枸杞葉多糖提取工藝優(yōu)化及其緩解小鼠過敏性鼻炎的研究

趙嘉慶，肖靜，史春麗，王立英， 何斌，高小平

1(寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院 耳鼻咽喉頭頸外科，寧夏 銀川，750004)2(寧夏回族自治區(qū)醫(yī)學(xué)科學(xué)研究所，寧夏 銀川，750004) 3(寧夏醫(yī)科大學(xué) 基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，寧夏 銀川，750004)4(寧夏森淼枸杞科技開發(fā)有限公司，寧夏 銀川 750000)

過敏性鼻炎(allergic rhinitis,AR)是世界上最常見的慢性炎癥性疾病之一，嚴(yán)重影響個(gè)人生活質(zhì)量。數(shù)據(jù)顯示，過敏性鼻炎影響著世界上10%～40%的人口[1]。在一些西方國家，大約有900萬人深受其害，它嚴(yán)重?fù)p害睡眠質(zhì)量和認(rèn)知功能，使人變得易怒和疲勞，降低人們的生活質(zhì)量和工作學(xué)習(xí)表現(xiàn)[2-3]。作為一種過敏性疾病，AR是由免疫球蛋白E(immunoglobulins E，IgE)介導(dǎo)的適應(yīng)性免疫應(yīng)答引起的，淋巴細(xì)胞，肥大細(xì)胞，嗜酸性細(xì)胞之間復(fù)雜的相互作用在其發(fā)生發(fā)展中均發(fā)揮著作用，多種炎性細(xì)胞浸潤為AR的主要特征[4-5]。Th1/Th2細(xì)胞比例失衡被認(rèn)為是過敏性疾病發(fā)病的重要誘因之一[6]。當(dāng)易感人群暴露于過敏原時(shí)，Th2細(xì)胞分泌IL-4，B細(xì)胞產(chǎn)生IgE,嗜酸性粒細(xì)胞活化釋放一系列促炎因子引起以鼻部癥狀為特征的疾病，臨床上主要表現(xiàn)為鼻塞、打噴嚏、鼻癢和流鼻涕等癥狀[7-8]。有研究表明糖皮質(zhì)激素是控制這種過敏性疾病炎癥方面最有效的藥物，雖然激素在減輕炎癥方面效果顯著，但是它強(qiáng)大的抗炎作用往往也帶來了嚴(yán)重的副作用[9]。故而在緩解炎癥的同時(shí)尋求新的、溫和的治療手段來治療AR尤為迫切。

枸杞是一種傳統(tǒng)的中藥，同時(shí)還作為食品補(bǔ)充劑普遍應(yīng)用于人們的日常保健[10]。它富含枸杞多糖、甜菜堿、酚類、類胡蘿卜素、腦苷、黃酮和維生素等多種物質(zhì)，其中枸杞多糖是枸杞的主要活性成分[11]。有文獻(xiàn)報(bào)道從枸杞果中提取的多糖可能與枸杞具有抗氧化、抗衰老、神經(jīng)保護(hù)、細(xì)胞保護(hù)、免疫調(diào)節(jié)等多種生物活性有關(guān)[12]。在一項(xiàng)實(shí)驗(yàn)研究中表明LBP對(duì)環(huán)磷酰胺(cyclophosphamide，CTX)誘導(dǎo)的小鼠具有免疫調(diào)節(jié)作用，枸杞多糖能保護(hù)免疫器官(提高免疫器官指數(shù)，減輕免疫器官損傷)，促進(jìn)免疫相關(guān)細(xì)胞因子的產(chǎn)生，增強(qiáng)宿主免疫系統(tǒng)[13]。本實(shí)驗(yàn)主要以達(dá)到枸杞葉多糖最佳提取得率為目的，優(yōu)化枸杞葉多糖的提取工藝，并探究LBP對(duì)過敏性鼻炎小鼠的免疫調(diào)節(jié)作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物、材料與試劑

1.1.1 動(dòng)物

30只雌性C57BL/6小鼠(購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物公司)，經(jīng)過1周檢疫期后，飼養(yǎng)于寧夏醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心SPF級(jí)的動(dòng)物房中，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物均符合動(dòng)物倫理委員會(huì)的要求。

