響應(yīng)面法優(yōu)化藜麥多糖提取工藝條件

郭怡，楊璇，肖萍,2,通信作者

響應(yīng)面法優(yōu)化藜麥多糖提取工藝條件

郭怡1，楊璇1，肖萍1,2,通信作者

（1. 天津農(nóng)學(xué)院 食品科學(xué)與生物工程學(xué)院，天津 300392；2. 天津市農(nóng)副產(chǎn)品深加工技術(shù)工程中心，天津 300392）

本文分別采用水提取法、纖維素酶提取法、超聲提取法3種方法，以藜麥多糖的提取率為考察指標(biāo)，對紅、白、黑3種顏色藜麥進行多糖提取。通過分析可知，采用纖維素酶提取法對3種顏色藜麥中的多糖進行提取的提取率均為最高，其中，白色藜麥多糖提取率最高，為6.8%，其次是紅藜麥和黑藜麥，提取率分別為6.4%和5.9%；在此基礎(chǔ)上，以白藜麥作為提取原料，采用單因素和Box-Behnken試驗對提取料液比、加酶量、提取溫度、提取時間進行優(yōu)化，確定白藜麥多糖最優(yōu)提取工藝條件為：料液比1∶32 g/mL，加酶量2 000 U/g，提取溫度65 ℃，浸提時間90 min，在此條件下藜麥多糖提取率為8.0%。

藜麥；多糖；纖維素酶提取法；Box-Behnken試驗

藜麥（Chenopodium quinoa Willd）是一種起源于南美洲安第斯山脈的古老偽谷物，近二十年來引起了世界各國廣泛關(guān)注[1]。藜麥中蛋白質(zhì)的含量為14%～22%，且含有8種人體必需氨基酸，此外還含有多種B族維生素、維生素E、鈣、鎂、鉀、硒等營養(yǎng)物質(zhì)，其中鈣含量為874 mg/kg，鐵含量為81 mg/kg，其鈣、鐵含量均顯著高于大多數(shù)常用谷物[2-3]。因此，藜麥也被認(rèn)為是“全球十大營養(yǎng)食品”之一[4]。藜麥作為未來最具潛力的農(nóng)作物之一，含有豐富的黃酮、多酚、多糖、不飽和脂肪酸等營養(yǎng)功能因子，具有抗氧化、降血脂、增強免疫等生理功效，能夠降低一些慢性疾病的發(fā)生風(fēng)險[5]。藜麥的高營養(yǎng)價值和功能特性已成為國內(nèi)外食品研究領(lǐng)域的熱點，隨著人們對藜麥研究不斷深入，關(guān)于藜麥生物活性的報道數(shù)量也日益增多。

多糖類化合物是構(gòu)成生命的四大基本物質(zhì)之一，廣泛存在于動植物細胞中，是由醛基和酮基通過糖苷鍵連接的高分子聚合物[6]。近年來，從植物中提取多糖已得到廣泛研究[7]，如莫曉寧等[8]關(guān)于枸杞多糖的提取研究，楊文麗等[9]對納豆多糖理化性質(zhì)的分析，HU等[10]關(guān)于川芎多糖的超聲提取、抗氧化及抗癌活性的研究等。對于藜麥多糖的報道也有少許，袁俊杰等[6]使用水浴加熱回流法提取藜麥種子多糖，通過單因素試驗與響應(yīng)面分析法對藜麥多糖的提取工藝進行優(yōu)化，得到藜麥多糖得率可達15.81 g/100g；徐瀾等[11]采用單一超聲輔助提取藜麥種子多糖，提取率為2 mg/g；李佳妮等[12]利用酶具有用量少而催化效率高的特點，采用超聲波法與酶法聯(lián)合法對藜麥種子多糖提取工藝進行了研究，經(jīng)酶法輔助超聲波法提取比單一采用超聲波法提取，多糖提取率增加1.5倍；HU等[13]從藜麥中分離出一種新的多糖（CQP），研究其對人肝癌SMMC 7721和乳腺癌MCF-7細胞的抗癌作用。本文主要采用水提取法、酶提取法、超聲波提取法3種方法，對紅、白、黑3種顏色藜麥米進行多糖提取，以藜麥多糖的提取率為考察指標(biāo)，初步選定最佳提取原料和方法；在此基礎(chǔ)上利用單因素和Box-Behnken試驗，確定藜麥多糖最優(yōu)提取工藝，以期為藜麥的綜合開發(fā)利用提供理論依據(jù)。

1 材料與設(shè)備

1.1 材料

藜麥（金昌西域神話食品有限公司）；纖維素酶（10 000 U/g，天津市諾奧科技發(fā)展有限公司）；葡萄糖、苯酚、硫酸、檸檬酸、檸檬酸鈉、氫氧化鈉、95%乙醇均為分析純。

