柑橘黃龍病脫毒技術(shù)研究進(jìn)展

黃 秀 徐建國(guó) 聶振朋 王 平 孫立方 孫建華 柯甫志

（浙江省柑橘研究所/國(guó)家柑橘品種改良中心浙江分中心 臺(tái)州 318026）

柑橘黃龍病是柑橘產(chǎn)業(yè)中最具毀滅性的病害之一，嚴(yán)重影響柑橘產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展[1,2]。因全球氣溫變暖造成的木虱繁殖和活動(dòng)范圍加大以及柑橘嫁接、苗木的頻繁調(diào)運(yùn)，致使黃龍病在亞洲、美洲、非洲等柑橘主產(chǎn)區(qū)泛濫成災(zāi)[1,3]。如巴西圣保羅州南部橘區(qū)，黃龍病的發(fā)病率達(dá)到30%以上[5]，而美國(guó)佛羅里達(dá)州，自2005年首次發(fā)現(xiàn)黃龍病以來(lái)，種植面積和產(chǎn)量分別下降了38%和74%[3]，我國(guó)自20世紀(jì)首次在華南地區(qū)發(fā)現(xiàn)黃龍病以來(lái)，已有超過(guò)半數(shù)以上柑橘主產(chǎn)區(qū)受到為害，為害面積逐年增加，對(duì)我國(guó)的柑橘產(chǎn)業(yè)造成巨大經(jīng)濟(jì)損失[6, 7]。

目前，世界范圍內(nèi)對(duì)黃龍病的防治都沒(méi)有十分有效的手段。生產(chǎn)上多采用對(duì)媒介昆蟲(chóng)木虱的防治檢測(cè)、砍除病株以及無(wú)病毒苗木的培育等手段預(yù)防黃龍病的發(fā)生和傳播[8,9]，其中無(wú)病毒苗木的培育也是控制黃龍病蔓延的重要前提。采用高效、簡(jiǎn)便的脫毒技術(shù)獲得無(wú)病毒優(yōu)質(zhì)苗木用于提高柑橘產(chǎn)量和品質(zhì)，對(duì)柑橘產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展至關(guān)重要。

本文對(duì)柑橘黃龍病以及柑橘主要脫毒技術(shù)的原理和研究進(jìn)展進(jìn)行闡述，為柑橘無(wú)病毒優(yōu)良品種苗木的推廣和規(guī)模化發(fā)展提供理論基礎(chǔ)和技術(shù)參考。

1 柑橘黃龍病

柑橘黃龍病（Citrus huanglongbing pathogen，HLB）又稱(chēng)青果病，由尚不能培養(yǎng)的韌皮桿菌屬中的一種革蘭氏陰性細(xì)菌引起的病害，根據(jù)病原體的不同主要分為三類(lèi)，即亞洲種（Ca.Li.asiaticus），非洲種（Ca.Li.africanus）和美洲種（Ca.Li.americanus）[10]，目前在我國(guó)流行最廣、為害最嚴(yán)重的主要是亞洲種。亞洲種黃龍病菌在柑橘品種中流行趨勢(shì)隨季節(jié)改變而不同，在春季溫度和濕度利于黃龍病菌繁殖的環(huán)境下，癥狀明顯，傳染加劇；在溫度達(dá)到35℃以上的夏季，癥狀有一定程度的減弱。黃龍病菌主要寄生在根系、葉片等器官韌皮部組織的篩管細(xì)胞中，主要通過(guò)維管束和孢間連絲在樹(shù)體內(nèi)傳播，在柑橘品種間通過(guò)接穗嫁接，木虱、赤眼蜂等傳播媒介等進(jìn)行傳播。

柑橘樹(shù)體感染黃龍病后，篩管組織和韌皮部導(dǎo)管被堵塞甚至壞死，基因表達(dá)改變，淀粉合成增加并在葉片中積累破壞葉綠體結(jié)構(gòu)和堵塞運(yùn)輸系統(tǒng)，干擾營(yíng)養(yǎng)合成以及轉(zhuǎn)運(yùn)阻礙植物生長(zhǎng)[11]，樹(shù)體嚴(yán)重衰弱，根系腐爛受損，出現(xiàn)葉片變小、斑駁或缺素癥黃化、小枝枯死、果實(shí)變小、畸形、有苦味等癥狀，落果現(xiàn)象嚴(yán)重，致使柑橘品質(zhì)降低、產(chǎn)量下降[12,13]。

