miRNA在胃腸道間質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展及診治中作用的研究進展

姚志恒，錢波

安徽醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院，合肥 230000

胃腸間質(zhì)瘤(GIST)是最常見的胃腸道間葉組織來源腫瘤，可發(fā)生于消化道的任何部位，以胃(約60%)和小腸(約35%)多見，也有少數(shù)病例可發(fā)生在消化道以外。現(xiàn)已證明，原癌基因c-kit和PDGFRA的獲得性突變是GIST發(fā)生的中心事件，但有關(guān)GIST的發(fā)病機制、早期診斷和耐藥等方面仍存在諸多難題。微小RNA(miRNA)是一種小的(21～25個核苷酸)非編碼RNA，其與胃癌、乳腺癌、肝癌等多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。GIST作為常見的胃腸道腫瘤，miRNA在腫瘤細(xì)胞增殖、分化和凋亡等過程發(fā)揮重要作用。近些年來，有關(guān)miRNA與GIST發(fā)生發(fā)展、診斷、治療相關(guān)性的研究越來越多，發(fā)現(xiàn)兩者之間有密切的聯(lián)系。現(xiàn)就miRNA在GIST發(fā)生發(fā)展、診斷、治療中的作用研究進展情況綜述如下。

1 miRNA在GIST發(fā)生發(fā)展中的作用

1.1 miRNA與GIST增殖與遷移 魏偉等[1]通過miRNA芯片與RT-PCR技術(shù)對比檢測間質(zhì)瘤細(xì)胞與正常細(xì)胞中的miRNA，顯示胃間質(zhì)瘤有特異性的miRNA表達(dá)譜，通過上調(diào)miR-3178和miR-193a-5p的表達(dá)可能抑制間質(zhì)瘤細(xì)胞增殖、促進凋亡。廖玉婷等[2]利用miRNA芯片及PCR技術(shù)從間質(zhì)瘤細(xì)胞中篩選出10個差異性表達(dá)的miRNA，發(fā)現(xiàn)miR-301a表達(dá)上調(diào)最明顯，其表達(dá)量與性別、年齡、腫瘤發(fā)病部位等因素?zé)o關(guān)，與腫瘤危險度分級、腫物直徑、腫物細(xì)胞核分裂象和壞死情況相關(guān)，表明過表達(dá)miR-301a能顯著增強GIST細(xì)胞的增殖能力。Ling等[3]發(fā)現(xiàn)，miRNA-182在人GIST中的表達(dá)上調(diào)，其過表達(dá)增加了GIST-T1細(xì)胞的生長、增殖，減少凋亡，促進GIST細(xì)胞的集落形成和遷移。已有研究表明，miR-218能夠抑制骨肉瘤細(xì)胞的侵襲和遷移。Tu等[4]發(fā)現(xiàn)，miR-218在GIST中表達(dá)下調(diào)，其靶基因為KIT，通過負(fù)載納米顆粒的miR-218轉(zhuǎn)染，不僅可以提高表達(dá)的穩(wěn)定性，而且對細(xì)胞增殖的抑制作用明顯增強。Yamamoto等[5]通過對19例GIST進行miRNA芯片分析，發(fā)現(xiàn)miRNA-133b在GIST中低表達(dá)，尤其是在高度惡性的間質(zhì)瘤患者中下調(diào)更為明顯，進一步的作用靶點分析提示miRNA-133b下調(diào)后導(dǎo)致fascin-1(一種肌動蛋白結(jié)合蛋白)的過表達(dá)，fascin-1被證實促進腫瘤的增殖與轉(zhuǎn)移，該實驗證明下調(diào)miRNA-133b促進間質(zhì)瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移可能是通過上調(diào)fascin-1的表達(dá)實現(xiàn)的。張林等[6]發(fā)現(xiàn)，miR-376-3p在胃間質(zhì)瘤中明顯下調(diào)，對轉(zhuǎn)染miR-376-3p后的間質(zhì)瘤細(xì)胞通過Western blotting法和PT-PCR法、CCK8法、流式細(xì)胞儀、Transwell法分別檢測人類同源基因7(CASP-7)表達(dá)、細(xì)胞活性、凋亡率及遷移能力，結(jié)果顯示CASP-7 mRNA及蛋白水平顯著上調(diào)，細(xì)胞增殖、遷移能力明顯受到抑制，細(xì)胞凋亡增強。Isosaka等[7]使用TaqMan miRNA芯片分析miRNA表達(dá)譜、亞硫酸氫鹽焦磷酸測序分析DNA甲基化，發(fā)現(xiàn)miR-34a和miR-335表達(dá)下調(diào)，且它們的CpG島在GIST-T1細(xì)胞和大多GIST標(biāo)本中被甲基化。轉(zhuǎn)染后高表達(dá)的miR-34a和miR-335，可以抑制GIST-T1細(xì)胞的增殖，并且miR-34a能夠抑制細(xì)胞的遷移和侵襲。

