了關鍵作用（如神經退行性變、骨質疏松和癌癥）。諸多研究表明，Wnt信號在心臟重構和心力衰竭（心衰，HF）等病理過程中被顯著激活。本文主要介紹Wnt信號通路及其調控機制，總結Wnt信號通路參與心肌肥大的病理過程。在此基礎上，前瞻性地介紹利用降解靶向嵌合體（PROTAC）技術和溶酶體降解技術的基本原理，探討將靶向降解技術用于調控Wnt信號轉導通路的治療心力衰竭（心衰）等心臟相關疾病的前景。

心衰是由于心臟結構或功能異常導致心室充盈或射血能力受損的一組臨床綜合征，是各種心臟疾病的嚴重和終末階段，臨床表現(xiàn)為呼吸困難，液體潴留，組織灌注減少，致死性心律失常或泵不足等現(xiàn)象[1]。其發(fā)病率高，有臨床癥狀患者的5年存活率與惡性腫瘤相仿。據國外統(tǒng)計，人群中心衰患病率約1.5%～2.0%，且過去40年中，心衰導致的死亡增加了6倍。我國對35～74歲居民抽樣調查中發(fā)現(xiàn)慢性心衰患病率為0.9%，慢性心衰患者約有400萬人，已成為21世紀我國心血管病領域的突出問題[2]。

Wnt基因是從小鼠乳腺癌中克隆的一種原癌基因，是由脂質修飾的糖蛋白。目前，已在人類中分離、鑒定了19種Wnt配體。Wnt配體分為兩類，即Wnt1類和Wnt5a類。Wnt1類激活Wnt經典信號通路，包括Wnt1、Wnt2、Wnt3、Wnt3a、Wnt8及 Wnt8a；Wnt5a類激活非經典信號通路，包括Wnt 4、Wnt5a、Wnt5b、Wnt6、Wnt7a和Wnt11[3]。參與Wnt信號通路的受體蛋白包括Frizzled（Fzd）受體、LRP5/6受體及下游信號分子糖原合成酶激酶3β（GSK3β）、β-catenin、散亂蛋白Disheveled（Dsh）、T細胞因子/淋巴樣增強因子（Tcf/Lef）、細胞支架軸蛋白（Axin）等[4]。

1 Wnt信號通路的基本情況

Wnt/Fzd受體復合物能激活多種信號通路，主要分經典Wnt信號通路、平面極性（PCP）信號通路和Ca2+信號通路[5]。目前研究最清楚的途徑是β-catenin介導的經典Wnt信號，其中β-catenin作為信號轉導的第二信使。在靜息狀態(tài)下，β-catenin被一種 “降解復合物”的蛋白質復合物磷酸化，進而被泛素-蛋白酶體途徑降解，從而維持細胞內Wnt信號通路處于未激活狀態(tài)。哺乳動物的Wnt信號通路降解復合體是由APC蛋白，Axin，CK1和GSK3β共同組成的。當細胞外的Wnt蛋白配體與細胞膜受體Fzd、LPRP5/6結合時，細胞內的Dishevelled蛋白就會被募集到細胞膜，進而將降解復合物募集到細胞膜附近并將其打散。這導致細胞漿內的β-catenin蛋白擺脫了被降解的命運，在細胞質內大量積累，并依靠自身攜帶的入核信號轉位進入細胞核，入核后β-catenin蛋白與轉錄因子TCF/LEF結合，介導了一系列經典Wnt信號通路的靶基因表達[6]。