在感染黃龍病的早期階段，染病樹(shù)體往往有幾個(gè)月到幾年不等的無(wú)癥狀期，此時(shí)在田間用肉眼無(wú)法將其與健康樹(shù)木區(qū)分開(kāi)，再者，染病樹(shù)體早期癥狀如嫩梢變黃，與缺鋅癥相似，果農(nóng)容易對(duì)其做出不正確的診斷，以致染病樹(shù)體不能及時(shí)得到清除，成為無(wú)法預(yù)防的傳播源。現(xiàn)在所有的商業(yè)柑橘品種均不抗黃龍病，存在被感染的風(fēng)險(xiǎn)[2,10]。而經(jīng)脫毒后的柑橘苗木因本身不帶病毒，也無(wú)其他病蟲(chóng)害的危害，苗木根系發(fā)達(dá)生長(zhǎng)健壯，比普通苗木生長(zhǎng)速度快、盛產(chǎn)期早、產(chǎn)量高、果實(shí)大且品質(zhì)高、整齊度好等，受到廣大橘農(nóng)推崇。因此，無(wú)病毒苗木的培育不僅是防治黃龍病的重要手段，也是提高柑橘產(chǎn)量和品質(zhì)，促進(jìn)柑橘產(chǎn)業(yè)發(fā)展的重要基礎(chǔ)和前提。

2 柑橘主要脫毒技術(shù)

目前柑橘脫毒技術(shù)主要有：莖尖嫁接，熱處理、化學(xué)藥劑處理以及近些年新出現(xiàn)的玻璃化法-超低溫脫毒技術(shù)等。

2.1 莖尖嫁接脫毒

柑橘莖尖嫁接技術(shù)已被證實(shí)可以脫除柑橘黃龍病等多種病害[14]，也是目前生產(chǎn)上用于獲得柑橘無(wú)病毒苗木比較常用的技術(shù)。主要依據(jù)病毒在植物體內(nèi)分布不均勻性原理，將頂端分生組織不帶毒區(qū)域切下并嫁接到健康砧木上進(jìn)行培育獲得無(wú)病毒植株。

自采用柑橘莖尖嫁接技術(shù)并用此法得到少量嫁接植株至今，已有很多人采用此法得到多種柑橘品種的無(wú)病毒植株，如Navarro等用此法成功培育出不含病毒的柑橘母本樹(shù)，并在生產(chǎn)上推廣種植無(wú)病毒苗，提高了柑橘品質(zhì)和產(chǎn)量[15]。后又有研究人員對(duì)此法進(jìn)行改進(jìn)和優(yōu)化，提高了嫁接成活率[16-18]。如José等[14]對(duì)柑橘莖尖嫁接脫毒技術(shù)進(jìn)行優(yōu)化，使病毒清除率提高到95%，莖尖成活率也達(dá)到50%以上[14]。陳毅群等[18]以 3個(gè)臍橙品種為試材進(jìn)行莖尖嫁接脫毒條件優(yōu)化，結(jié)果表明，以誘導(dǎo)離體枝條產(chǎn)生的不定芽進(jìn)行莖尖嫁接的嫁接苗萌發(fā)率顯著提高，同時(shí)也解決了因季節(jié)原因造成的少芽和無(wú)芽問(wèn)題。

采用莖尖嫁接法培育出的無(wú)病毒植株具有結(jié)果樹(shù)齡顯著縮短、無(wú)不良變異等特點(diǎn)，但莖尖嫁接法對(duì)試驗(yàn)條件以及操作人員的技術(shù)水平要求極高，操作困難，嫁接過(guò)程始終有病毒清除率與莖尖存活率不能兼得的問(wèn)題存在。

2.2 熱處理脫毒

熱處理脫毒利用病原體和寄主細(xì)胞對(duì)溫度耐受性不同的原理[2,17]，適當(dāng)溫度的加熱使植物組織中的病原菌鈍化或死亡，使植物組織細(xì)胞不含病毒或無(wú)病毒區(qū)域增大，再對(duì)無(wú)病毒的植物組織進(jìn)行后續(xù)培養(yǎng)成為安全的種質(zhì)或繁殖材料。

研究表明，對(duì)感染黃龍病的樹(shù)體或接穗進(jìn)行熱處理，能降低樹(shù)體或接穗中黃龍病菌含量并能在一定時(shí)間里保持無(wú)病狀態(tài)。如郭俊等[19]為清除尤力克檸檬接穗中的黃龍病菌進(jìn)行不同溫度、不同時(shí)間的熱水浸泡處理，結(jié)果表明熱水處理能有效清除黃龍病菌、接穗無(wú)褐化且嫁接發(fā)芽率高達(dá)93.0%。Hoffman等[17]在溫室中對(duì)感染黃龍病菌的柑橘幼苗進(jìn)行40～42℃連續(xù)熱處理至少48h后，經(jīng)檢測(cè)熱處理能顯著降低或完全消除柑橘幼苗中黃龍病菌；之后對(duì)感染黃龍病的葡萄柚、甜橙、檸檬以及柚子的休眠芽進(jìn)行為期 4個(gè)月的熱處理，得到24個(gè)經(jīng)熱處理的休眠芽中只有3個(gè)在12月后呈現(xiàn)黃龍病陽(yáng)性，而21個(gè)未進(jìn)行熱處理的休眠芽有11個(gè)表現(xiàn)陽(yáng)性，而且熱處理對(duì)休眠芽的萌發(fā)沒(méi)有明顯影響。

