結(jié)核性腦膜炎診斷方法研究進展

王樂樂 郭建瓊 楊松 唐神結(jié)

結(jié)核性腦膜炎(tuberculous meningitis，TBM)是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核病類型[1]，也是肺外結(jié)核最嚴重的形式，約占全球結(jié)核病發(fā)病數(shù)的1%[2]，占我國肺外結(jié)核發(fā)病數(shù)的7.23%[3]，但不同地區(qū)診治現(xiàn)狀差異較大。TBM常以非特異性癥狀起病，急緩、輕重不一，雖腦脊液(cerebrospinal fluid，CSF)指標(biāo)變化明顯，且多伴局灶性神經(jīng)系統(tǒng)癥狀體征[4]，但不具有特異性，不能僅依靠臨床癥狀和影像學(xué)表現(xiàn)確診。并且，由于實驗室檢測技術(shù)對TBM檢測敏感度低、耗時長，導(dǎo)致患者通常早期即接受經(jīng)驗性治療，易致治療延誤，死亡率高達30%～40%，神經(jīng)性致殘率高達50%，甚至終生殘疾[5-7]。筆者擬對TBM的實驗室診斷、組織病理學(xué)診斷、影像學(xué)診斷等方法的研究進展進行綜述，以供臨床醫(yī)師參考。

一、TBM診斷存在的問題

傳統(tǒng)的TBM診斷策略是根據(jù)結(jié)核病的發(fā)病率、流行病學(xué)、體格檢查、血液和CSF分析等進行疑似TBM診斷[8]。但其臨床特征及傳統(tǒng)實驗室檢測方法存在諸多問題。

TBM是結(jié)核分枝桿菌(Mycobacteriumtuberculosis，MTB)侵犯蛛網(wǎng)膜下間隙導(dǎo)致的亞急性或慢性腦膜炎癥，不具有典型臨床表現(xiàn)，易與其他形式的中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核病相混淆，如結(jié)核瘤和結(jié)核性腦膿腫[9]；尤其是老年TBM患者，通常需結(jié)合既往病史、實驗室檢測及診斷性抗結(jié)核治療有效而確診。葛向華等[10]分析了3例不典型TBM患者，發(fā)現(xiàn)其起病初期均無神經(jīng)系統(tǒng)受累表現(xiàn)，僅出現(xiàn)不明原因發(fā)熱，血常規(guī)均正常，結(jié)核菌素皮膚試驗和CSF抗酸染色均陰性，抗感染治療也無效，頸腰椎穿刺提示顱壓高，CSF中葡萄糖和氯化物降低、蛋白增加，但其改變也不典型，經(jīng)診斷性抗結(jié)核治療有效而確診。

目前，尚缺乏高敏感度和高特異度的單一診斷TBM的檢測技術(shù)。傳統(tǒng)的TBM檢測方法包括抗酸桿菌涂片鏡檢和分枝桿菌培養(yǎng)。涂片鏡檢雖耗時短、應(yīng)用廣泛，但敏感度僅為10%～15%[11-12]。MTB培養(yǎng)雖更敏感(50%～60%)，但耗時長，難以滿足臨床及時性的需求[12-14]；又由于CSF中的MTB載量較低，且培養(yǎng)前的經(jīng)驗性治療更進一步降低了MTB載量，常難以檢出或呈現(xiàn)假陰性，加之標(biāo)本獲取困難，尤其是兒童患者，這些均是目前TBM診斷困難的重要原因[15-17]。