1.2 試驗儀器

AX224ZH電子天平（美國奧豪斯）；HWS28型電熱恒溫水浴鍋（上海一恒科技儀器有限公司）；STARTER3100 pH計（美國奧豪斯）；KPB-V1358攪拌機（深圳市康佳電器有限公司）；LGR20-W高速冷凍離心機（北京京立離心機有限公司）；V-1200紫外可見分光光度計（上海滬粵明科學(xué)儀器有限公司）。

2 試驗方法

2.1 藜麥預(yù)處理

分別挑選顆粒飽滿的紅、白、黑色藜麥米，粉碎后過80目篩，密封備用。

2.2 水提取法提取藜麥多糖

取粉碎后的紅色、白色、黑色藜麥粉，按料液比1∶25 g/mL加去離子水，60 ℃條件下，水浴攪拌提取4 h，取樣品于3 620 g離心10 min得上清液和沉淀。取上清液，加入4倍體積的 95%乙醇，4 ℃靜置一夜，醇沉液3 620 g離心10 min，取沉淀溶于去離子水，利用苯酚-硫酸法測定多糖含量并計算藜麥多糖提取率。

2.3 纖維素酶提取法提取藜麥多糖

取粉碎后的紅、白、黑色藜麥粉，按料液比1∶25 g/mL的比例加入pH為4.5的0.05 moL/L檸檬 酸-檸檬酸鈉緩沖溶液，而后加入纖維素酶1 000 U/g（加酶量/藜麥干重），控制溫度60 ℃，水浴攪拌后提取90 min，用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至中性，隨后迅速提高溫度至85 ℃，水浴反應(yīng)2 h后于3 620 g離心10 min得上清液和沉淀。取上清液，加入4倍體積的95%乙醇，4 ℃靜置一夜，醇沉液3 620 g離心10 min，取沉淀溶于去離子水中，采用苯酚-硫酸法測定多糖含量并計算藜麥多糖提取率。

2.4 超聲波提取法提取藜麥多糖

取粉碎后的紅、白、黑色藜麥粉，按料液比1∶25 g/mL加去離子水，60 ℃條件下，超聲浸提40 min，3 620 g離心10 min得上清液和沉淀。取上清液，加入4倍體積的95%乙醇，4 ℃靜置一夜，醇沉液在3 620 g離心機中離心10 min，取沉淀，溶于去離子水中，利用苯酚-硫酸法測定多糖含量并計算藜麥多糖提取率。

2.5 白藜麥酶提取法單因素試驗

2.5.1 不同料液比對多糖提取率的影響

分別選擇1∶15、1∶25、1∶35、1∶45與 1∶55 g/mL料液比，加入pH為4.5的0.05 moL/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液，加入纖維素酶1 000 U/g，60 ℃水浴攪拌90 min后用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至中性，隨后迅速提高溫度至85 ℃，水浴反應(yīng) 2 h，3 620 g離心10 min得上清液。將離心后的上清液加入4倍體積的 95%乙醇中，4 ℃靜置過夜，醇沉樣品3 620 g離心10 min，取沉淀，溶解于去離子水，采用苯酚-硫酸法測定多糖含量并計算藜麥多糖提取率。

2.5.2 不同加酶量對多糖提取率的影響

按料液比1∶25 g/mL，加入pH為4.5的0.05 moL/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液，分別選擇酶活力為1 000、1 500、2 000、2 500、3 000 U/g的纖維素酶，60 ℃水浴攪拌90 min后用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至中性，隨后迅速提高溫度至85 ℃，水浴反應(yīng)2 h。提取計算步驟如2.5.1中所述。

2.5.3 不同浸提溫度對多糖提取率的影響

按料液比1∶25 g/mL，加入pH為4.5的0.05 moL/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液，加入纖維素酶 1 000 U/g，分別選擇浸提溫度為40、50、60、70、80 ℃，水浴攪拌90 min后用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至中性，隨后迅速提高溫度至85 ℃，水浴反應(yīng)2 h。提取計算步驟如2.5.1中所述。

2.5.4 不同提取時間對多糖提取率的影響

按料液比1∶25 g/mL，加入pH為4.5的0.05 moL/L檸檬酸-檸檬酸鈉緩沖溶液，加入纖維素酶 1 000 U/g，保溫60 ℃，水浴浸提時間分別為70、80、90、100、110 min，后用氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH至中性，隨后迅速提高溫度至85 ℃，水浴反應(yīng)2 h。提取計算步驟如2.5.1中所述。