除β-catenin介導的經典Wnt信號通路外，Wnt蛋白配體還可激活PCP信號通路和Ca2+信號通路。PCP通路主要控制細胞相對于鄰近細胞的方向。非經典Wnt信號配體結合Fzd和ROR2/RYK等輔助受體后，招募Dsh蛋白富集到細胞膜，進而激活兩種小GTP激酶：Rho和Rac，而Rac-GTP酶進一步激活c-Jun 氨基末端激酶（JNK），發(fā)揮調控微管蛋白等細胞骨架的作用。Wnt/Ca2+信號通路通過Wnt5a和Wnt11激活G蛋白激活磷脂酶C（PLC）和蛋白激酶C（PKC），引起細胞內Ca2+濃度增加和Ca2+敏感信號成分激活，以調節(jié)細胞運動和細胞黏附性，此通路能拮抗經典的Wnt信號通路[7,8]。

2 Wnt 信號通路參與心力衰竭

心肌肥大是心臟的一種代償反應，主要特征是心肌細胞體積增大。心肌細胞是終末分化的細胞，當心臟面臨負荷增加或損傷時，它們的增殖率就會不足[9]。因此，心肌細胞對這些挑戰(zhàn)的反應主要是肥大生長。心肌細胞肥大可以源于生理刺激反應（如運動或懷孕），也可能源于病理刺激（如高血壓或瓣膜缺陷）。容量過載（如瓣膜缺陷引起）會導致偏心性或外向性肥厚，而主動脈狹窄或高血壓引起的壓力過載會導致向心性或內向性肥厚。當向心性肥厚的根本原因得不到治療時，就會演變成偏心性重構，通常稱為擴張型心肌病[10]。

研究表明，Wnt/β-catenin信號通路在心肌肥大中起到重要作用。Malekar等[11]實驗表明，經典Wnt信號通路在Dsh過表達轉基因小鼠中激活，Dsh過表達小鼠出生3個月后出現(xiàn)嚴重的心肌肥大表型，心肌細胞體積明顯比正常小鼠增大且過早死亡；相反，在Dsh敲除的心肌細胞中β-腎上腺素誘導的心肌肥大反應受到抑制。在壓力超負荷下，抑制GSK3β的絲氨酸9位點磷酸化降低了小鼠心肌肥大和心衰的發(fā)生率[12]。β-catenin敲除的雜合成年小鼠心臟重量和心臟重量與體重比，均低于β-catenin基因完整組小鼠，表明細胞質中β-catenin促進肥大反應[13]。研究還表明，非經典Wnt通路也與心肌肥大有關。JNK在心肌肥大中起重要作用，MKK7D轉基因小鼠心臟左右心房均變大，而MKK7D表達顯著激活JNK表達[14]，Dsh過表達的心肌肥大小鼠體內Wnt/PCP信號通路和Wnt/Ca2+信號通路均被激活[11]。

許多心血管疾病均會導致心衰，心衰是各種心臟疾病導致心功能不全的一種綜合征，是多種心血管疾病的最終病理變化。在幾項針對人類心衰的研究中，觀察到了與sFRPs蛋白水平升高的聯(lián)系。在衰竭的人類心臟中觀察到sFRP3和sFRP4的mRNA水平增加，而不是sFRP1和sFRP2，且與β-catenin水平降低有關[15]。最近Askevold等證實了sFRP3表達的增加，他們還報告了心衰患者血清中sFRP3水平的增加與心血管死亡率相關[16]。這些觀察結果表明，內源性Wnt拮抗劑的表達抑制了心衰時的Wnt信號傳導。

必須注意的是，在142例心衰患者的1年隨訪中，sFRP3水平與心血管事件發(fā)生之間的相關性并未達到統(tǒng)計學意義[17]。相比之下，Hou等最近發(fā)表了關于人類和小鼠衰竭心臟中經典Wnt信號激活的證據。在這項研究中，β-catenin的核積累和轉錄因子TCF7L2的激活導致c-Myc的表達增加—心臟應激期間表達的Wnt靶基因[18]。Dapper1（Dpr1）是核質穿梭蛋白在細胞核內抑制Wnt信號，上調的Dpr1作用于上游Dsh2激活經典Wnt信號通路誘導心肌重構，使小鼠左室收縮和舒張功能受損[19]，Haq等研究表明，心衰患者心臟中GSK3β被抑制[20]。此外，心臟特異性過表達Dsh的小鼠中經典和非經典Wnt信號通路均被激活，Dsh過表達引起小鼠心肌肥大、心衰和過早死亡[11]。以上研究表明，Wnt信號通路在心衰過程中還存在相互矛盾的研究結果，需要更多更精確的體內研究來進一步研究論證。