1.2 miRNA與GIST增殖凋亡的調(diào)控 Pantaleo等[8]使用miRNA微陣列對KIT/PDGFRA基因突變體和KIT/PDGFRA野生型GIST細(xì)胞株進行全基因組miRNA檢測，發(fā)現(xiàn)存在3個miRNA-mRNA潛在的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)[IGF1R→miR-139-5p/miR-455/let-7b、周期蛋白依賴激酶6(CDK6)→miR-139-5p/let-7b和CD44→miR-330-3p]，其中miR-139-5p、let-7b、miR-455-5p、miR-330-3p在KIT/PDGFRA突變體GIST中表達(dá)上調(diào)。第1個IGF1R調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)中IGF1R是激素胰島素樣生長因子1的細(xì)胞表面受體，可引起細(xì)胞的過度增殖，通過上調(diào)miR-139-5p、miR-455、let-7b能夠調(diào)控IGF1R，抑制細(xì)胞的生長，其中前兩者起到主要的調(diào)控作用，后者作用相對次要；第2個CDK6調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，CDK6作為一種細(xì)胞周期調(diào)節(jié)劑，可以促進哺乳動物細(xì)胞增殖，過表達(dá)的miR-139-5p、let-7b可以下調(diào)CDK6的表達(dá)，抑制細(xì)胞的增殖，提示在GIST中發(fā)揮腫瘤抑制因子的作用；第3個CD44調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中，CD44是具有多種生物學(xué)功能的因子，可以通過多種途徑介導(dǎo)腫瘤生長和轉(zhuǎn)移，包括血管生成、細(xì)胞存活和細(xì)胞遷移，實驗發(fā)現(xiàn)miR-330-3p可以和CD44結(jié)合，可能抑制GIST細(xì)胞的增殖，促進細(xì)胞凋亡。miRNA可能通過直接調(diào)控CD44、CDK6等信號因子的表達(dá)，從而影響GIST的細(xì)胞學(xué)功能，促進或抑制腫瘤的生長轉(zhuǎn)移。Wang等[9]研究發(fā)現(xiàn)，miR-148b-3p在GIST中表達(dá)下調(diào)，進一步的靶基因預(yù)測分析顯示miR-148b-3p可以通過直接與KIT的3′-UTR結(jié)合來調(diào)控KIT表達(dá)，并且對細(xì)胞增殖、遷移和侵襲起抑制作用，研究還發(fā)現(xiàn)miR-148b-3p能與伊馬替尼產(chǎn)生協(xié)同抑制作用，增強細(xì)胞對伊馬替尼的敏感性。Liu等[10]發(fā)現(xiàn)，miR-137在GIST的臨床標(biāo)本中表達(dá)顯著下調(diào)，miR-137的表達(dá)可以通過下調(diào)Twist1調(diào)控EMT從而減少GIST細(xì)胞遷移，導(dǎo)致G1細(xì)胞周期阻滯，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。Koelz等[11]發(fā)現(xiàn)，與其他腫瘤相比，miR-221和miR-222在大多數(shù)GIST中表達(dá)均下調(diào)，miR-221/222表達(dá)水平與KIT的表達(dá)密切相關(guān)，尤其是在KIT表達(dá)陰性和陽性腫瘤之間相關(guān)性更加密切，miR-221和miR-222的表達(dá)水平在KIT陽性的GIST中明顯受到抑制，而在KIT陰性的GIST中表達(dá)完全相反。Ihle等[12]研究認(rèn)為，miR-221和miR-222可以降低細(xì)胞活力、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡、通過KIT/AKT信號級聯(lián)調(diào)控增殖。Yun等[13]通過分析三種miRNA(miR-221、miR-193a和miR-494)對KIT mRNA的下調(diào)效率，發(fā)現(xiàn)miR-494是惟一誘導(dǎo)KIT顯著下調(diào)的miRNA，進一步調(diào)控機制研究顯示，miR-494的抑制作用主要是通過直接作用于其靶基因KIT和Survivin，進而干擾細(xì)胞周期實現(xiàn)的。其中Survivin是miR-494的靶基因，其表達(dá)與miR-494在GIST組織中的含量呈負(fù)相關(guān)。Kim等[14]發(fā)現(xiàn)，GIST中miR-494表達(dá)下調(diào)，并且與KIT表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)，通過誘導(dǎo)miR-494過表達(dá)，可以下調(diào)KIT信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路下游分子AKT和STAT3的表達(dá)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡，并伴有G1期和S期細(xì)胞比例增加。