二、TBM實驗室檢測

目前，常用的實驗室檢測方法包括分枝桿菌萋-尼抗酸染色鏡檢、BACTEC MGIT 960(簡稱“MGIT 960”)培養(yǎng)、生化診斷、免疫學(xué)診斷、核酸擴增技術(shù)、基因測序技術(shù)。《2019中國中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核病診療指南》對于疑似中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核病患者，推薦行CSF的MTB快速核酸檢測[如超敏利福平耐藥基因檢測(GeneXpert MTB/RIF Ultra，簡稱“Xpert Ultra”)、環(huán)介導(dǎo)等溫擴增試驗(loop mediated isothermal amplification assay，LAMP)等]、抗酸桿菌涂片鏡檢及MGIT 960培養(yǎng)；對于不能明確診斷的患者，可行多次檢查以提高陽性率(強烈推薦)；當(dāng)CSF送檢MTB病原學(xué)標(biāo)本量不足時，可優(yōu)先送快速核酸檢測(推薦)[4]。這提示傳統(tǒng)的分枝桿菌萋-尼抗酸染色鏡檢和核酸擴增技術(shù)(如Xpert 和Xpert Ultra)均可用于TBM的快速診斷[8]。目前，在改良萋-尼抗酸染色鏡檢、脂阿拉伯甘露聚糖(lipoarabinomannan，LAM)抗原檢測和Xpert Ultra檢測方面均有較新進展。

(一)MGIT 960培養(yǎng)

MGIT 960培養(yǎng)仍然是確診TBM的金標(biāo)準(zhǔn)[18-19]。Krishnakumariamma等[20]發(fā)現(xiàn)，以MGIT 960培養(yǎng)結(jié)果為參照標(biāo)準(zhǔn)，Xpert檢測CSF標(biāo)本中MTB的敏感度和特異度分別為72.7%和98.5%，且MGIT 960檢出的3株耐異煙肼(INH)的MTB中有2株經(jīng)線性探針檢測(line probe assay，LPA)顯示對INH耐藥，1株耐多藥菌株經(jīng)Xpert檢測為利福平耐藥假陰性。因此，Xpert檢測陰性樣本仍應(yīng)進行MGIT 960培養(yǎng)以排除TBM。

(二)改良萋-尼抗酸染色鏡檢

改良萋-尼抗酸染色鏡檢CSF在結(jié)合患者臨床癥狀、CSF細胞組成、生化結(jié)果和微生物檢測的基礎(chǔ)上可臨床診斷TBM及提供TBM免疫監(jiān)測，有助于早期診斷、最佳治療和改善預(yù)后[21]。但目前的研究結(jié)果尚存在較大差異。如2014年我國報道傳統(tǒng)和改良萋-尼抗酸染色鏡檢對TBM的檢測敏感度為3.3%和82.9%[22]，但Heemskerk等[23]在一項大型前瞻性、國際多中心研究中發(fā)現(xiàn)，傳統(tǒng)和改良萋-尼抗酸染色鏡檢檢測CSF標(biāo)本用于診斷TBM的敏感度分別為33.9%和34.5%，差異無統(tǒng)計學(xué)意義。因此，尚不能明確改良萋-尼抗酸染色鏡檢是否存在優(yōu)勢，但可在檢測敏感度更佳的診斷方法出現(xiàn)前，充分利用現(xiàn)有檢測手段，通過擴大CSF的檢測量來優(yōu)化檢測結(jié)果。

(三)生化診斷

腺苷脫氨酶(adenosine deaminase，ADA)在機體組織中(主要在胸腺、脾和其他淋巴組織)分布廣泛，在血液中(紅細胞和T淋巴細胞)含量豐富[24]。對CSF-ADA的活性檢測是一種簡單、快速和穩(wěn)定的方法，可用于早期鑒別TBM和其他原因的腦膜炎，利于及時治療和改善預(yù)后。

TBM患者CSF-ADA水平隨有效抗結(jié)核治療時間的延長而明顯降低，且呈動態(tài)變化，有助于評價抗結(jié)核治療的效果及判斷患者病情變化。陳顏強等[25]依據(jù)英國醫(yī)學(xué)研究委員會對TBM的分期標(biāo)準(zhǔn)發(fā)現(xiàn)，Ⅲ期患者的CSF-ADA水平明顯高于Ⅰ期患者(P<0.05)，且隨著治療時間的延長CSF-ADA 水平逐漸降低，與史君華等[26]研究結(jié)果一致。另外，Chan等[19]研究顯示，TBM患者的CSF-ADA活性水平[(8.6±2.1) IU/L]明顯高于非TBM患者[(2.8±5.9) IU/L]，在最佳診斷截斷值為5.1 IU/L時的敏感度和特異度分別為100%和91%，但目前診斷臨界值仍存在爭議。

