2 084例急性呼吸道感染患兒鼻咽分泌物中百日咳鮑特菌核酸檢測(cè)分析

陳楠，潘蕊，方玉蓮，王維，侯夢(mèng)珠，林書祥

1天津市兒童醫(yī)院，天津300134；2天津市兒科研究所

百日咳是(Pertussis)由百日咳鮑特菌(B. pertussis)引起的具有高度傳染性的呼吸道疾病，在六個(gè)月以下的兒童中具有高度傳染性，其中三個(gè)月以下的嬰兒的百日咳住院率、出現(xiàn)并發(fā)癥和死亡的概率都是最高的。百日咳鮑特菌在疫苗接種出現(xiàn)之前，該疾病被普遍認(rèn)為是一種兒科疾病，因?yàn)閶雰汉蛢和乃劳雎始鞍l(fā)病率極高，但其實(shí)在孕婦和老年人人群中，出現(xiàn)可能危及生命的呼吸系統(tǒng)疾病的情況也非常嚴(yán)重，也需引起高度重視。盡管針對(duì)這種病原體的疫苗接種覆蓋率很高，但百日咳仍然是全球持續(xù)存在的公共衛(wèi)生問題，也是全世界疫苗可控性最差的疾病之一。近年，即使是在接種了全細(xì)胞或無(wú)細(xì)胞疫苗的國(guó)家，百日咳也已重新出現(xiàn)，且發(fā)病率逐年升高[1～3]。且百日咳的流行模式已從過去的兒童-兒童模式轉(zhuǎn)變?yōu)楝F(xiàn)在的青少年(成人)-兒童模式[4,5]，嬰幼兒的感染主要發(fā)生在家庭中(75%～80%)，父母和兄弟姐妹是最常見的感染源。目前核酸擴(kuò)增法如PCR是診斷百日咳非常敏感的方法，百日咳鮑特菌培養(yǎng)是常規(guī)的金標(biāo)準(zhǔn)方法，但實(shí)時(shí)PCR診斷百日咳所需時(shí)間更短，且靈敏度更高,需要鼻咽抽吸或拭子[6]。目前臨床尚未見百日咳鮑特菌IS481靶位進(jìn)行百日咳鮑特菌的核酸檢測(cè)報(bào)道。為此，我們?cè)O(shè)計(jì)了百日咳鮑特菌IS481靶位的特異性引物，檢測(cè)急性呼吸道感染患兒鼻咽分泌物百日咳鮑特菌的感染情況?，F(xiàn)報(bào)告如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 收集2017年7月～2019年6月間天津市兒童醫(yī)院收治入院的急性呼吸道感染患兒2 084例。2 084例患兒中男1 298例(62.3%)、女786例(37.7%)，男女比例為1.65∶1；年齡為57時(shí)～72月(10.21±10.19)月。其中≤1個(gè)月307例(14.7%)，1～6個(gè)月605例(29.0%)，6～12個(gè)月795例(38.1%)，12～24個(gè)月246例(11.8%)，24～36個(gè)月101例(4.8%)、36～48個(gè)月22例(1.1%)，48～60個(gè)月4例(0.2%)，>60個(gè)月4例(0.2%)；均有明顯呼吸道感染癥狀。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)同意，納入者家屬均知情同意并簽署知情同意書。

1.2 百日咳鮑特菌核酸檢測(cè)方法 在2 084例住院患兒的鼻炎分泌物標(biāo)本中吸取100 μL，按細(xì)菌總DNA提取試劑盒 (AXYGEN，美國(guó))操作說明書進(jìn)行DNA提取，操作過程嚴(yán)格按照說明書進(jìn)行。提取出的細(xì)菌總DNA在-20 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

運(yùn)用PCR方法對(duì)百日咳桿菌插入序列IS481基因片段(長(zhǎng)145 bp)進(jìn)行擴(kuò)增，根據(jù)文獻(xiàn)[7]合成引物序列Pertussis-IS481-P1 GATTCAATAGGTTGTAT-

GCATGGTT, Pertussis-IS481-P2 TGGACCATTTCGA-GTCGACG。每次PCR反應(yīng)均設(shè)立陰性、陽(yáng)性對(duì)照。

所有PCR擴(kuò)增反應(yīng)均在25 μL總反應(yīng)體系中進(jìn)行，5 μL模板，其他試劑參照試劑盒配制，用ddH2O補(bǔ)足。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性15 s，56 ℃退火15 s，72 ℃延伸15 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃延伸5 min。凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物：用1.5 %的瓊脂糖凝膠電泳對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行分析，選取瓊脂糖凝膠電泳鑒定結(jié)果陽(yáng)性的PCR產(chǎn)物，送至生工生物工程(上海)股份有限公司測(cè)序。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 20.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)數(shù)資料以例(%)表示，采用χ2檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較。P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2 084份鼻咽抽吸物標(biāo)本中百日咳鮑特菌陽(yáng)性率為2.21%(46/2 084)。46份陽(yáng)性樣本的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行比對(duì)分析，證明為百日咳鮑特菌。

46例百日咳鮑特菌陽(yáng)性的患兒中男22例、女24例，二者性別比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=4.186，P<0.05)。2 084份患兒鼻咽抽吸物標(biāo)本中百日咳鮑特菌陽(yáng)性檢出率分別為≤1個(gè)月2.0%(6/307)、1～6個(gè)月2.0%(12/605)、6～12個(gè)月2.3%(18/795)、12～24個(gè)月1.22%(3/246)、24～36個(gè)月1.98%(2/101)、36～48個(gè)月9.1%(2/22)、48～60個(gè)月50%(2/4)，>60個(gè)月25%(1/4)，各年齡段患兒中鼻咽抽吸物標(biāo)本中百日咳鮑特菌陽(yáng)性檢出率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=58.163，P<0.05)。