1.1.2 材料與試劑

寧杞9號(hào)天精菜，森淼公司；卵清蛋白(ovalbumin，OVA), Sigma公司；氫氧化鋁凝膠, Thermo公司；HE染色試劑盒、PAS染色試劑盒、MPO染色試劑盒、甲苯胺藍(lán)染色試劑盒，北京博奧拓達(dá)科技有限公司；紅細(xì)胞裂解液、異硫氰酸熒光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)標(biāo)記的CD4、別藻藍(lán)蛋白(allophycocyanin,APC)標(biāo)記的CD3、藻紅蛋白(phycoerythrin,PE)標(biāo)記的IL-4、多甲藻黃素-葉綠素蛋白-花青素5.5(peridinin-chlorophyll-protein complex-cyanine 5.5，PerCP-Cy5.5)標(biāo)記的IFN-γ，Biolegend。

1.2 儀器與設(shè)備

LDZX-75KBS蒸汽滅菌高壓鍋，山東博科科學(xué)儀器有限公司；SJ-CJ-2FD超凈工作臺(tái)，蘇潔醫(yī)療有限公司；BX43光學(xué)顯微鏡,深圳市三利化學(xué)品有限公司；TS-NS-300中試水提醇沉設(shè)備，上海順儀實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司；710-ES等離子體發(fā)射光譜儀，美國瓦里安；UPT-I-40L超純水器，成都優(yōu)普；BD FACS Celesta流式細(xì)胞儀，美國BD Biosciences。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 枸杞葉多糖的提取工藝

本次實(shí)驗(yàn)以寧杞9號(hào)天精菜為原料，在前期對(duì)單因素篩查結(jié)果的基礎(chǔ)上，以提取液料比、溫度、時(shí)間作為影響因素，以枸杞葉多糖提取率作為衡量指標(biāo)進(jìn)行正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)(3因素3水平)對(duì)枸杞葉多糖進(jìn)行提取。

1.3.2 枸杞葉多糖含量

根據(jù)最優(yōu)的提取工藝參數(shù)，以寧杞9號(hào)天精菜為原料，制備枸杞葉多糖并測定其多糖含量。

1.3.3 OVA誘導(dǎo)的過敏性鼻炎小鼠模型的構(gòu)建

為構(gòu)建疾病模型，每只小鼠1周腹腔注射1次200 μL OVA致敏液[內(nèi)含100 μg OVA與4 mg Al(OH)3]致敏，連續(xù)3次；致敏結(jié)束一周后，每只小鼠用50 μL的OVA激發(fā)液(1 mg/mL)連續(xù)滴鼻一周激發(fā)，以完成過敏性鼻炎小鼠模型的構(gòu)建。對(duì)于LBP干預(yù)組，在建立哮喘模型前2周開始先給小鼠每天灌胃LBP 300 μL(100 mg/kg)直至小鼠處死，對(duì)照組小鼠每天以生理鹽水代替LBP。

1.3.4 實(shí)驗(yàn)分組

將30只雌性C57BL/6小鼠隨機(jī)分為3組，分別為對(duì)照組，過敏性鼻炎模型組，LBP干預(yù)過敏性鼻炎組。

1.3.5 小鼠鼻部癥狀評(píng)分

末次滴鼻致敏后觀察小鼠30 min內(nèi)抓鼻、打噴嚏的次數(shù)以及流涕癥狀進(jìn)行小鼠鼻部癥狀評(píng)分，總分>5認(rèn)為造模成功。記分標(biāo)準(zhǔn)[14]如下：(1)搔鼻1～2次，記為1分；劇烈撓鼻不止，記為3分；介于二者之間，記為2分。(2)噴嚏，1～3個(gè)，記為1分；4～10個(gè)，記為2分；>11個(gè)，記為3分。(3)流涕，流至前鼻孔，記為1分；超出前鼻孔；記為2分；涕流滿面，記為3分。

1.3.6 鼻黏膜炎癥細(xì)胞染色

將小鼠鼻前部組織用40 g/L多聚甲醛固定，多層脫水后制作石蠟切片，同時(shí)進(jìn)行蘇木精-伊紅(hematoxylin-eosin,HE)染色、過碘酸-希夫(periodic acid-schiff stain，PSA)染色、甲苯胺藍(lán)染色、髓過氧化物酶(myelpoperoxidasedficiency，MPO)染色后觀察鼻黏膜組織結(jié)構(gòu)，以及杯狀細(xì)胞，肥大細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞浸潤。