(四)免疫學(xué)診斷

外周血結(jié)核感染T細胞斑點試驗(T-SPOT.TB)可測定MTB在特異性抗原刺激下外周血γ-干擾素(IFN-γ)釋放效應(yīng)T細胞的數(shù)量[27]。該試驗可及時捕獲細胞因子，排除免疫狀態(tài)和卡介苗接種的影響，敏感度和特異度均較高[28]，已成為診斷TBM的可靠輔助參考指標(biāo)之一。

張新寶等[27]研究顯示，外周血T-SPOT.TB診斷TBM的敏感度為82.3%，明顯高于檢測CSF-ADA(61.3%)、MTB-DNA(27.4%)和抗酸桿菌涂片鏡檢(16.1%)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.01)；且4種檢測方法的受試者工作特征(ROC)曲線下面積(AUC)分別為0.815、0.661、0.637、0.581，提示外周血T-SPOT.TB診斷TBM的效能最高。王鑫和買爾旦·阿不來[29]研究發(fā)現(xiàn)，T-SPOT.TB與IFN-γ聯(lián)合檢測的敏感度、特異度、陰性預(yù)測值、陽性預(yù)測值均明顯高于T-SPOT.TB和IFN-γ單項檢測(P值均<0.05)；且TBM患者的CSF均呈“混合淋巴細胞反應(yīng)”，與化膿性(中性粒細胞為主)和病毒性腦膜炎(淋巴樣細胞反應(yīng))患者明顯不同，有助于鑒別診斷。陳宇和姚素艷[30]研究發(fā)現(xiàn)，Xpert和T-SPOT.TB聯(lián)合檢測CSF標(biāo)本診斷TBM的陽性率均明顯高于非TBM的結(jié)核病患者，且兩種方法并聯(lián)診斷TBM的敏感度最高(78.57%)，準(zhǔn)確度達71.00%；而兩種方法串聯(lián)及Xpert單獨檢測TBM的特異度均高達100.00%，無誤診。

(五)核酸擴增(nucleic acid amplification test，NAAT)技術(shù)

1.數(shù)字聚合酶鏈反應(yīng)(digital PCR，dPCR)：是通過定量檢測CSF中MTB插入序列IS6110來提高對TBM的診斷能力，是快速和敏感的分子檢測方法。Li等[31]研究發(fā)現(xiàn)，IS6110-dPCR法的敏感度[57.4%(95%CI：44.8%～69.3%)]明顯高于旋轉(zhuǎn)酶B亞基(gyrase subunit B，gyrB)-dPCR法[22.1%(95%CI：12.9%～33.8%)](P<0.05)，但特異度 [分別為97.0%(95%CI：84.2%～99.9%)、100.0%(95%CI：89.4%～100.0%)]差異無統(tǒng)計學(xué)意義。IS6110-dPCR的敏感度也明顯高于CSF涂片鏡檢(6.7%)、MTB培養(yǎng)(12.5%)、IS6110定量PCR(quantitative PCR，qPCR；21.9%)和Xpert(29.6%)，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.05)。

2.Xpert、Xpert Ultra、LAM與LPA：Xpert和Xpert Ultra 均是WHO推薦的快速分子檢測技術(shù)[32]。Xpert檢測操作簡單，可在2 h內(nèi)獲得結(jié)果，已在全球廣泛應(yīng)用。以MGIT 960液體培養(yǎng)為參照標(biāo)準(zhǔn)，Xpert檢測CSF標(biāo)本用于診斷TBM的敏感度和特異度分別為72.7%和98.5%，具有高特異度、中等敏感度和快速診斷特點，可作為早期診斷TBM的方法，在分子診斷中具有重要地位[33]，但由于其陰性預(yù)測值為84%，故建議對陰性樣本進一步行MGIT 960培養(yǎng)或LPA以排除TBM[12,20]。Kay等[32]的系統(tǒng)綜述發(fā)現(xiàn)，Xpert檢測<15歲TBM患兒CSF的敏感度和特異度分別為54.0%(95%CI：27.8%～78.2%)和93.8%(95%CI：84.5%～97.6%)，但納入研究的可信度較低，對于疑似TBM患兒，治療方法和療程應(yīng)基于所有的臨床信息，不應(yīng)僅依靠Xpert檢測結(jié)果。