1.3 miRNA與GIST惡性度 肖軍等[15]通過對正常組織、低危GIST、高危GIST中miRNA的對比分析，發(fā)現(xiàn)miR-17-3p、miR-17-5p及miR-20a-5p在GIST中表達(dá)顯著下調(diào)，其中miR-17-3p、miR-17-5p在正常組織中的表達(dá)與腫瘤組織比較差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，但是在低危組和中高危組GIST中表達(dá)無明顯差異；miR-20a-5p的表達(dá)在正常組織、低危組和中高危組GIST之間均有差異性，且隨著惡性度增加而表達(dá)下降，表明miR-17-3p、miR-17-5p、miR-20a-5p與腫瘤的侵襲、轉(zhuǎn)移與惡性度等相關(guān)，尤其miR-20a-5p在間質(zhì)瘤的惡性轉(zhuǎn)歸中可能存在重要作用。姚冬雪等[16]發(fā)現(xiàn)，miRNA-206在胃間質(zhì)瘤中表達(dá)下調(diào)，且在核分裂像≥5/50 HPF及Fletcher分級中/高危病例中miRNA-206下調(diào)更為明顯，其他病理因素(性別、年齡、腫瘤直徑)并沒有對miRNA-206的表達(dá)產(chǎn)生明顯影響，說明miRNA-206與胃間質(zhì)瘤惡性度相關(guān)。Niinuma等[17]通過miRNA微陣列分析了32例GIST患者的miRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)miR-186表達(dá)下調(diào)，尤其在轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)GIST中下調(diào)更明顯，表明該miRNA的下調(diào)促進了腫瘤細(xì)胞的遷移，與患者風(fēng)險等級和預(yù)后不佳有關(guān)。Niinuma等[18]利用miRNA微陣列及PT-PCR技術(shù)對GIST標(biāo)本進行分析，發(fā)現(xiàn)miR-196a在高危GIST中明顯上調(diào)，而在低?；蛑形IST中明顯下調(diào)，表明miR-196a與GIST標(biāo)本的高危分級、轉(zhuǎn)移和預(yù)后不佳可能相關(guān)。Gyvyte等[19]使用RNA測序法對15對GIST標(biāo)本及其周圍正常組織進行了高通量miRNA分析，發(fā)現(xiàn)110個miRNA(上調(diào)34個，下調(diào)76個)在GIST中差異表達(dá)。選擇其中高表達(dá)的21個miRNA進一步研究，發(fā)現(xiàn)19個miRNA與GIST相關(guān)，其中6個miRNA(miR-133a-3p、miR-133b、miR-200c-3p、miR-509-3p、miR-483-5p、miR-675-3p)已經(jīng)被證明在GIST中具有調(diào)控作用(前三者下調(diào)，后三者上調(diào))，其余13個miRNA為新發(fā)現(xiàn)與GIST相關(guān)的，新發(fā)現(xiàn)的相關(guān)miRNA包括miR-200家族成員(miR-200c-3p、miR-200a-3p、miR-200b-3p、miR-429、miR-141-3)，這些家族成員在其他研究中顯示與腫瘤的預(yù)后和診斷相關(guān)，另外miR-192/215參與腫瘤相關(guān)p53網(wǎng)絡(luò)，miR-375在胃癌中下調(diào)，影響細(xì)胞增殖。miRNA富集分析發(fā)現(xiàn)，miR-141-3p的表達(dá)與KIT基因之間存在高度的負(fù)相關(guān)，而miR-375只表現(xiàn)為中度負(fù)相關(guān)，在富集的miRNA中只有miR-200a-3p與PDGFRA表現(xiàn)出顯著的負(fù)相關(guān)性。在miRNA與GIST組織學(xué)特性的實驗中，通過表型分析顯示miR-509-3p表達(dá)上調(diào)，尤其在上皮樣細(xì)胞和混合型細(xì)胞中高表達(dá)，miR-215-5p表達(dá)下調(diào)，且與GIST的危險程度呈中度負(fù)相關(guān)，已有研究顯示miR-215-5p在結(jié)腸癌和胰腺癌中發(fā)揮腫瘤抑制因子作用，成為預(yù)后不良的生物標(biāo)志物。