1.3.7 脾臟細(xì)胞懸液Th細(xì)胞比例

向小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉后，取小鼠脾臟，加完全培養(yǎng)基經(jīng)300目尼龍網(wǎng)膜研磨過濾得單細(xì)胞懸液。隨后將得到的細(xì)胞懸液用紅細(xì)胞裂解液處理去除殘留的紅細(xì)胞，PBS洗滌2次后，牛鮑式計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)并調(diào)整濃度為1×107個(gè)/mL,并加入胞內(nèi)因子刺激劑37 ℃，5%(體積分?jǐn)?shù))CO2培養(yǎng)5 h。取100 μL細(xì)胞懸液加入1 μL FITC標(biāo)記的抗小鼠CD4抗體，2 μL APC標(biāo)記的抗小鼠CD3冰上避光孵育30 min，加入PerCP-Cy5.5標(biāo)記的IFN-γ以及PE標(biāo)記的IL-4邊破膜邊染色，室溫孵育30 min，經(jīng)染色緩沖液洗滌后，100 μL多聚甲醛重懸細(xì)胞并用流式細(xì)胞儀分析Th1細(xì)胞(CD3+CD4+IFN-γ+)和Th2細(xì)胞(CD3+CD4+IL-4+)百分比。

1.3.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

使用GraphPad Prism 5.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，各組實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間差異顯著性判斷采用單因素方差分析，若有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,則進(jìn)行組間比較,采用LSD-t檢驗(yàn)，P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 枸杞葉多糖的提取工藝研究

通過開展以提取時(shí)間、溫度、料液比作為影響因素，以枸杞葉多糖提取率作為衡量指標(biāo)進(jìn)行正交優(yōu)化實(shí)驗(yàn)(3因素3水平)對(duì)枸杞葉多糖進(jìn)行提取，最終確定的枸杞葉多糖最優(yōu)提取工藝為提取時(shí)間8 h，提取溫度50 ℃，料液比1∶25(g∶mL)。此條件下得到的枸杞葉多糖提取率最高達(dá)到9.61%。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表1所示。

表1 枸杞多糖提取率正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果以及方差分析Table 1 Orthogonal experiment and variance analysis of extraction rate of LBP

由表2可知，極值R(B)>R(C)>R(A)，從而得出影響枸杞葉多糖提取率的主次因素依次為提取溫度、料液比、提取時(shí)間。正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，各因素不同水平的最佳配比為A1B2C2。即提取時(shí)間為8 h，提取溫度為50 ℃，料液比為1∶25(g∶mL)。此條件下得到的枸杞多糖提取率最高，質(zhì)量較優(yōu)。

表2 枸杞葉多糖提取率方差分析Table 2 Analysis of variance of extraction rate of LBP

2.2 枸杞葉多糖成分測定

2.2.1 枸杞葉中多糖的測定

根據(jù)最優(yōu)的提取工藝參數(shù)，制備枸杞葉多糖，并對(duì)其中標(biāo)志性有效活性成分進(jìn)行含量測定。結(jié)果表明枸杞葉多糖中多糖的含量為61.27%，其含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及測定結(jié)果見表3和表4。

2.2.2 枸杞葉多糖中甜菜堿含量測定

同樣以最優(yōu)提取工藝參數(shù)，對(duì)枸杞葉多糖中甜菜堿含量進(jìn)行測定，結(jié)果表明枸杞葉多糖中甜菜堿的平均含量約為2.71%。具體的含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線方程及測定方法見表5和表6。

表3 枸杞葉多糖中多糖含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線方程Table 3 Standard curve equation for the determination of polysaccharide content in LBP

表4 枸杞葉多糖中多糖含量測定結(jié)果 Tab.4 Determination of polysaccharide content in LBP

表5 枸杞葉多糖中甜菜堿含量測定標(biāo)準(zhǔn)曲線Table 5 Standard curve for determination of betaine content in LBP

表6 枸杞葉多糖中甜菜堿含量測定結(jié)果Table 6 Determination of betaine content in LBP

2.2.3 枸杞多糖中氨基酸、礦物質(zhì)含量測定

本課題組對(duì)枸杞多糖中氨基酸、礦物質(zhì)測定的詳細(xì)結(jié)果已有報(bào)道，其中常量元素Ca、P、Mg、K、Na的含量分別為0.095%、2.57%、2.89%、4.39%、1.00%，天冬氨酸以及谷氨酸分別為1.86%和1.17%[15]。