2 084例患兒中，春、夏、秋、冬季各530、502、506、546例，鼻咽抽吸物標(biāo)本中百日咳鮑特菌陽(yáng)性率分別為1.9%(10/530)、2.0%(10/502)、4.2%(21/506)、0.9%(5/546)。不同季節(jié)呼吸道百日咳鮑特菌陽(yáng)性檢出率間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2=13.428,P<0.05)。

3 討論

百日咳主要是由百日咳鮑特菌引起的一種傳染性極強(qiáng)的急性呼吸系統(tǒng)疾病，與5歲以下兒童咳嗽發(fā)作時(shí)間延長(zhǎng)和死亡有關(guān),以易感者吸入帶菌飛沫而被感染。與其他傳染病相比，百日咳是一種相對(duì)較新的感染性疾病[6]。

百日咳鮑特菌是一種可以引起百日咳或百日咳的呼吸道疾病的革蘭氏陰性短小桿菌，無(wú)鞭毛芽孢，專性需氧，最佳生長(zhǎng)溫度為35 ℃～37 ℃。百日咳鮑特菌最初是由Bordet和Gengou在1900年觀察到并在1906年成功分離的[8]。腺苷酸環(huán)化酶毒素(CyaA)是百日咳鮑特菌產(chǎn)生的主要毒力因子之一。CyaA在百日咳鮑特菌的呼吸道定植的早期階段起重要作用[9,10]。該毒素使用原始的中毒機(jī)制：一旦被有毒細(xì)菌分泌，它便能夠通過獨(dú)特但鮮為人知的機(jī)制侵入真核靶細(xì)胞，導(dǎo)致細(xì)胞死亡。細(xì)胞中毒過程涉及直接跨靶細(xì)胞質(zhì)膜的CyaA催化結(jié)構(gòu)域易位的獨(dú)特機(jī)制。據(jù)統(tǒng)計(jì)所有年齡組都易受百日咳感染，其感染對(duì)成人可能癥狀較輕微，但對(duì)嬰兒有可能危及生命。且在未接種疫苗的嬰兒中，該疾病更為嚴(yán)重，其中可能發(fā)生驚厥，支氣管肺炎和腦病等致命性并發(fā)癥。本次研究中，共收集急性呼吸道感染患兒鼻咽抽吸物標(biāo)本2 084份，使用百日咳鮑特菌IS481靶位的特異性引物進(jìn)行檢測(cè)。其中百日咳鮑特菌陽(yáng)性患兒46例，陽(yáng)性患兒中男女比例約為1∶1。在各年齡組中，以6～12個(gè)月組陽(yáng)性檢出例數(shù)最多，共18例，占全部陽(yáng)性患兒的39.1%(18/46)；其次是1～6個(gè)月共12例，占全部陽(yáng)性患兒的26.1%(12/46)；≤1個(gè)月6例，占全部陽(yáng)性患兒的13.0% (6/46)。在一年的研究時(shí)段中，春、夏、秋、冬季標(biāo)本中百日咳鮑特菌陽(yáng)性檢出率分別為1.9%(10/530)、2.0%(10/502)、4.2%(21/506)、0.9%(5/546)。本次研究中，患兒鼻咽抽吸物標(biāo)本百日咳鮑特菌陽(yáng)性檢出率在不同性別、年齡段、發(fā)病季節(jié)間的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

近年來(lái)，引起百日咳的百日咳鮑特菌在全球范圍內(nèi)重新成為一種重要的病原體。醫(yī)護(hù)人員以及公眾對(duì)這種疾病缺乏認(rèn)識(shí)和臨床表達(dá)的差異性是文獻(xiàn)報(bào)道[6]的可能導(dǎo)致百日咳再次流行的原因。醫(yī)護(hù)人員和公眾仍然認(rèn)為百日咳是僅會(huì)影響幼兒的疾病因而會(huì)導(dǎo)致它在成人患者中的診斷不足，因?yàn)樵诶夏昊颊咧胁豢紤]這種診斷。同時(shí)，由于該疾病的臨床表達(dá)在很大程度上取決于相關(guān)人群的免疫水平，所以嬰兒、兒童、青少年和成年人之間百日咳的臨床癥狀也有所不同，這也可能影響對(duì)該疾病的診斷和治療。因此，對(duì)百日咳的持續(xù)關(guān)注和研究工作也顯得尤為重要。另外，百日咳主要通過免疫接種控制，但盡管疫苗接種計(jì)劃導(dǎo)致兒童死亡率持續(xù)下降，百日咳仍在繼續(xù)流行[11]。效力明顯下降的原因包括隨著時(shí)間的推移，免疫力下降，以及可能從突變的百日咳鮑特菌中“疫苗逃逸”，這可能會(huì)使其避免疫苗相關(guān)的免疫反應(yīng)[12]。然而，疫苗接種仍然是最好的控制方法，因?yàn)榭股刂委焹H在疾病早期有效[13]。監(jiān)測(cè)目前流行的菌株對(duì)公眾的健康控制至關(guān)重要，既可以追蹤社區(qū)中百日咳鮑特菌的傳播，也可以為未來(lái)的疫苗開發(fā)提供急需的信息。

綜上所述，天津地區(qū)急性呼吸道感染患兒百日咳鮑特菌感染陽(yáng)性率較高。