2 miRNA在GIST診斷中的作用

2.1 miRNA與間質(zhì)瘤良惡性鑒別 Shi等[20]通過基因芯片對差異性表達(dá)的miRNA篩選，結(jié)果顯示GIST惡性組與交界組相比，相差倍數(shù)2倍以上的miRNA有14個，上調(diào)的有5個(miRNA-720、miRNA-221、miRNA-130b、miRNA-10b、miRNA-135b)，下調(diào)的有9個(miRNA-326、miRNA-24-1、miRNA-145、miRNA-488、miRNA-218、miRNA-34a、miRNA-675、miRNA-335、miRNA-505)，其中表達(dá)差異最明顯的有4個，分別為miR-221(25.58倍)、miR-135b(25.35倍)、miR-675(5.69倍)、miR-218(66.56倍)。以往研究發(fā)現(xiàn)，miR-135b與結(jié)腸癌、前列腺癌相關(guān)；miR-675在結(jié)腸癌中起著癌基因的作用，并且可用于鑒別腎上腺皮質(zhì)腺癌與腺瘤；miR-218可能與非小細(xì)胞肺癌、胃癌有關(guān)系；miR-221與GIST的惡性程度相關(guān)，且在其靶基因KIT陽性的GIST相較于KIT陰性的表達(dá)顯著降低。同樣地，Tong等[21]通過檢測不同類型GIST(良性、交界性、惡性)中miRNA表達(dá)譜，研究miRNA與GIST惡性進展間的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)在GIST的惡性轉(zhuǎn)歸中存在多種miRNA的失調(diào)，let-7c、miR-218、miR-488、miR-4683、miR-34c-5p和miR-4773 這6個miRNA在良性GIST與惡性GIST中差異性表達(dá)，前四者在良性組中上調(diào)，后兩者下調(diào)；miR-29b-2、let-7c、miR-891b、miR-218、miR-204、miR-204-3p、miR-628-5p、miR-744、miR-29c、miR-625和miR-196a在邊緣組和惡性組中差異表達(dá)，miR-196a在邊緣組中下調(diào)，其余上調(diào)，let-7c、miR-218、miR-628-5p、miR-204、miR-891b、miR-488、miR-145、miR-891a、miR-34c-5p和miR-196a在非惡性組與惡性組中差異表達(dá)，非惡性組中低表達(dá)的只有miR-196a和miR-34c-5p，其余的miRNA高表達(dá)。在其他的腫瘤研究中發(fā)現(xiàn)，let-7c在惡性腫瘤中的低表達(dá)促進了細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移；miR-218可以負(fù)調(diào)控KIT蛋白的表達(dá)，抑制GIST細(xì)胞的增殖和侵襲；miR-34c下調(diào)了ULBP2的表達(dá)，降低了NK細(xì)胞對腫瘤細(xì)胞的識別能力，可能促進了腫瘤細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)移；miR-196a在癌組織中的上調(diào)與腫瘤直徑、pT期、pN期及生存時間有關(guān)，miR-196a下調(diào)可抑制癌細(xì)胞增殖。上述實驗所篩選出的miRNA有可能成為鑒別間質(zhì)瘤良惡性以及預(yù)后的生物學(xué)指標(biāo)，為后續(xù)的治療提供了有力的臨床數(shù)據(jù)支持，但其檢測的準(zhǔn)確度及靈敏度有待于進一步的研究。