2.3 LBP改善過敏性鼻炎小鼠的常規(guī)狀態(tài)

經(jīng)過OVA誘導(dǎo)的致敏組小鼠頻繁撓鼻，煩躁好動(dòng)。3組小鼠的行為生物學(xué)表明：與對(duì)照組相比，過敏性鼻炎模型組的小鼠撓鼻次數(shù)明顯增加，多次出現(xiàn)噴嚏及水樣鼻涕，并且出現(xiàn)呼吸頻率加快的現(xiàn)象，這些現(xiàn)象均表明模型構(gòu)建成功；LBP干預(yù)過敏性鼻炎組與過敏性鼻炎模型組相比，LBP干預(yù)后小鼠的撓鼻次數(shù)減少，出現(xiàn)水樣鼻涕及噴嚏的次數(shù)減少，呼吸頻次相對(duì)緩和，以上現(xiàn)象說明LBP可以緩解過敏性鼻炎小鼠的過敏性癥狀。綜上所述，從小鼠的行為生物學(xué)來看，過敏性鼻炎模型組小鼠的鼻炎癥狀最重，經(jīng)過LBP干預(yù)后，小鼠的常規(guī)狀態(tài)明顯好于過敏性鼻炎模型組，這提示LBP可改善過敏性鼻炎小鼠的過敏狀態(tài)。同時(shí)對(duì)小鼠的鼻部癥狀進(jìn)行評(píng)分如表7所示。

表7 各組小鼠鼻部癥狀評(píng)分Table 7 Nasal symptom score in each group

2.4 LBP減輕過敏性鼻炎小鼠鼻黏膜炎癥細(xì)胞浸潤

2.4.1 LBP減輕鼻黏膜炎癥水平

鼻黏膜固有層為疏松結(jié)締組織，包括肥大細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞，淋巴細(xì)胞等多種炎癥細(xì)胞，還有豐富的血管和腺體，鼻黏膜靜脈叢發(fā)達(dá)[16-18]。正常情況下靜脈叢呈收縮狀態(tài)，受刺激后可反射性擴(kuò)張充血引起鼻塞，靜脈叢破裂還有可能引起鼻部出血;腺體的分泌物可以潤滑鼻黏膜，黏附細(xì)菌和異物，在病理?xiàng)l件下，腺體分泌增加臨床上可表現(xiàn)為清涕。HE染色3組鼻黏膜的結(jié)果見圖1，對(duì)照組的鼻黏膜假復(fù)層纖毛柱狀上皮細(xì)胞核呈2層或者3層，排列整齊，黏膜下少量淋巴細(xì)胞浸潤，黏膜下腺體呈正常生長狀態(tài)。與對(duì)照組相比，哮喘模型組的鼻黏膜假復(fù)層纖毛柱狀上皮明顯增厚，且黏膜下大量炎癥細(xì)胞浸潤，毛細(xì)血管擴(kuò)張，有大量空泡狀胞漿疏松區(qū)域，為黏膜下腺體增生從而分泌的黏液或者漿液。與過敏性鼻炎模型組相比，LBP干預(yù)組的鼻黏膜假復(fù)層纖毛柱狀上皮增厚程度明顯減輕，黏液腺體增生程度減少。

a-對(duì)照組;b-過敏性鼻炎模型組;c-LBP干預(yù)過敏性鼻炎組圖1 三組小鼠鼻黏膜HE染色Fig.1 HE staining of nasal mucosa in three groups

2.4.2 LBP減輕鼻黏膜杯狀細(xì)胞浸潤

鼻黏膜上皮主要由柱狀細(xì)胞，杯狀細(xì)胞和基細(xì)胞組成，杯狀細(xì)胞增生會(huì)引起黏液分泌過多[19]。用PAS將杯狀細(xì)胞染成紫紅色，3組PAS染色的結(jié)果如圖2所示(杯狀細(xì)胞如下圖箭頭所示)，杯狀細(xì)胞一般呈散在分布，當(dāng)有炎癥發(fā)生時(shí)杯狀細(xì)胞胞內(nèi)充滿黏原顆粒，局部增大，當(dāng)黏原顆粒釋放后可參與上皮表面黏液毯的形成。與對(duì)照組形成相比，過敏性鼻炎模型組有大量散在分布的杯狀細(xì)胞，且細(xì)胞呈典型的高腳杯狀，胞核位于底部，胞質(zhì)充滿紫紅色黏液顆粒，且黏液呈噴射狀向腔面隆起。杯狀細(xì)胞作為黏膜免疫的一種“哨兵”可以分泌黏液來維持黏膜穩(wěn)態(tài)和抵御感染，是免疫系統(tǒng)不可或缺的細(xì)胞[20-21]。然而過多的黏液分泌會(huì)造成臨床上以鼻塞等為特點(diǎn)的過敏性癥狀，采取一定的措施降低過敏性鼻炎患者杯狀細(xì)胞的數(shù)量會(huì)一定程度緩解病人的痛苦。在經(jīng)過LBP干預(yù)后，觀察過敏性鼻炎小鼠鼻黏膜中陽性杯狀細(xì)胞的數(shù)量明顯減少，這為我們?cè)谥委熯^敏性鼻炎策略上提供了新思路。

a-對(duì)照組;b-過敏性鼻炎模型組;c-LBP干預(yù)過敏性鼻炎組圖2 三組小鼠鼻黏膜PAS染色Fig.2 PAS staining of nasal mucosa in three groups