雖然熱處理對(duì)黃龍病菌有一定的抑制作用，但柑橘黃龍病的熱處理脫毒與熱處理時(shí)間、溫度以及柑橘品種有關(guān)[17]，苗木或接穗經(jīng)熱處理后可能出現(xiàn)干枯、不出芽、死亡等情況，甚至有些樹(shù)在兩至三年后又重新出現(xiàn)病狀[17,19]，而且整株苗木進(jìn)行熱處理，耗費(fèi)大，操作繁瑣。目前，熱處理常作為一種預(yù)處理方式與莖尖嫁接結(jié)合脫除柑橘病毒。

2.3 化學(xué)藥劑處理脫毒

化學(xué)藥劑脫毒主要利用植物病菌對(duì)一些抗菌素的敏感性，抗菌素使病菌鈍化或死亡，從而抑制樹(shù)體病菌的繁殖和擴(kuò)散，達(dá)到脫毒效果。

關(guān)于化學(xué)藥劑處理清除柑橘黃龍病菌的研究已經(jīng)取得不小進(jìn)步。祁鵬志[20]對(duì)10個(gè)柑橘品種的莖尖用20 mg/L病毒唑處理10 min，后經(jīng)嫁接培養(yǎng)得到莖尖嫁接苗，經(jīng)PCR檢測(cè)，結(jié)果均不含黃龍病菌。近年來(lái)，科研人員又對(duì)抑制柑橘黃龍病菌的候選藥劑展開(kāi)篩選研究，并得到很多能不同程度抑制黃龍病菌繁殖的藥劑[21]。如Zhang等[22]采用嫁接法從五種化合物中快速篩選有效抑制黃龍病的潛在藥物，得到青霉素和鏈霉素混合物最能有效清除接穗中的黃龍病菌。之后Zhang等[21]又采用同樣方法從31種抗生素類(lèi)抗菌劑中系統(tǒng)篩選對(duì)抑制黃龍病菌有效的藥物，得到氨芐西林、卡比西林、青霉素、頭孢氨芐、利福平、磺胺二甲氧嘧啶等多種抗生素均能有效地消除或抑制接穗中的黃龍病菌。

四環(huán)素、鏈霉素等抗生素類(lèi)藥物雖能使黃龍病菌鈍化或部分死亡，但不能將其徹底根除，而且頻繁使用不僅增加生產(chǎn)成本，還可能導(dǎo)致抗藥菌的產(chǎn)生，對(duì)人類(lèi)健康也存在潛在副作用[21,23]。隨著抗生素對(duì)公眾健康構(gòu)成的巨大挑戰(zhàn)，人們著手在非抗生素藥物以及離子或納米顆粒中展開(kāi)研究。Yang等[24]采用優(yōu)化的嫁接技術(shù)從39種非抗生素抗菌藥物中，系統(tǒng)篩選得到8種（氫氧化鋁、D,L-丁硫氨酸亞砜胺、尼古丁、枯草芽孢桿菌表面活性劑、銀達(dá)因、膠體銀、EBI-601和EBI-602）有效消除或抑制黃龍病菌的非抗生素類(lèi)抗菌劑，并被批準(zhǔn)應(yīng)用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)。Jose等[25]對(duì)銀納米粒子殺滅黃龍病菌的能力進(jìn)行測(cè)試，結(jié)果得銀納米粒子能降低樹(shù)體內(nèi)黃龍病菌的濃度且殺菌能力顯著高于β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素。這些非抗生素類(lèi)抗菌劑、新型銀納米粒子等可作為清除黃龍病菌獲得無(wú)病毒苗的潛在候選藥物。

2.4 玻璃化法-超低溫脫毒

玻璃化法-超低溫脫毒是建立在玻璃化法-超低溫保存基礎(chǔ)上的一種新型脫毒技術(shù)，依據(jù)病毒在植物體內(nèi)分布不均勻的原理，在液氮提供的-196℃超低溫環(huán)境下對(duì)含有病毒的分化細(xì)胞進(jìn)行破壞，而不含病毒或病毒含量少的頂端分生組織在一定條件下恢復(fù)生長(zhǎng)，達(dá)到脫去植物病毒的目的[26]。