3 靶向降解技術

諸多人類遺傳學研究表明，許多新的靶蛋白通過獲得功能性毒性而引起疾病。傳統(tǒng)的藥物開發(fā)策略需要占據結合位點進而抑制目標蛋白功能活性，這使得支架蛋白、轉錄因子和其他非酶蛋白等與疾病相關的蛋白靶點都變得“不可成藥”。通過人工調控泛素—蛋白酶體系統(tǒng)和自噬—溶酶體系統(tǒng)，可通過細胞內的質量控制系統(tǒng)糾正或降解“不可成藥”的致病蛋白質[21]。目前，通過靶向降解技術調控Wnt信號通路的活性，已經取得了部分突破性研究進展。

3.1 PROTAC降解技術目前小分子誘導蛋白降解的主要方法是降解靶向嵌合體技術（PROTAC）。PROTAC分子通過拉近靶蛋白和E3連接酶的距離從而提高靶蛋白的泛素化效率，進而誘導蛋白酶體系統(tǒng)對靶蛋白進行降解。但同時，PROTAC技術存在一定局限性，比如該方法依賴特定E3連接酶，限制其在某些細胞中的應用；其分子量普遍偏大，成藥性存在一定問題等[21]。

2001年，Crews和同事為PROTAC技術提供了概念性證據。他們合成了一個名為Protac-1的嵌合大分子，將MetAP-2招募到Skp1-Cullin-Fbox復合物，以劑量依賴性方式導致MetAP-2蛋白泛素化和降解[22]。然而，MetAP-2共價結合部分是一個肽，阻礙了嵌合大分子進一步的應用，因為它的大分子尺寸導致細胞滲透性差。2015年，Brader研究團隊又建立了一個重要的基于cereblon蛋白（CRBN）的PROTAC系統(tǒng)[23]。另一個PROTAC系統(tǒng)，基于HIF1-α介導的VHLPROTAC系統(tǒng)肽，最初于2004年引入[24]。2015年，通過羥脯氨酸樣小分子替代VHL靶向肽，使得VHL-PROTAC系統(tǒng)的親和性和特異性顯著提高，極大地擴展了其應用[25]。目前雖有大于600個已知的人類E3連接酶，但已建立的依賴E3連接酶PROTAC系統(tǒng)不到10個，應用最廣泛的有CRBN[26]、VHL[25]、cIAP[27]和MDM2[28]。

3.2 溶酶體降解技術除了泛素-蛋白酶體途徑外，細胞內蛋白質的降解還可以通過自噬-溶酶體途徑。利用溶酶體降解途徑降解“不可成藥”的蛋白質靶點也具有廣泛的開發(fā)前景。溶酶體降解途徑包括內體/溶酶體途徑和細胞自噬途徑。細胞自噬途徑始于被稱為自噬體的分離膜結構，該結構來自具有脂質化LC3蛋白的脂質雙層膜，自噬體通過膨脹進而吞噬蛋白質和其他生物分子，甚至包括細胞器等細胞內物質，這些物質被隔離在閉合的雙膜囊泡中，隨后被降解[21]。

自噬靶向嵌合體（AUTAC）采用與PROTAC類似的設計，很適合降解胞質中對PROTAC分子具有抗性的目標蛋白。貨物蛋白首先被吞噬形成自噬體，然后SQSTM1/p62等自噬受體識別Lys63（K63）多聚泛素化貨物蛋白，并將它們轉移到自噬體進行降解。AUTAC和PROTAC分子均通過泛素化起作用，但AUTAC分子通過觸發(fā)K63多聚泛素化從而誘導靶標降解。研究發(fā)現(xiàn)AUTAC分子具備降解目標蛋白以及受損的線粒體等細胞器的能力[29]。