2.6 Box-Behnken試驗設(shè)計

根據(jù)單因素試驗結(jié)果，利用Box-Behnken試驗設(shè)計對料液比、加酶量、提取溫度、浸提時間進行優(yōu)化，試驗設(shè)計見表1。

表1 Box-Behnken試驗設(shè)計表

2.7 藜麥多糖提取率的計算

3 結(jié)果與分析

3.1 不同提取方法對3種藜麥提取率的影響

根據(jù)提取方法的不同，由圖1可看出，對3種藜麥提取率最高的方法是酶提取法，其中白色藜麥酶提取法提取率最高，其次是紅色藜麥，最后是黑色藜麥；水提取法中3種藜麥提取率分別為，白色藜麥最高，其次是紅色藜麥，最后是黑色藜麥；在超聲提取法中，提取率為紅色藜麥＞黑色藜麥＞白色藜麥。因此在后續(xù)試驗中選擇白色藜麥作為提取原料，采用纖維素酶提取法進行多糖的提取并對其工藝條件進行優(yōu)化。

圖1 不同提取方法對3種藜麥提取率的影響

3.2 白藜麥酶提取法單因素試驗影響

3.2.1 不同料液比對白藜麥提取率的影響

如圖2所示，采用1∶35 g/mL為最佳提取料液比，當(dāng)料液比增加至1∶45 g/mL時，其多糖提取率顯著下降。這是因為在一定料液比范圍內(nèi)，增加提取溶劑使用量有利于多糖的溶出，提取率增加；但若繼續(xù)增加溶劑的體積，則相對減少底物濃度，酶促反應(yīng)速度降低，出現(xiàn)多糖提取率下降的趨勢[14]。

圖2 不同料液比對白藜麥提取率的影響

3.2.2 不同加酶量對白藜麥提取率的影響

由圖3可知，隨著加酶量的增高，酶與底物反應(yīng)更加充分，使得提取率呈增加趨勢，在2 500 U/g時達到最高，提取率為7.0%。但隨著加酶量進一步增加，濃度超過一定范圍，酶就成了抑制劑，對反應(yīng)有一定的抑制效果[12]。因此采用2 500 U/g為最佳加酶量。

圖3 不同加酶量對白藜麥提取率的影響

3.2.3 不同浸提溫度對白藜麥提取率的影響

如圖4所示，藜麥多糖提取率隨著溫度的升高，呈先升高后降低的趨勢，在溫度達70 ℃時最高，提取率為7.0%，其原因是溫度過高會抑制酶的活力，甚至?xí)斐擅甘Щ?，?dǎo)致提取率下降，因此選擇最佳提取溫度為70 ℃。

圖4 不同浸提溫度對白藜麥提取率的影響

3.2.4 不同提取時間對白藜麥提取率的影響

由圖5可知，隨著時間的增長，多糖提取率增高，當(dāng)時間達到90 min時，提取率最高，為6.5%，其原因應(yīng)該是多糖在固定時間段內(nèi)會逐步析出，在此時間段內(nèi)，多糖提取率會隨時間的延長而增加。但如果超出這個時間段，多糖析出速率會小于多糖降解速率，這時會表現(xiàn)為提取率的逐漸減少[15]。因此選擇90 min為最佳提取時間。

圖5 不同浸提時間對白藜麥提取率的影響

3.3 響應(yīng)面法優(yōu)化藜麥多糖提取工藝

3.3.1 Box-Behnken試驗設(shè)計

響應(yīng)面優(yōu)化法是通過一定的試驗設(shè)計考察自變量，即影響因素對效應(yīng)的作用并對其進行優(yōu)化的方法，常用的有星點設(shè)計法（central composite design，CCD）、Box-Behnken Design（BBD）法等。Box-Behnken設(shè)計是一種基于3水平2階的試驗設(shè)計方法，采用多元二次方程來擬合因素和響應(yīng)值之間的函數(shù)關(guān)系，通過對回歸方程的分析來尋求最優(yōu)工藝參數(shù)。該方法與CCD法相比，試驗次數(shù)較少、成本低、試驗精度高、且可彌補正交試驗無法找到整個區(qū)域內(nèi)因素最佳組合和最優(yōu)響應(yīng)值的缺陷、回歸方程預(yù)測性良好，是解決實際問題的有效手段[16]。因此，本文根據(jù)單因素試驗結(jié)果和Box-Behnken試驗設(shè)計原理，選取料液比（1）、加酶量（2）、溫度（3）、時間（4）4個因素對提取工藝進行優(yōu)化，試驗結(jié)果見表2。