2.2 miRNA與胃腸道內(nèi)外間質(zhì)瘤鑒別 林慧等[22]通過研究miRNA表達(dá)譜反映GIST與胃腸道外間質(zhì)瘤(EGIST)關(guān)系，發(fā)現(xiàn)GIST腸道表型組與胃部表型組相比，有7個miRNA上調(diào)(miR-383、miR-1275、miR-193b、miR-139-3p、miR-663、miR-886-3p、miR-664)，有5個發(fā)生下調(diào)(miR-30e、miR-186、miR-10a、miR-199b-5p、miR-218)。比較GISTs和EGISTs的表達(dá)譜發(fā)現(xiàn)，僅有3個miRNA的表達(dá)差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，提示GISTs和EGISTs的miRNA表型基本相似，也支持了絕大部分EGISTs實質(zhì)上來源于GISTs的觀點。通過該實驗我們可以得知胃腸道很可能成為間質(zhì)瘤的原發(fā)部位，并且轉(zhuǎn)移到胃腸道外。

3 miRNA在GIST治療中的作用

3.1 miRNA與伊馬替尼耐藥性檢測 Kou等[23]通過檢測繼發(fā)性伊馬替尼耐藥GIST患者、伊馬替尼敏感GIST患者和健康對照組血清miRNA表達(dá)譜，發(fā)現(xiàn)miR-518e-5p和miR-548e在繼發(fā)性伊馬替尼耐藥組血清中明顯增高，且miR-518e-5p對于伊馬替尼耐藥、敏感GIST患者以及正常對照組區(qū)分的靈敏度為99.8%，特異性為82.1%，與臨床病理特征(核分裂水平、轉(zhuǎn)移等)無相關(guān)性。該實驗表明血清miR-518e-5p可作為是一種潛在的生物標(biāo)志物，成為早期檢測和診斷繼發(fā)性伊馬替尼耐藥GIST的新思路。

3.2 miRNA與伊馬替尼敏感性 Zhang等[24]利用微列陣分析發(fā)現(xiàn)了與伊馬替尼耐藥性相關(guān)的5個關(guān)鍵miRNA，在這5個miRNA中，與伊馬替尼耐藥靈敏度顯著相關(guān)的有miR-28-5p和miR-125a-5p。這2種miRNA的高表達(dá)，可以上調(diào)KEGG和GnRH信號通路的表達(dá)，進而影響GIST對伊馬替尼的藥物靈敏度，并且該miRNA的表達(dá)情況和GIST患者伊馬替尼治療效果密切相關(guān)。支小飛等[25]發(fā)現(xiàn)，伊馬替尼耐藥GIST細(xì)胞株中miRNA-145表達(dá)明顯下調(diào)，同時三磷酸腺苷結(jié)合盒轉(zhuǎn)運蛋白亞家族C成員1(ABCC1)蛋白表達(dá)增多，轉(zhuǎn)染耐藥GIST細(xì)胞后高表達(dá)miRNA-145，ABCC1蛋白表達(dá)明顯下調(diào)，對于伊馬替尼靈敏度也顯著增強。提示miRNA-145可能通過下調(diào)ABCC1蛋白的表達(dá)，增加伊馬替尼耐藥GIST細(xì)胞的藥物靈敏度。Cao等[26]研究伊馬替尼耐藥GIST細(xì)胞中miRNA-21的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miRNA-21表達(dá)明顯下調(diào)，Bcl-2基因表達(dá)上調(diào)，通過轉(zhuǎn)染高表達(dá)miRNA-21，可以逆轉(zhuǎn)GIST細(xì)胞對伊馬替尼的耐藥，抑制細(xì)胞增殖，并且增加凋亡。相關(guān)機制研究提示，miRNA-21可能通過和Bcl-2基因的3′-未翻譯區(qū)(3′-UTR)結(jié)合，下調(diào)Bcl-2基因的表達(dá)，從而影響GIST細(xì)胞對伊馬替尼的靈敏度。Durso等[27]發(fā)現(xiàn)，通過上調(diào)miRNA-221/222的表達(dá)，可以增加GIST細(xì)胞對伊馬替尼的靈敏度，其機制可能是通過影響KIT基因的表達(dá)，增加細(xì)胞的凋亡和抑制細(xì)胞增殖。