自噬體偶聯(lián)化合物（ATTEC）則是利用自噬降解目標蛋白的一種更直接方法。ATTEC分子與PROTAC和AUTAC分子不同，不依賴底物的泛素化。ATTEC分子直接將目標蛋白和自噬體關鍵受體LC3結合在一起，促進目標蛋白被自噬體吞噬。研究表明，自噬體偶聯(lián)化合物可以在細胞或者動物模型體內降解具有重復擴展的多聚谷氨酰胺（polyQ）的mHTT（突變的亨廷頓蛋白），并減弱HD相關的表型。ATTEC分子可以和polyQ特異性相互作用從而選擇性降解mHTT且不影響野生型HTT水平。ATTEC分子還能夠降解其他引起疾病的polyQ蛋白。通過直接與自噬體蛋白LC3相互作用并繞過泛素化過程，ATTEC分子在降解DNA/RNA分子、受損的細胞器等通過自噬識別的非蛋白貨物方面具有巨大潛力，但ATTEC分子是否會影響整體自噬活性還有待研究[30,31]。

4 靶向降解技術調控Wnt信號通路用于治療心衰

利用靶向降解技術精確地調控Wnt信號通路活性，進而用于治療心衰等心臟疾病，已經顯示出了初步的前景。陳曄光院士研究組利用PROTAC技術，成功合成了基于與β-catenin結合的Axin衍生肽，發(fā)現(xiàn)兩種訂書釘肽SAHPA1和xStAx分別增強或削弱Wnt/β-catenin信號，通過將SAHPA1或xStAx與VHL配體偶聯(lián)來設計PROTACs，以實現(xiàn)高效的β-catenin蛋白降解。所獲得的xStAx-vhl可在體內維持β-catenin的降解，并且對癌細胞和APC-/-類器官中的Wnt信號具有強烈的抑制作用。更重要的是，xStAx-vhl可潛在抑制結直腸癌患者來源的類器官存活。結果表明，xStAxvhl突出了β-catenin降解物PROTACs作為一類新型抗癌藥物的潛力[32]。對于xStAx-vhl通過降解β-catenin蛋白下調Wnt信號通路的活性，在治療或延緩心肌肥大的過程是否具有重要作用，需進一步研究。同時，利用兩種特異性的小肽分子還可更加精細地研究經典Wnt信號通路在體內心衰程中的詳細機制。

除β-catenin外，Wnt信號通路中還有其他重要蛋白通過靶向降解技術進行調控。Dsh蛋白可同時調控經典和非經典Wnt信號通路，研究表明，Dsh蛋白可通過細胞自噬途徑進行降解，且Dsh蛋白的聚集化對于調控Wnt信號功能和自身質量控制十分關鍵[33]。能否通過設計自噬體偶聯(lián)化合物（ATTEC），實現(xiàn)在體內降解調控Dsh蛋白，精確調節(jié)Wnt信號通路，從而治療心肌肥大、心衰及心肌梗死后的創(chuàng)傷愈合等病理過程，有待深入研究。此外，Axin蛋白作為β-catenin蛋白降解復合物的關鍵蛋白，既可通過泛素—蛋白酶體途徑降解，也可通過自噬—溶酶體途徑降解，通過設計特定的PROTAC或者ATTEC小分子化合物，也能實現(xiàn)精確調控Wnt信號通路的功能。

綜上所述，Wnt信號通路在心肌肥大、心肌梗死后傷口愈合等病理過程中的作用，研究十分明確，而在心衰病理過程中的作用仍需進一步研究闡明，靶向蛋白降解技術作為精確調控Wnt信號通路的有效手段，未來在治療心衰等心臟相關疾病中必將大有作為。