研究表明，柑橘莖尖經(jīng)玻璃化法-超低溫技術(shù)保存后可再生成完整植株[27,28]。Ding等[29]采用玻璃化法-超低溫保存技術(shù)從 5種不同品種的柑橘試管苗中成功清除黃龍病病菌，經(jīng)后續(xù)培養(yǎng)得到健康植株，該方法的莖尖存活率達(dá)到76%以上，病毒清除率高達(dá)98.1%，而且該技術(shù)對(duì)莖尖大小要求不嚴(yán)格，莖尖大小在 1.5mm左右即可，降低了對(duì)操作技術(shù)的要求。曹慶等[30]研究表明，即使采用2.0～2.5 mm大小的柑橘莖尖，病毒清除率也能達(dá)到88.2%及以上。作為一種新型脫毒技術(shù)，玻璃化法-超低溫處理在柑橘脫毒方面具有很好的應(yīng)用前景。

2.5 其他脫毒技術(shù)

此外，化學(xué)處理協(xié)同熱處理與莖尖嫁接技術(shù)結(jié)合，可獲得較好的脫毒效果。如陳傳紅等[31]在莖尖嫁接培育柑橘脫毒苗時(shí)，采用40℃高溫對(duì) 0.6 mm的莖尖進(jìn)行處理，后經(jīng)莖尖嫁接獲得的嫁接苗脫毒率高達(dá)93.21%，成活率亦達(dá)到63.32%，提高了莖尖嫁接脫毒效率。Yang等[32]用磺胺類(lèi)抗生素清除柑橘黃龍病的同時(shí)進(jìn)行45℃熱處理，表明45℃高溫處理可以增強(qiáng)柑橘的活力，促進(jìn)根的生長(zhǎng)，與單獨(dú)熱處理或抗生素處理相比，45℃高溫處理結(jié)合抗生素處理顯著降低幼苗中黃龍病菌含量，也說(shuō)明協(xié)同作用比單獨(dú)的熱處理或藥劑處理效果更好。熱處理和化學(xué)藥劑與莖尖嫁接技術(shù)結(jié)合可提高脫毒成功率，主要是溫度、化學(xué)藥劑對(duì)感病接穗的預(yù)處理抑制了病毒繁殖和擴(kuò)散，熱處理同時(shí)也提高了樹(shù)體對(duì)化學(xué)藥劑的吸收和利用效率，使長(zhǎng)出的嫩芽莖尖生長(zhǎng)點(diǎn)無(wú)毒區(qū)域相應(yīng)變大，一定程度上降低莖尖嫁接過(guò)程對(duì)技術(shù)的要求，提高了病毒清除率和莖尖成活率。

除以上脫毒方法，還有珠心苗培育、愈傷組織等，通過(guò)培育珠心組織獲得無(wú)病毒苗木是柑橘脫毒最早使用的一種方法。但經(jīng)珠心組織培育出的植株易發(fā)生變異成為變異品種，缺乏實(shí)際生產(chǎn)價(jià)值。再者，對(duì)于像紅美人、由良等優(yōu)良無(wú)核柑橘品種，因花粉完全敗育，沒(méi)有種子形成，通過(guò)實(shí)生播種獲得珠心苗比較困難，因此生產(chǎn)上較少采用此法進(jìn)行無(wú)病毒苗的培養(yǎng)。

3 展望

柑橘產(chǎn)業(yè)受黃龍病的影響，對(duì)其防治刻不容緩，而栽種無(wú)病毒苗木是預(yù)防黃龍病傳播的必要手段之一，因此需要迫切地建立一套高效、簡(jiǎn)便、周期短的柑橘無(wú)病毒苗繁育體系。

在培育脫毒苗方面，科研人員付出很多努力，得到一些較好的培育方法。但也存在一定問(wèn)題：(1)莖尖嫁接法脫除黃龍病菌對(duì)操作人員的技術(shù)水平要求極高，嫁接過(guò)程始終存在病毒清除率與莖尖存活率不能兼得的問(wèn)題；(2)雖然如今研究得到的化學(xué)藥劑一定程度上使黃龍病菌鈍化，但不能將其徹底根除，仍沒(méi)有找到一種徹底殺死黃龍病菌的特效藥；(3)柑橘玻璃化法-超低溫脫毒技術(shù)具有高效、簡(jiǎn)便、脫毒效率高等優(yōu)點(diǎn)，但仍沒(méi)有建立起一套完整適用于生產(chǎn)的柑橘玻璃化法-超低溫脫毒技術(shù)體系，需要加強(qiáng)該方面研究；(4)現(xiàn)在脫毒苗的生產(chǎn)周期較長(zhǎng)，一般條件下一個(gè)品種的脫毒至少需要兩年；(5)不僅要加強(qiáng)無(wú)病毒苗木培育的研究，還要加大生物技術(shù)在柑橘抗病品種培育中的應(yīng)用，如利用基因編輯CRISPR/Cas 9、轉(zhuǎn)基因等技術(shù)，培育對(duì)黃龍病抗病品種，全面推動(dòng)柑橘產(chǎn)業(yè)的健康發(fā)展。