Xpert Ultra彌補了Xpert在結(jié)核病診斷方面的局限性，提高了診斷的敏感度和可靠性。其體外檢測下限由Xpert的100～120菌落形成單位(CFU)/ml下降至約16 CFU/ml，與MTB培養(yǎng)相似(約10 CFU/ml)[34]。雖然Xpert Ultra陰性結(jié)果亦不能排除TBM，但與其他實驗室診斷方法比較，Xpert和Xpert Ultra仍對TBM具有較高的診斷價值，特別是Xpert Ultra可使TBM的確診率從36%增加到51%，已被推薦為診斷TBM的首選檢測技術(shù)[31]，可替代Xpert檢測[35]。Bahr等[13]研究表明，Xpert Ultra診斷HIV感染與疑似TBM共病患者的敏感度為95%，確診TBM的敏感度為95.5%(95%CI：77%～99%)，高于Xpert[45%(95%CI：24%～68%)]和MTB培養(yǎng)[45%(95%CI：24%～68%)]；Xpert Ultra、Xpert和MTB培養(yǎng)對可能和高度疑似TBM患者的診斷敏感度分別為70%(95%CI：47%～87%)、43%(95%CI：23%～66%)和43%(95%CI：23%～66%)。Huang等[36]發(fā)現(xiàn)，Xpert Ultra、Xpert和MTB培養(yǎng)診斷TBM的特異度均為100%，均可準(zhǔn)確診斷耐藥患者，且Xpert Ultra診斷TBM的敏感度(45%)明顯高于Xpert(28%)和MTB培養(yǎng)(18%)。

以CSF中MTB培養(yǎng)陽性為參照標(biāo)準(zhǔn)，LAM抗原檢測診斷TBM的敏感度僅為21.9%[37]。對可能和高度疑似TBM患者的CSF行新型即時護理尿脂阿拉伯甘露聚糖試驗(Fujifilm SILVAMP TB LAM，F(xiàn)ujiLAM)的檢測敏感度為52%，特異度為98%[38]，與Xpert Ultra檢測的敏感度(55%)接近，而Alere Determine TB LAM Ag (簡稱“Alere LAM”)檢測的敏感度僅為14%。故在Xpert Ultra不可行的情況下可使用FujiLAM替代[38]。

Xpert Ultra和LAM檢測方法使診斷TBM進入了快速診斷和早期治療的新時代，但Xpert Ultra不能作為診斷TBM的單一診斷方法，應(yīng)謹慎據(jù)此排除TBM?；谀壳霸\斷方法的局限性，聯(lián)合患者臨床癥狀、影像學(xué)特征和其他實驗室指標(biāo)等多種方法對診斷TBM仍非常必要[2,39]。

(六)測序技術(shù)

1.二代測序(next generation sequencing，NGS)：CSF-NGS 可用于常規(guī)篩查MTB陰性患者，以提高病原學(xué)檢出率[4]，且在CSF常規(guī)檢查結(jié)果不典型的情況下，有助于早期精準(zhǔn)診斷TBM。錢喬喬等[40]對5例TBM患兒行CSF-NGS 檢查得到MTB序列，但有2例最初常規(guī)檢查中為假陰性。林愛清等[41]以傳統(tǒng)診斷方法為參照標(biāo)準(zhǔn)，發(fā)現(xiàn)CSF-NGS對CSF 分枝桿菌涂片、培養(yǎng)及MTB核酸PCR檢測等傳統(tǒng)檢測陰性患者的檢測敏感度為63.6%；以臨床診斷為參照標(biāo)準(zhǔn)，CSF-NGS和傳統(tǒng)檢測方法檢測的敏感度分別為58.8%和29.4%，特異度均為100%，但與Xpert差異無統(tǒng)計學(xué)意義。Yu等[42]系統(tǒng)分析了宏基因組CSF-NGS對TBM的診斷價值，結(jié)果顯示其診斷TBM的敏感度為27%～84%，特異度為96%～100%，AUC提示診斷效果良好，可作為TBM的早期診斷方法，但各研究異質(zhì)性差異明顯，故應(yīng)謹慎根據(jù)宏基因組NGS檢測結(jié)果進行診治，但其對亞急性和慢性腦膜炎的診斷仍具有非常好的應(yīng)用前景[15]。另外，NGS存在以下局限：首先，NGS雖能準(zhǔn)確檢測病原體DNA類型，但對病原體RNA類型仍需進一步探索；其次，NGS的檢測費用目前仍相對較高，限制其臨床使用；再次，NGS無法確定MTB是否耐藥，無法檢測耐藥菌株。