2.4.3 LBP減輕鼻黏膜肥大細(xì)胞浸潤

肥大細(xì)胞是炎癥細(xì)胞因子、蛋白酶、血管內(nèi)皮生長因子和肥大細(xì)胞特異性介質(zhì)的豐富來源，在炎癥中促進(jìn)組織結(jié)構(gòu)重塑[22]。有研究表明，在哮喘這種過敏性疾病中，肥大細(xì)胞是處于“激活”狀態(tài)的，這種不當(dāng)?shù)募せ顣?huì)使肥大細(xì)胞重新分布到特定的部位從而介導(dǎo)有害性的組織重塑過程[23]。在過敏反應(yīng)的早期和急性階段，肥大細(xì)胞被認(rèn)為是過敏反應(yīng)的效應(yīng)細(xì)胞，特異性IgE與肥大細(xì)胞表面IgE受體結(jié)合促進(jìn)肥大細(xì)胞釋放組胺等過敏性介質(zhì)使得血管通透性增加、平滑肌收縮和黏液分泌[24]。肥大細(xì)胞是異染細(xì)胞，其胞質(zhì)內(nèi)含有肝素和組胺等異色物質(zhì)遇到甲苯胺藍(lán)可呈異染性紫紅色[25]。3組甲苯胺藍(lán)染色結(jié)果見圖3(肥大細(xì)胞如下圖箭頭所示)：對(duì)照組黏膜下層和黏膜間質(zhì)中基本沒有肥大細(xì)胞浸潤。過敏性鼻炎模型組黏膜下可見染成紫紅色的肥大細(xì)胞，有些肥大細(xì)胞胞膜不完整，有些細(xì)胞呈空泡狀，胞質(zhì)著色不均勻，肥大細(xì)胞周圍可見脫出的顆粒物質(zhì)。與過敏性鼻炎模型組相比，LBP干預(yù)組肥大細(xì)胞數(shù)量減少，由此可見LBP可以減少肥大細(xì)胞在小鼠鼻黏膜中的浸潤，具備改善小鼠過敏性炎癥的潛能。

a-對(duì)照組;b-過敏性鼻炎模型組;c-LBP過敏性鼻炎干預(yù)組圖3 三組小鼠鼻黏膜甲苯胺藍(lán)染色Fig.3 Toluidine blue staining of nasal mucosa in three groups

2.4.4 LBP減輕嗜酸性粒細(xì)胞浸潤

嗜酸性粒細(xì)胞在先天性免疫和獲得性免疫中均發(fā)揮重要的作用，它可以作為抗原提呈細(xì)胞處理抗原，通過產(chǎn)生T細(xì)胞極化細(xì)胞因子刺激T細(xì)胞，通過與B細(xì)胞相互作用促進(jìn)體液免疫反應(yīng)，由此可見嗜酸性粒細(xì)胞具有免疫調(diào)節(jié)能力[26]。作為一種終末效應(yīng)細(xì)胞，嗜酸性粒細(xì)胞可以釋放陽離子蛋白、細(xì)胞因子、趨化因子發(fā)揮作用，然而過多的效應(yīng)細(xì)胞會(huì)造成組織損傷[27-29]。對(duì)嗜酸性粒細(xì)胞進(jìn)行MPO染色，細(xì)胞內(nèi)陽性顆粒呈棕黃色或者藍(lán)黑色，3組MPO染色結(jié)果如圖4所示(嗜酸性粒細(xì)胞細(xì)胞如下圖箭頭所示)：過敏性鼻炎組鼻黏膜固有層可見大量的嗜酸性粒細(xì)胞浸潤，經(jīng)過LBP干預(yù)后，小鼠鼻黏膜中棕黃色的陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少。嗜酸性粒細(xì)胞是重要的免疫效應(yīng)細(xì)胞和炎性細(xì)胞，是介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的主要細(xì)胞因子之一[30]。經(jīng)過LBP干預(yù)后鼻黏膜嗜酸性粒細(xì)胞減少這表明LBP可以減輕過敏性鼻炎小鼠的炎癥反應(yīng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)小鼠過敏性鼻炎的緩解作用。

a-對(duì)照組;b-過敏性鼻炎模型組;c-LBP干預(yù)過敏性鼻炎組圖4 三組小鼠鼻黏膜MPO染色Fig.4 MPO staining of nasal mucosa in three groups