3.3 miRNA與伊馬替尼耐藥 Shi等[28]通過基因芯片檢測GIST和伊馬替尼耐藥患者組織，發(fā)現(xiàn)表達(dá)差異的miRNA有10種，其中miR-1260b、miR-2964a-5p、miR-3907、miR-491-3p表達(dá)上調(diào)，miR-518a-5p、miR-4466、miR-595、miR-221-3p、miR-3145-3p、miR-3655表達(dá)下調(diào)。已有研究提示，miR-518a-5p可能起到抑癌因子的作用，進一步研究GIST中miR-518a-5p的功能，發(fā)現(xiàn)miR-518a-5p可以和PIK3C2A基因的3′-UTR結(jié)合，下調(diào)該基因的表達(dá)。在GIST耐藥細(xì)胞中，miR-518a-5p表達(dá)下調(diào)，可以上調(diào)PIK3C2A的表達(dá)，參與GIST對伊馬替尼的耐藥。石園等[29]利用基因芯片分析伊馬替尼耐藥GIST中的miRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)的miRNA有13種，其中表達(dá)差異最明顯的是miR-15a、miR-1280、miR-320a、miR-15a表達(dá)上調(diào)，后兩者表達(dá)下調(diào)，提示miR-15a、miR- 1280、miR-320a可能與GIST耐藥相關(guān)，但未作進一步的機制研究。不過在其他腫瘤中如胃癌，miR-15a可能通過作用于靶基因BCL-2、MCL1、ETS1、JUN等促進細(xì)胞凋亡、抑制細(xì)胞增殖；在膀胱癌中，miR-1280可通過調(diào)控靶基因ROCK1的表達(dá)，抑制膀胱癌侵襲與轉(zhuǎn)移；miR-320a可通過直接作用β-catenin抑制人結(jié)腸癌細(xì)胞增殖。Gao等[30]發(fā)現(xiàn)，miR-320a在伊馬替尼耐藥患者中低表達(dá)，該基因表達(dá)較低的患者，更易出現(xiàn)術(shù)后早期伊馬替尼耐藥。以上研究提示miRNA可能通過調(diào)控ABCC1、Bcl-2、PIK3C2A等基因表達(dá)，進而影響與凋亡相關(guān)的信號通路如Wnt通路、IGF通路、TRPC5等，抑制間質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡，從而導(dǎo)致耐藥。

綜上所述，間質(zhì)瘤是胃腸道常見的腫瘤之一，其生物學(xué)特性和癌癥有明顯差異，診斷和治療是現(xiàn)在研究的熱點。miRNA是一種非編碼RNA，被證實和間質(zhì)瘤增殖、分化、凋亡等生物學(xué)功能相關(guān)，在診斷方面也有特殊的意義。今后，通過研究GIST中差異性表達(dá)的miRNA，進一步分析其作用靶點、作用機制及通路，對于闡釋GIST發(fā)生發(fā)展機制、輔助臨床診斷以及藥物治療等有著重要的臨床研究價值。