表2 中心試驗設(shè)計及試驗結(jié)果

3.3.2 響應(yīng)面模型建立及方差分析

使用Design-Expert 8.0軟件進行二次響應(yīng)面回歸分析，得到下列多元二次響應(yīng)面回歸模型，回歸方程為：

＝127.452 08＋0.355 831－0.033 1672－4.398 333＋1.430 004－7.416 67×10-312＋9.000 00×10-612－3.000 000×10-312＋2.100 0×10-314－1.666 67×10-822＋4.400 00×10-423－5.000 00× 10-624＋0.026 83332－4.100 0×10-342

由回歸模型的方差分析（表3）可知，在本試驗中，模型＜0.01具有極顯著性，表明模型具有統(tǒng)計學(xué)意義；失擬因素值為0.388 7，不顯著，說明該模型與實際值情況擬合較好，誤差小。由表3可知自變量4具有顯著性（＜0.05），自變量1、23、12、32、42具有極顯著性（＜0.01）。進一步分析試驗結(jié)果，各因素對藜麥多糖得率的影響從大到小依次為：料液比1＞時間4＞溫度3＞加酶量2。

表3 回歸模型方差分析

注：*表示在＝0.05水平上顯著，* *表示在＝0.01水平上極顯著

為了更加直觀地表現(xiàn)出4個因素對藜麥多糖提取率的影響。繪制了對多糖提取率影響的2因素2水平響應(yīng)立體圖，如圖7-12所示。

圖7 料液比、加酶量對多糖提取率的影響

圖8 料液比、溫度對多糖提取率的影響

圖9 料液比、時間對多糖提取率的影響

圖10 溫度、加酶量對多糖提取率的影響

圖11 加酶量、時間對多糖提取率的影響

圖12 溫度、時間對多糖提取率的影響

經(jīng)Box-Benhnken試驗設(shè)計優(yōu)化后得到藜麥多糖最優(yōu)提取工藝條件為，料液比為1∶32 g/mL、加酶量為2 000 U/g、提取溫度為65 ℃，浸提時間為90 min，按照優(yōu)化后的條件試驗得到白藜麥多糖提取率為8.0%。

4 結(jié)論

本論文采用水提取法、酶提取法、超聲波提取法3種方法，以藜麥多糖提取率為考察指標(biāo)，分別對紅、白、黑3種顏色的藜麥進行多糖提取，通過試驗得出白色藜麥多糖提取率最高。在此基礎(chǔ)上，對白藜麥酶提取法進行料液比、加酶量、提取溫度、浸提時間的單因素試驗，結(jié)果表明，料液比為1∶35 g/mL、加酶量為2 500 U/g、提取溫度為70 ℃、浸提時間為90 min時，藜麥多糖提取率最高；進一步利用Box-Behnken試驗，確定白藜麥酶提取法的最優(yōu)工藝為料液比1∶32 g/mL、加酶量2 000 U/g、提取溫度65 ℃、浸提時間90 min，此時藜麥多糖提取率可達8.0%。

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Study on extraction process of quinoa polysaccharide by response surface methodogy

Guo Yi1, Yang Xuan1, Xiao Ping1,2,Corresponding Author

（1. College of Food Science and Bioengineering, Tianjin Agricultural University, Tianjin 300392, China; 2. Tianjin Engineering and Technology Research Center of Agricultural Products Processing, Tianjin 300392, China）

In this study, quinoa polysaccharide was extracted by water extraction method, cellulase extraction method and ultrasonic extraction method using the red color quinoa, white color quinoa and black color quinoa as materialwith the extraction rate of quinoa polysaccharide as an inspection index. The results showed that the highest extraction rate of polysaccharide was 6.8% with white quinoa through the enzyme extraction method, the red quinoa polysaccharide and black quinoa polysaccharide extraction rate were 6.4% and 5.9%, respectively. Furthermore, the single factor and Box-Behnken experiments were employed to optimize the cellulase extraction process for highest yield of white quinoa polysaccharides. The results suggested that the optimal extraction conditions were material-liquid ratio 1∶32 g/mL, the addition of cellulase 2 000 U/g, extraction temperature 65 ℃, and extraction time 90 min. Under the experiment conditions, the yield of polysaccharide was 8.0%.

quinoa; polysaccharide; cellulase enzyme extraction; Box-Behnken test

1008-5394（2020）04-0043-06

10.19640/j.cnki.jtau.2020.04.009

TS201.1

A

2019-09-12

郭怡（1996—），女，碩士在讀，主要從事功能多糖與腸道菌群研究。E-mail：1076348079@qq.com。

肖萍（1986—），女，講師，博士，主要從事功能多糖與腸道菌群研究。E-mail：xiaoping19860724@126.com。

責(zé)任編輯：張愛婷