2.4.5 脾臟Th1/Th2細(xì)胞比例變化

在機(jī)體免疫系統(tǒng)細(xì)胞中，T淋巴細(xì)胞的子集輔助性T(Th)細(xì)胞是免疫調(diào)節(jié)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)點(diǎn)，Th1/Th2細(xì)胞平衡紊亂在過敏性疾病以及多種自身免疫病中均有報(bào)道，主要表現(xiàn)為Th2細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子升高[31-32]。Th細(xì)胞可以根據(jù)其細(xì)胞因子譜進(jìn)行區(qū)分從而賦予Th亞型不同的功能特性，Th1細(xì)胞相關(guān)的細(xì)胞因子是IFN-γ和TNF；Th2相關(guān)的細(xì)胞因子是IL-4、IL-5和IL-13[33]。脾臟是機(jī)體重要的免疫器官，以CD3+細(xì)胞畫門，對(duì)小鼠脾臟淋巴細(xì)胞Th1(CD4+、IFN-γ+)，Th2(CD4+、IL-4+)細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)分析如圖5、圖6所示(Th1/Th2細(xì)胞比例如圖5、圖6右側(cè))，在過敏性鼻炎模型組中Th1細(xì)胞比例為1.1%，Th2細(xì)胞比例為1.7%，與對(duì)照組Th1細(xì)胞比例3.8%，Th2細(xì)胞比例0.8%相比具有顯著差異。在過敏性鼻炎模型組中Th2細(xì)胞比例增高，Th1細(xì)胞比例下降這與其他報(bào)道中過敏性疾病Th1/Th2細(xì)胞比例失衡一致[6]。經(jīng)過LBP干預(yù)后Th1細(xì)胞比例為5.5%，Th2細(xì)胞比例為0.6%，上述結(jié)果表明LBP具有調(diào)節(jié)Th細(xì)胞免疫應(yīng)答的功能。

a-對(duì)照組；b-過敏性鼻炎模型組；c-LBP干預(yù)過敏性鼻炎組圖5 三組小鼠脾臟Th1細(xì)胞比例Fig.5 Proportion of Th1 cells in spleen of mice in the three groups注：*代表每組分別與b組相比P<0.05(下同)

a-對(duì)照組；b-過敏性鼻炎模型組；c-LBP干預(yù)過敏性鼻炎組圖6 三組小鼠脾臟Th2細(xì)胞比例Fig.6 Proportion of Th2 cells in spleen of mice in the three groups

3 結(jié)論

本次實(shí)驗(yàn)以提取時(shí)間8 h，提取溫度50 ℃，料液比1∶25(g∶mL)為條件得到的枸杞葉多糖提取率最高。觀察小鼠的生存狀態(tài)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過LBP干預(yù)后過敏性鼻炎小鼠的撓鼻次數(shù)，打噴嚏的次數(shù)較過敏性鼻炎模型組均減少。對(duì)小鼠的鼻黏膜進(jìn)行組織化學(xué)染色后發(fā)現(xiàn)，LBP干預(yù)后可以減少小鼠鼻黏膜炎癥細(xì)胞的浸潤，初步證實(shí)了LBP可以緩解過敏性鼻炎小鼠。流式細(xì)胞術(shù)分析Th1/Th2細(xì)胞比例同時(shí)證實(shí)了LBP可以糾正Th細(xì)胞的失衡，具有調(diào)節(jié)小鼠免疫系統(tǒng)的功能。過敏性鼻炎和過敏性哮喘均屬于過敏性疾病，有研究表明LBP可以從減輕氣道炎癥和調(diào)節(jié)腸道菌群這兩個(gè)方面來改善過敏性哮喘[15]。這與我們此次實(shí)驗(yàn)得到的結(jié)論是相吻合的，在本次實(shí)驗(yàn)中我們雖然證實(shí)了LBP可以緩解過敏性鼻炎，但是其作用機(jī)制目前仍然不清楚，有待進(jìn)一步的研究。