2.焦磷酸測序：是第一代基因型檢測方法，可以在6 h內(nèi)檢測出MTB突變，直接診斷TBM，并可提供廣泛耐藥突變信息，有助于早期確定治療決策。Ajbani等[43]研究顯示，焦磷酸測序檢測CSF診斷TBM的敏感度 [98.11%(95%CI：89.93%～99.95%)]明顯高于Xpert和MGIT 960培養(yǎng)[分別為43.39%(95%CI：29.83%～57.72%)和61.04%(95%CI：55.31%～66.48%)]，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P值均<0.01)，且焦磷酸測序的耐藥檢測結(jié)果與表型藥物敏感性試驗和Xpert耐藥檢測結(jié)果的符合率分別為91.30%和95.45%。

三、TBM的影像學(xué)診斷

中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核病最常見類型為TBM，其主要影像學(xué)特征為基底池腦膜強化、腦梗塞、腦積液和結(jié)核瘤，可單獨或聯(lián)合發(fā)生，顱底腦膜強化伴或不伴結(jié)核瘤是TBM最常見且特異性較高的征象。神經(jīng)系統(tǒng)影像學(xué)檢查對中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核病的診斷發(fā)揮了重要作用[44]。《2019中國中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核病診療指南》[4]推薦在治療前及治療后48 h對疑似中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核病患者進行頭顱MRI增強或CT增強掃描，以診斷疾病、評估手術(shù)適應(yīng)證和監(jiān)測治療應(yīng)答；強烈推薦行胸部CT及其他部位的影像學(xué)檢查以查找神經(jīng)系統(tǒng)外的可疑活動性結(jié)核病灶，以作為臨床診斷依據(jù)或進一步病原學(xué)診斷的采樣部位。

四、TBM的輔助診斷

1.病理診斷：TBM患者中樞神經(jīng)系統(tǒng)可發(fā)生多種病理性改變，包括炎性滲出、肉芽腫性病變、閉塞性血管炎、結(jié)核瘤或膿腫等[45]。其中，77%的TBM患者發(fā)生腦動脈炎，61.8%血管異常改變的TBM患者會出現(xiàn)腦梗塞及腦積液[46-47]。Sharifi等[48]報道了全球首例卡介苗接種后誘發(fā)腦結(jié)核瘤的患兒，該患兒在出生6個月時出現(xiàn)惡心、嘔吐、納差和昏迷，顱腦MRI發(fā)現(xiàn)松果體內(nèi)一巨大團塊及腦積液，外科手術(shù)取病理組織行PCR，確定為牛分枝桿菌感染，抗結(jié)核治療效果較好。故對有卡介苗接種史的嬰幼兒應(yīng)警惕腦結(jié)核瘤的出現(xiàn)。另有報道18例誤診為垂體腺瘤的患者(僅有1例影像學(xué)檢查結(jié)果為疑似結(jié)核瘤)，其中5例患者存在泛垂體功能低下征，3例催乳素水平升高；6例蝶鞍及蝶竇均受累；1例患者的病灶從鞍座延伸至斜坡；3例有肺結(jié)核病史。患者臨床癥狀持續(xù)15 d至2年，最常見癥狀為頭痛、視力下降或失明，組織病理學(xué)檢查均顯示病灶由垂體腺瘤和結(jié)核瘤組成，診斷為鞍內(nèi)結(jié)核瘤。這提示當(dāng)影像學(xué)顯示副鼻竇和垂體窩受累及垂體增厚且同時發(fā)生斜坡(由顱骨的枕大孔向上至背鞍)時也應(yīng)懷疑TBM，并建議進一步行組織病理學(xué)檢查[49]。

2.臨床診斷：《2019中國中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核病診療指南》推薦在缺乏病原學(xué)診斷依據(jù)的情況下，應(yīng)綜合臨床表現(xiàn)、CFS表現(xiàn)、影像學(xué)表現(xiàn)和其他部位結(jié)核的臨床診斷評分進行中樞神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)核病臨床診斷，其中評分≥12分或≥10分(無法進行影像學(xué)檢查時)為高度疑似，評分在6～11分或6～9分(無法進行影像學(xué)檢查時)為疑似患者(推薦強度低)[4]。

TBM臨床癥狀及體征表現(xiàn)多樣，多以亞急性起病為主，且顱神經(jīng)損傷、頭痛、意識障礙、頸項強直、克氏征(Kernig征)、布氏征(Brudzinski征)、巴賓斯基征(Babinski征)等不典型表現(xiàn)[45]的發(fā)生率均較高，但精神癥狀、癲癇發(fā)作的發(fā)生率均低于病毒性腦膜炎患者[50]。因此，臨床診療應(yīng)綜合臨床癥狀、影像學(xué)特征、血清免疫學(xué)指標(biāo)、血生化檢測結(jié)果、CSF涂片和培養(yǎng)、組織病理和抗結(jié)核治療反應(yīng)等表現(xiàn)[30]，CSF細胞外觀、ADA活性、乳酸脫氫酶、隱球菌抗原水平等也可作為重要鑒別參數(shù)[11]。

五、總結(jié)

目前，TBM的診斷仍基于傳統(tǒng)的臨床表現(xiàn)、影像學(xué)和實驗室檢查等進行評估，并對病原學(xué)不明確的TBM采用二代測序鑒定。雖然TBM的診斷研究在不斷發(fā)展，Xpert Ultra診斷TBM的準(zhǔn)確度和敏感度也獲得了進一步提高，但Xpert Ultra檢測陰性仍不能完全排除TBM。為進一步提高確診率，目前的研究建議：(1)若出現(xiàn)腦膜炎癥狀超過5 d，出現(xiàn)局灶性神經(jīng)功能缺損，應(yīng)懷疑TBM[51]。(2)胸部X線攝影顯示粟粒性結(jié)核病或肺結(jié)核，腦部X線攝影顯示腦梗塞、基底腦膜強化或腦積液，應(yīng)懷疑TBM。(3)重點采集CSF和增加CSF采集量(>6 ml)，最大化檢測樣本中的MTB菌量，經(jīng)3000×g離心15 min可提高診斷敏感度[12]。(4)如果CSF檢測失敗，應(yīng)對其他可能涉及的部位進行診斷性檢測，以尋找病原學(xué)證據(jù)。如痰液Xpert或尿液TB-LAM檢測[39]。(5)當(dāng)CSF表現(xiàn)為以淋巴細胞為主、低血糖、高蛋白等特點時，通常見于TBM，但應(yīng)注意排除免疫抑制患者隱球菌性腦膜炎的可能[52]。(6)對常規(guī)抗生素治療無效或診斷不明確的患者可在48～72 h后行重復(fù)腰椎穿刺，可能對提高確診率具有一定的臨床應(yīng)用價值[39]。

2021年1月，世界衛(wèi)生組織發(fā)布的NAAT檢測結(jié)核病和耐藥結(jié)核病的快速通訊表明：通過低、中、高復(fù)雜度自動化NAAT檢測痰標(biāo)本、呼吸道樣本和MTB菌株對不同藥物的耐藥性是高度準(zhǔn)確的[53]。但目前尚無以CSF為樣本行上述三類NAAT的研究，宿主生物標(biāo)志物和CSF抗原檢測可能在TBM診斷中具有一定的發(fā)展前景。